Transfection, בחירה, ומושבת קטיף של תאי גזע האנושי המושרה pluripotent Talen-ממוקד עם גן GFP לSafe Harbor AAVS1
Summary
TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.
Abstract
Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral vector mediated random integration. This protocol describes a universal and efficient transgene targeted addition platform in human iPSCs based on utilization of validated open-source TALENs and a gene-trap-like donor to deliver transgenes into a safe harbor locus. Importantly, effective gene editing is rate-limited by the delivery efficiency of gene editing vectors. Therefore, this protocol first focuses on preparation of iPSCs for transfection to achieve high nuclear delivery efficiency. When iPSCs are dissociated into single cells using a gentle-cell dissociation reagent and transfected using an optimized program, >50% cells can be induced to take up the large gene editing vectors. Because the AAVS1 locus is located in the intron of an active gene (PPP1R12C), a splicing acceptor (SA)-linked puromycin resistant gene (PAC) was used to select targeted iPSCs while excluding random integration-only and untransfected cells. This strategy greatly increases the chance of obtaining targeted clones, and can be used in other active gene targeting experiments as well. Two weeks after puromycin selection at the dose adjusted for the specific iPSC line, clones are ready to be picked by manual dissection of large, isolated colonies into smaller pieces that are transferred to fresh medium in a smaller well for further expansion and genetic and functional screening. One can follow this protocol to readily obtain multiple GFP reporter iPSC lines that are useful for in vivo and in vitro imaging and cell isolation.
Introduction
היכולת לתכנת מחדש תאים סומטיים אנושיים לתאים כמו תאי גזע עוברי הנגרמים גזע pluripotent (iPSCs) התגלה לראשונה על ידי et al טקהאשי. בשנת 2007 1. Fibroblasts עורי אדם transduced עם רטרווירוסים להביע ארבעה גורמי שעתוק (יאמאנאקה מה שזכה לכינוי גורמי Oct3 / 4, Sox2, c-Myc, וKlf4) הוצג להיות דומה מאוד לתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) המבוססים על מורפולוגיה, הפצה, ביטוי גנים, ומעמד אפיגנטיים; באופן מכריע, iPSCs גם מסוגל להבדיל לתאים של כל שלוש השכבות הנבט 1. הקיבולת הפוטנציאלית ובידול השגשוג של iPSCs גורמת להם כלים מאוד אטרקטיביים; על ידי תכנות מחדש של תאים מחולים הסובלים ממחלות מסוימות, יכול לשמש גם כiPSCs מערכות במבחנה מודל מחלה וכמו הרפוי פוטנציאלי.
לצורך האחרון, כמה בעיות יש לטפל לפני את מלוא הפוטנציאל של iPSCsבסביבה קלינית יכול להתממש; הפוטנציאל הסרטני במבחנה של hESCs התרבותי וiPSCs, השימוש בנגזרי xenogenic במהלך תכנות מחדש ותחזוקת תא, והצורך לעקוב אחר תאים מושתלים in vivo כל המכשולים הקריטיים ליישום הקליני בתאי גזע pluripotent (נבדק על ידי et Hentze ב. 2). פתרון אידיאלי לצורך מעקב אחר תאים מובחנים לאחר ההשתלה יהיה כרוך סמן חזותי לגילוי שמתנגד השתקה ואת הגיוונים ללא תלות ביישום. ביטוי חזק ומתמשך של transgenes המשולב הוא הכי בקלות להשגה כאשר DNA אקסוגני מוחדר לוקוסים בטוח נמל; כלומר, אתרים הגנומי המאפשרים שעתוק מספק של וקטור משולב ובו בזמן מיתון הפרעות ביטוי בגנים 3 שכנים. אתר אחד כזה שהתאפיין גם מאוד מאז גילויו הוא integr וירוס adeno הקשוריםאתר ation 1 (AAVS1), באינטרון הראשון של 1 12C מקטע הרגולציה גן phosphatase החלבון (PPP1R12C). מוקד זה הוכח לא רק כדי לאפשר ספג וביטוי חזק של transgenes המשולב בזמן הוארך בתרבות ובבידול המבחנה 3, אלא גם כדי להגן מקיפים גנים מהפרעות תעתיק 4; שני התכונות נחשבות בשל נוכחותם של אלמנטים המבודדים הכרומטין אנדוגני איגוף אתר AAVS1 5.
