Трансфекцию, Селекция, и колонии-сбор человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток Тален ориентированные с GFP гена в AAVS1 Safe Harbor
Summary
TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.
Abstract
Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral vector mediated random integration. This protocol describes a universal and efficient transgene targeted addition platform in human iPSCs based on utilization of validated open-source TALENs and a gene-trap-like donor to deliver transgenes into a safe harbor locus. Importantly, effective gene editing is rate-limited by the delivery efficiency of gene editing vectors. Therefore, this protocol first focuses on preparation of iPSCs for transfection to achieve high nuclear delivery efficiency. When iPSCs are dissociated into single cells using a gentle-cell dissociation reagent and transfected using an optimized program, >50% cells can be induced to take up the large gene editing vectors. Because the AAVS1 locus is located in the intron of an active gene (PPP1R12C), a splicing acceptor (SA)-linked puromycin resistant gene (PAC) was used to select targeted iPSCs while excluding random integration-only and untransfected cells. This strategy greatly increases the chance of obtaining targeted clones, and can be used in other active gene targeting experiments as well. Two weeks after puromycin selection at the dose adjusted for the specific iPSC line, clones are ready to be picked by manual dissection of large, isolated colonies into smaller pieces that are transferred to fresh medium in a smaller well for further expansion and genetic and functional screening. One can follow this protocol to readily obtain multiple GFP reporter iPSC lines that are useful for in vivo and in vitro imaging and cell isolation.
Introduction
Возможность перепрограммирования соматических клеток человека в клеточных как индуцированных плюрипотентных стволовых клеток эмбриональных стволовых (ИПСК) был впервые обнаружен Такахаши и др. В 2007 1. Фибробласты человека кожные трансдуцированные ретровирусы выражения четыре фактора транскрипции (так окрестили Яманака факторы Oct3 / 4, Sox2, с-Мус и Klf4) было показано, что очень похожи на человеческие эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) на основе морфологии, пролиферации, экспрессии генов и эпигенетическом статуса; важно, иПСК также способны дифференцироваться в клетки всех трех зародышевых листков 1. Пролиферативный потенциал и дифференциация мощность ИПСК делает их очень привлекательными инструментами; перепрограммирования клетки от пациентов, страдающих от конкретных заболеваний, иПСК могут быть использованы как в качестве ин витро модели болезни систем и в качестве потенциальных терапевтических.
Для последней цели, некоторые вопросы должны быть решены до полного потенциала ИПСКв клинической практике может быть реализован; онкогенными потенциал в пробирке, культивируемых ЭСК и ИПСК, использование ксеногенным производных во время перепрограммирования и обслуживания клетки, и необходимость отслеживать пересаженных клеток в естественных условиях все важные препятствия для клинического применения плюрипотентных стволовых клеток (обзор Hentze соавторами. 2). Идеальное решение о необходимости отслеживания дифференцированных клеток после трансплантации будет включать визуально обнаруживаемый маркер, который устойчив к звукоизоляции, а также пестрота, независимо от приложения. Прочная и устойчивая выражение интегрированных генов являются наиболее легко достижимо, когда экзогенная ДНК вводят в безопасной гавани локусов; то есть, геномные сайты, которые позволяют достаточно транскрипцию интегрированного вектора и в то же время, смягчающего возмущения выражения в соседних генов 3. Один из таких сайтов, который был очень хорошо характеризует с момента его открытия в том, аденоассоциированный вирус Integrвания сайт 1 (AAVS1), в первом интроне белка фосфатазы 1 регуляторная субъединица 12С (PPP1R12C) гена. Этот локус, как было показано не только позволяют поддерживать и надежный выражение комплексных трансгенов с помощью расширенного времени в культуре и в пробирке дифференциации 3, но также и для защиты окружающей гены транскрипции возмущения 4; обе функции, как считается, из-за присутствия эндогенных хроматина элементов диэлектрик, фланкирующих AAVS1 сайт 5.
Достижения в геном технических средств Только за последнее десятилетие значительно облегчило легкость и эффективность, с которой генетические манипуляции в любой тип клеток может быть достигнута. В то время как ранние успешные эксперименты опиралась на чрезвычайно низкие уровни эндогенного гомологичной рекомбинации (HR) с введенной донора для достижения ген ориентации в ESCs 6,7, использование конкретных участков нуклеаз, таких как цинковый палец нуклеаз (ZFNs), которые СИГВВПficantly вызвать гомологичной рекомбинации через поколения перерыва двухцепочечной ДНК значительно повысило эффективность таких экспериментов 8,9. Повторное использование обоих транскрипционных активаторов, как эффекторов (сказок) растительного патогенного Ксанфомонас родов и прокариотических кластерные регулярно interspaced короткие палиндромные повторов (CRISPR) / Cas9 система в эффективные дизайнерские нуклеаз сайт-специфических сделал генного таргетинга в плюрипотентных стволовых клеток доступны и практически методология 10-13.
