ترنسفكأيشن، اختيار، ومستعمرة قطف من صنع الإنسان المحفزة الخلايا الجذعية TALEN المستهدفة مع جين GFP في AAVS1 الملاذ الآمن
Summary
TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.
Abstract
Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral vector mediated random integration. This protocol describes a universal and efficient transgene targeted addition platform in human iPSCs based on utilization of validated open-source TALENs and a gene-trap-like donor to deliver transgenes into a safe harbor locus. Importantly, effective gene editing is rate-limited by the delivery efficiency of gene editing vectors. Therefore, this protocol first focuses on preparation of iPSCs for transfection to achieve high nuclear delivery efficiency. When iPSCs are dissociated into single cells using a gentle-cell dissociation reagent and transfected using an optimized program, >50% cells can be induced to take up the large gene editing vectors. Because the AAVS1 locus is located in the intron of an active gene (PPP1R12C), a splicing acceptor (SA)-linked puromycin resistant gene (PAC) was used to select targeted iPSCs while excluding random integration-only and untransfected cells. This strategy greatly increases the chance of obtaining targeted clones, and can be used in other active gene targeting experiments as well. Two weeks after puromycin selection at the dose adjusted for the specific iPSC line, clones are ready to be picked by manual dissection of large, isolated colonies into smaller pieces that are transferred to fresh medium in a smaller well for further expansion and genetic and functional screening. One can follow this protocol to readily obtain multiple GFP reporter iPSC lines that are useful for in vivo and in vitro imaging and cell isolation.
Introduction
اكتشفت القدرة على إعادة برمجة الخلايا الجسدية الإنسان في الجذعية الجنينية التي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة تشبه الخلايا (iPSCs) أول من تاكاهاشي آخرون في عام 2007 1. الليفية الجلدية الإنسان transduced مع الفيروسات القهقرية معربا عن أربعة عوامل النسخ (وياماناكا ذلك يطلق عليها اسم العوامل Oct3 / 4، Sox2، عرضت ج. Myc على، وKlf4) لتكون مشابهة إلى حد كبير للخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) على أساس التشكل، والانتشار، والتعبير الجيني، وحالة جينية. بشكل حاسم، iPSCs هي أيضا قادرة على التفريق في الخلايا من جميع الطبقات الجرثومية الثلاث 1. القدرة التكاثري المحتملة والتفريق بين iPSCs يجعلها أدوات جذابة للغاية. عن طريق إعادة برمجة الخلايا من المرضى الذين يعانون من أمراض معينة، يمكن استخدام iPSCs على حد سواء كما نظم في المختبر نموذج المرض والعلاجات كما المحتملة.
لغرض الأخير، يجب أن تعالج العديد من القضايا قبل الإمكانات الكاملة للiPSCsفي عملية إعداد سريرية يمكن أن تتحقق. إمكانيات مكون للأورام في المختبر hESCs مثقف وiPSCs، واستخدام المشتقات xenogenic خلال إعادة برمجة وصيانة الخلايا، والحاجة لتتبع الخلايا المزروعة في الجسم الحي كلها عقبات حاسمة إلى التطبيق السريري من الخلايا الجذعية المحفزة (التعليق بواسطة Hentze آخرون في. 2). سيكون حلا مثاليا للحاجة لتتبع خلايا متمايزة في مرحلة ما بعد زرع ينطوي على علامة للكشف بصريا أن يقاوم إسكات وتلون بغض النظر عن التطبيق. التعبير القوي والمستدام من الجينات المحورة المتكاملة هو الأكثر بسهولة يمكن تحقيقه عندما يتم إدخال الحمض النووي الخارجية إلى ميناء آمن مواضع. وهذا هو، مواقع الجينومية التي تمكن النسخ كاف من متجه متكامل، وفي الوقت نفسه تخفيف الاضطرابات التعبير في الجينات المجاورة 3. واحد موقع من هذه المواقع التي تميزت بشكل جيد جدا منذ اكتشافه هو integr فيروس الغدة المرتبطةالموقع أوجه 1 (AAVS1)، في إنترون الأول من بروتين الفوسفاتيز 1 التنظيمي فرعية 12C (PPP1R12C) الجين. وقد تبين هذا الموضع ليس فقط أن يسمح لحقت والتعبير القوي من الجينات المحورة المتكاملة من خلال تمديد الوقت في الثقافة والتمايز في المختبر 3، ولكن أيضا لحماية المحيطة الجينات من اضطراب النسخي 4؛ ويعتقد أن كل من الميزات أن ذلك يعود إلى وجود عناصر داخلية عازل لونين المرافقة الموقع AAVS1 5.