התקדמות בכלים הנדסי הגנום מעל רק בעשור האחרון הקלה באופן משמעותי את קלות ויעילות שבה ניתן להשיג מניפולציות גנטיות בכל סוג תא. בעוד ניסויים מוצלחים מוקדמים הסתמכו על רמות נמוכות ביותר של רקומבינציה אנדוגני ההומולוגית (HR) עם תורם הציג להשיג גן המיקוד בESCs 6,7, השימוש בnucleases אתר ספציפי, כגון nucleases אצבע אבץ (ZFNs), שsignificantly לגרום רקומבינציה ההומולוגית באמצעות הדור של הפסקת פעמיים תקועים DNA גדל היעילות של ניסויים כאלה 8,9 מאוד. Repurposing של שתי effectors כמו activator-השעתוק (הסיפורים) של סוגי Xanthomonas פתוגניים צמח וחוזר פרוקריוטים התקבץ interspaced באופן קבוע הקצר palindromic / מערכת Cas9 לnucleases מעצב אתר ספציפי יעיל (CRISPR) הפך גן מיקוד בתאי גזע pluripotent ונגיש מתודולוגיה מעשית 10-13.
מאמר האחרון שתואר שיטה יעילה לשילוב היציב של קלטת כתב ניאון ירוקה למוקד בטוח נמל AAVS1 בiPSCs האנושי באמצעות nucleases TALE (TALENs) 14. iPSCs הממוקד אלו שומרים על הקרינה שלהם גם לאחר התמיינות מכוונת לשריר לב והשתלה לתוך מודל עכבר של אוטם שריר לב (MI), מתן ראיות חזקות לשירות כזהיציבות בתאי גזע pluripotent ניאון 14. כדי להשיג מושבות ממוקדות, שיטת גן-מלכודת שימשה בי שחבור-acceptor (SA), רצף הפפטיד ביקוע עצמי 2A מציב את puromycin N-אצטיל-transferase הגן (PAC) תחת השליטה של אמרגן PPP1R12C אנדוגני; כך, רק iPSCs ששלב תורם DNA במוקד AAVS1 להביע PAC, טיוח אותם לבחירה המבוסס על puromycin התנגדות; (איור 1, 15). פרוטוקול זה מפרט את הנהלים של יצירת AAVS1-GFP iPSCs דיווח בעיתון האחרון 14, כולל התהליך של transfecting iPSCs עם TALENs ותורם 9.8 kb לשלב קטע DNA 4.2kb למוקד AAVS1 בטוח-הנמל, בחירת iPSCs המבוססים על puromycin-התנגדות, ומושבות קטיף להרחבה משובט. הטכניקות המתוארות במסמך זה יכול להיות מיושם על ניסויי הנדסה גנטית רבים.
Protocol
Representative Results
Discussion
השלבים הקריטיים ביותר עבור הדור המוצלח של נמל בטוח AAVS1 ממוקד iPSCs האנושי: (1) ביעילות מספק פלסמידים Talen ותורם לiPSCs ידי transfection; (2) אופטימיזציה של הניתוק של iPSCs לתוך תאים בודדים לפני transfection וציפוי צפיפות לאחר transfection; (3) אופטימיזציה של מינון וזמן של סמים-בחירה מבוססת על הצמיח?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the NIH Common Fund and Intramural Research Program of the National Institute of Arthritis, Musculoskeletal, and Skin Diseases.