Недавняя статья описано эффективный способ для стабильной интеграции зеленого флуоресцентного репортера кассеты в AAVS1 безопасной гавани локуса человека ИПСК с помощью Сказка нуклеазы (Таленс) 14. Эти целевые иПСК сохранили свою флуоресценцию даже после направленной дифференцировки в кардиомиоциты и трансплантации в мышиной модели инфаркта миокарда (ИМ), обеспечивая убедительные доказательства полезности такихстабильно люминесцентные плюрипотентные стволовые клетки 14. Чтобы получить целевые колонии, метод гена-ловушка была использована в котором сплайсинга-акцептор (SA), 2А саморасщепляющиеся пептидную последовательность помещает пуромицин N-ацетил-трансферазы (PAC), ген под контролем эндогенного промотора PPP1R12C; Таким образом, только иПСК, которые включили донора ДНК в локусе AAVS1 выразить PAC, делая их доступными для на основе пуромицину сопротивления; (Рисунок 1, 15). Подробнее Этот протокол процедуры генерации AAVS1-GFP иПСК сообщили в недавней работе 14, в том числе процесс трансфекции ИПСК с Talens и 9,8 кб донора интеграции фрагмент 4.2kb ДНК в AAVS1 безопасной гавани локуса, выбрав ИПСК на основе пуромицину сопротивление, и сбор колонии для клональной экспансии. Методики, описанные в данном документе, могут быть применены ко многим генома инженерных экспериментов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наиболее важные шаги для успешного поколения AAVS1 безопасной гавани нацелены человека иПСК являются: (1) эффективной доставки Тален и донорские плазмиды в ИПСК с помощью трансфекции; (2) оптимизация диссоциации ИПСК в одиночные клетки до трансфекции и покрытия плотностью после трансфекц…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the NIH Common Fund and Intramural Research Program of the National Institute of Arthritis, Musculoskeletal, and Skin Diseases.
Materials
| NAME OF MATERIAL/EQUIPMENT | COMPANY | CATALOG # | COMMENTS/DESCRIPTION |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-Free, 10mL | Corning | 354230 | Store at -20°C. |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320-033 | Store at 4°C. |
| Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Corning | 3506 | |
| Essential 8 Medium | Life Technologies | A1517001 | Store basal medium at 4°C. Store supplement at -20°C. |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | Store at room temp. Once dissolved in H2O, store at -20°C. |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886-500G | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575-020 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-250 | |
| 100mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
| DR4 MEF 2M IRR – Academic | GlobalStem | GSC-6204G | Store in liquid Nitrogen. |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995-040 | Store at 4°C. |
| Defined Fetal Bovine Serum, US Origin | HyClone | SH30070.03 | Store at -20°C. Thaw at 4°C overnight and aliquot. Store aliquots at -20°C until needed. |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140-050 | Store at 4°C. |
| 4D-Nucleofector Core unit | Lonza | AAF-1001B | part of the electroporation system |
| 4D-Nucleofector X unit | Lonza | AAF-1001X | part of the electroporation system |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT) | Lonza | V4XP-3024 | Upon arrival, remove Primary Cell Solution and supplement and store at 4°C. |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A1110501 | Store at -20°C. Thaw overnight at 4°C and warm an aliquot in a 37°C water bath before use. |
| NutriStem XF/FF Culture Medium | Stemgent | 01-0005 | Store at -20°C. Thaw overnight at 4°C |
| AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 and pZT-AAVS1-R1) | Addgene | 52637 and 52638 | |
| AAVS1-CAG-EGFP Homologous Recombination donor | Addgene | 22212 | |
| Puromycin Dihydrochloride | Life Technologies | A11138-03 | Store at -20°C. Prepare working aliquots of 1 mg/mL in ddH2O. |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Sorvall Legend XTR (Refrigerated), 120V 60Hz | Thermo Scientific | 75-004-521 | |
| TX-750 4 × 750mL Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientific | 75003607 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Hentze, H., Graichen, R., Colman, A. Cell therapy and the safety of embryonic stem cell-derived grafts. Trends Biotechnol. 25 (1), 24-32 (2007).
- Smith, J. R., et al. Robust, persistent transgene expression in human embryonic stem cells is achieved with AAVS1-targeted integration. Stem Cells. 26 (2), 496-504 (2008).
- Lombardo, A., et al. Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer. Nat Methods. 8 (10), 861-869 (2011).
- Ogata, T., Kozuka, T., Kanda, T. Identification of an insulator in AAVS1, a preferred region for integration of adeno-associated virus DNA. J Virol. 77 (16), 9000-9007 (2003).
- Zwaka, T. P., Thomson, J. A. Homologous recombination in human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 21 (3), 319-321 (2003).
- Urbach, A., Schuldiner, M., Benvenisty, N. Modeling for Lesch-Nyhan disease by gene targeting in human embryonic stem cells. Stem Cells. 22 (4), 635-641 (2004).
- Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases. Nature biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).
- Zou, J., et al. Gene targeting of a disease-related gene in human induced pluripotent stem and embryonic stem cells. Cell stem cell. 5 (1), 97-110 (2009).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature. 29 (8), 731-734 (2011).
- Sanjana, N. E., et al. A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering. Nature protocols. 7 (1), 171-192 (2012).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell stem cell. 12 (4), 393-394 (2013).
- Luo, Y., et al. Stable Enhanced Green Fluorescent Protein Expression After Differentiation and Transplantation of Reporter Human. Induced Pluripotent Stem Cells Generated by AAVS1 Transcription Activator-Like Effector Nucleases. Stem Cells Transl Med. 3 (7), 821-835 (2014).
- Zou, J., et al. Oxidase-deficient neutrophils from X-linked chronic granulomatous disease iPS cells: functional correction by zinc finger nuclease-mediated safe harbor targeting. Blood. 117 (21), 5561-5572 (2011).
- Luo, Y., Rao, M., Zou, J. Generation of GFP Reporter Human Induced Pluripotent Stem Cells Using AAVS1 Safe Harbor Transcription Activator-Like Effector Nuclease. Curr Protoc Stem Cell Biol. 29, 5A.7.1-5A.7.18 (2014).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7, 2029-2040 (2012).