التقدم في الأدوات الهندسية الجينوم ما يزيد قليلا على مدى العقد الماضي قد سهلت كثيرا من السهولة والكفاءة التي يمكن تحقيقها التلاعب الجيني في أي نوع من الخلايا. بينما اعتمدت التجارب الناجحة الأولى على مستويات منخفضة جدا من إعادة التركيب مثلي الذاتية (HR) مع الجهات المانحة التي أدخلت على تحقيق استهداف الجينات في المجالس الاقتصادية والاجتماعية 6،7، واستخدام nucleases في مواقع محددة، مثل nucleases إصبع الزنك (ZFNs)، أن significantly لحث على إعادة التركيب مثلي من خلال توليد استراحة DNA المزدوج تقطعت بهم السبل وزيادة كبيرة في كفاءة مثل هذه التجارب 8،9. جعلت تطويعها لأغراض أخرى كل النسخ مثل المنشط المستجيبات (حكايات) من النباتات المسببة للأمراض زانثوموناس جنسا وبدائية النواة تتجمع interspaced بانتظام يكرر المتناوب قصيرة (كريسبر) / نظام Cas9 إلى كفاءة مصمم nucleases في مواقع محددة استهداف الجينات في الخلايا الجذعية المحفزة على الوصول إليها و منهجية العملية 10-13.
ووصفت ورقة الأخيرة وسيلة فعالة لتحقيق التكامل مستقر من الأخضر الفلورسنت مراسل الكاسيت في AAVS1 آمن الميناء مكان في iPSCs الإنسان باستخدام nucleases حكاية (TALENs) 14. حافظت هذه iPSCs استهدفت مضان حتى بعد التمايز الموجهة إلى العضلية وزرع في نموذج الفأر من احتشاء عضلة القلب (MI)، وتوفير أدلة قوية لفائدة مثلثابت المحفزة الفلورسنت الخلايا الجذعية 14. للحصول على المستعمرات المستهدفة، تم استخدام طريقة الجينات فخ فيه على الربط-متقبل (SA)، 2A-الشق الذاتي تسلسل الببتيد يضع بوروميسين N-أسيتيل ترانسفيراز (PAC) الجينات تحت سيطرة PPP1R12C المروج الذاتية. وبالتالي، iPSCs فقط التي أدرجت المتبرع DNA في موضع AAVS1 تعبر عن PAC، مما يجعلها اختيار على أساس بوروميسين المقاومة. (الشكل 1، 15). تفاصيل هذا البروتوكول إجراءات لتوليد AAVS1-GFP iPSCs ذكرت في الورقة الأخيرة 14، بما في ذلك عملية transfecting iPSCs مع TALENs والجهات المانحة 9.8 كيلوبايت لدمج جزء DNA 4.2kb في موضع AAVS1 آمن الميناء، واختيار iPSCs على أساس بوروميسين المقاومة، واختيار المستعمرات للتوسع نسيلي. التقنيات الموضحة في هذه الوثيقة يمكن تطبيقها على العديد من التجارب الهندسة الجينوم.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوات الأكثر أهمية للجيل ناجح من AAVS1 آمن الميناء استهدفت iPSCs الإنسان هي: (1) يعطي كفاءة TALEN والجهات المانحة البلازميدات إلى iPSCs من قبل ترنسفكأيشن. (2) تحسين تفكك iPSCs إلى خلايا واحدة قبل ترنسفكأيشن والطلاء كثافة بعد ترنسفكأيشن. (3) تحسين الجرعة ووقت المخدرات الاختيار على ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the NIH Common Fund and Intramural Research Program of the National Institute of Arthritis, Musculoskeletal, and Skin Diseases.