Materials
| NAME OF MATERIAL/EQUIPMENT | COMPANY | CATALOG # | COMMENTS/DESCRIPTION |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-Free, 10mL | Corning | 354230 | Store at -20°C. |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320-033 | Store at 4°C. |
| Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Corning | 3506 | |
| Essential 8 Medium | Life Technologies | A1517001 | Store basal medium at 4°C. Store supplement at -20°C. |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | Store at room temp. Once dissolved in H2O, store at -20°C. |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886-500G | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575-020 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-250 | |
| 100mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
| DR4 MEF 2M IRR – Academic | GlobalStem | GSC-6204G | Store in liquid Nitrogen. |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995-040 | Store at 4°C. |
| Defined Fetal Bovine Serum, US Origin | HyClone | SH30070.03 | Store at -20°C. Thaw at 4°C overnight and aliquot. Store aliquots at -20°C until needed. |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140-050 | Store at 4°C. |
| 4D-Nucleofector Core unit | Lonza | AAF-1001B | part of the electroporation system |
| 4D-Nucleofector X unit | Lonza | AAF-1001X | part of the electroporation system |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT) | Lonza | V4XP-3024 | Upon arrival, remove Primary Cell Solution and supplement and store at 4°C. |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A1110501 | Store at -20°C. Thaw overnight at 4°C and warm an aliquot in a 37°C water bath before use. |
| NutriStem XF/FF Culture Medium | Stemgent | 01-0005 | Store at -20°C. Thaw overnight at 4°C |
| AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 and pZT-AAVS1-R1) | Addgene | 52637 and 52638 | |
| AAVS1-CAG-EGFP Homologous Recombination donor | Addgene | 22212 | |
| Puromycin Dihydrochloride | Life Technologies | A11138-03 | Store at -20°C. Prepare working aliquots of 1 mg/mL in ddH2O. |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Sorvall Legend XTR (Refrigerated), 120V 60Hz | Thermo Scientific | 75-004-521 | |
| TX-750 4 × 750mL Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientific | 75003607 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Hentze, H., Graichen, R., Colman, A. Cell therapy and the safety of embryonic stem cell-derived grafts. Trends Biotechnol. 25 (1), 24-32 (2007).
- Smith, J. R., et al. Robust, persistent transgene expression in human embryonic stem cells is achieved with AAVS1-targeted integration. Stem Cells. 26 (2), 496-504 (2008).
- Lombardo, A., et al. Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer. Nat Methods. 8 (10), 861-869 (2011).
- Ogata, T., Kozuka, T., Kanda, T. Identification of an insulator in AAVS1, a preferred region for integration of adeno-associated virus DNA. J Virol. 77 (16), 9000-9007 (2003).
- Zwaka, T. P., Thomson, J. A. Homologous recombination in human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 21 (3), 319-321 (2003).
- Urbach, A., Schuldiner, M., Benvenisty, N. Modeling for Lesch-Nyhan disease by gene targeting in human embryonic stem cells. Stem Cells. 22 (4), 635-641 (2004).
- Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases. Nature biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).
- Zou, J., et al. Gene targeting of a disease-related gene in human induced pluripotent stem and embryonic stem cells. Cell stem cell. 5 (1), 97-110 (2009).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature. 29 (8), 731-734 (2011).
- Sanjana, N. E., et al. A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering. Nature protocols. 7 (1), 171-192 (2012).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell stem cell. 12 (4), 393-394 (2013).
- Luo, Y., et al. Stable Enhanced Green Fluorescent Protein Expression After Differentiation and Transplantation of Reporter Human. Induced Pluripotent Stem Cells Generated by AAVS1 Transcription Activator-Like Effector Nucleases. Stem Cells Transl Med. 3 (7), 821-835 (2014).
- Zou, J., et al. Oxidase-deficient neutrophils from X-linked chronic granulomatous disease iPS cells: functional correction by zinc finger nuclease-mediated safe harbor targeting. Blood. 117 (21), 5561-5572 (2011).
- Luo, Y., Rao, M., Zou, J. Generation of GFP Reporter Human Induced Pluripotent Stem Cells Using AAVS1 Safe Harbor Transcription Activator-Like Effector Nuclease. Curr Protoc Stem Cell Biol. 29, 5A.7.1-5A.7.18 (2014).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7, 2029-2040 (2012).