Materials
| NAME OF MATERIAL/EQUIPMENT | COMPANY | CATALOG # | COMMENTS/DESCRIPTION |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-Free, 10mL | Corning | 354230 | Store at -20°C. |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320-033 | Store at 4°C. |
| Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Corning | 3506 | |
| Essential 8 Medium | Life Technologies | A1517001 | Store basal medium at 4°C. Store supplement at -20°C. |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | Store at room temp. Once dissolved in H2O, store at -20°C. |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886-500G | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575-020 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-250 | |
| 100mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
| DR4 MEF 2M IRR – Academic | GlobalStem | GSC-6204G | Store in liquid Nitrogen. |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995-040 | Store at 4°C. |
| Defined Fetal Bovine Serum, US Origin | HyClone | SH30070.03 | Store at -20°C. Thaw at 4°C overnight and aliquot. Store aliquots at -20°C until needed. |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140-050 | Store at 4°C. |
| 4D-Nucleofector Core unit | Lonza | AAF-1001B | part of the electroporation system |
| 4D-Nucleofector X unit | Lonza | AAF-1001X | part of the electroporation system |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT) | Lonza | V4XP-3024 | Upon arrival, remove Primary Cell Solution and supplement and store at 4°C. |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A1110501 | Store at -20°C. Thaw overnight at 4°C and warm an aliquot in a 37°C water bath before use. |
| NutriStem XF/FF Culture Medium | Stemgent | 01-0005 | Store at -20°C. Thaw overnight at 4°C |
| AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 and pZT-AAVS1-R1) | Addgene | 52637 and 52638 | |
| AAVS1-CAG-EGFP Homologous Recombination donor | Addgene | 22212 | |
| Puromycin Dihydrochloride | Life Technologies | A11138-03 | Store at -20°C. Prepare working aliquots of 1 mg/mL in ddH2O. |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Sorvall Legend XTR (Refrigerated), 120V 60Hz | Thermo Scientific | 75-004-521 | |
| TX-750 4 × 750mL Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientific | 75003607 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Hentze, H., Graichen, R., Colman, A. Cell therapy and the safety of embryonic stem cell-derived grafts. Trends Biotechnol. 25 (1), 24-32 (2007).
- Smith, J. R., et al. Robust, persistent transgene expression in human embryonic stem cells is achieved with AAVS1-targeted integration. Stem Cells. 26 (2), 496-504 (2008).
- Lombardo, A., et al. Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer. Nat Methods. 8 (10), 861-869 (2011).
- Ogata, T., Kozuka, T., Kanda, T. Identification of an insulator in AAVS1, a preferred region for integration of adeno-associated virus DNA. J Virol. 77 (16), 9000-9007 (2003).
- Zwaka, T. P., Thomson, J. A. Homologous recombination in human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 21 (3), 319-321 (2003).
- Urbach, A., Schuldiner, M., Benvenisty, N. Modeling for Lesch-Nyhan disease by gene targeting in human embryonic stem cells. Stem Cells. 22 (4), 635-641 (2004).
- Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases. Nature biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).
- Zou, J., et al. Gene targeting of a disease-related gene in human induced pluripotent stem and embryonic stem cells. Cell stem cell. 5 (1), 97-110 (2009).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature. 29 (8), 731-734 (2011).
- Sanjana, N. E., et al. A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering. Nature protocols. 7 (1), 171-192 (2012).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell stem cell. 12 (4), 393-394 (2013).
- Luo, Y., et al. Stable Enhanced Green Fluorescent Protein Expression After Differentiation and Transplantation of Reporter Human. Induced Pluripotent Stem Cells Generated by AAVS1 Transcription Activator-Like Effector Nucleases. Stem Cells Transl Med. 3 (7), 821-835 (2014).
- Zou, J., et al. Oxidase-deficient neutrophils from X-linked chronic granulomatous disease iPS cells: functional correction by zinc finger nuclease-mediated safe harbor targeting. Blood. 117 (21), 5561-5572 (2011).
- Luo, Y., Rao, M., Zou, J. Generation of GFP Reporter Human Induced Pluripotent Stem Cells Using AAVS1 Safe Harbor Transcription Activator-Like Effector Nuclease. Curr Protoc Stem Cell Biol. 29, 5A.7.1-5A.7.18 (2014).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7, 2029-2040 (2012).
