トランスフェクション、選択、およびAAVS1セーフハーバーへのGFP遺伝子とTALENを標的とする人間の人工多能性幹細胞のコロニーピッキング
Summary
TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.
Abstract
Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral vector mediated random integration. This protocol describes a universal and efficient transgene targeted addition platform in human iPSCs based on utilization of validated open-source TALENs and a gene-trap-like donor to deliver transgenes into a safe harbor locus. Importantly, effective gene editing is rate-limited by the delivery efficiency of gene editing vectors. Therefore, this protocol first focuses on preparation of iPSCs for transfection to achieve high nuclear delivery efficiency. When iPSCs are dissociated into single cells using a gentle-cell dissociation reagent and transfected using an optimized program, >50% cells can be induced to take up the large gene editing vectors. Because the AAVS1 locus is located in the intron of an active gene (PPP1R12C), a splicing acceptor (SA)-linked puromycin resistant gene (PAC) was used to select targeted iPSCs while excluding random integration-only and untransfected cells. This strategy greatly increases the chance of obtaining targeted clones, and can be used in other active gene targeting experiments as well. Two weeks after puromycin selection at the dose adjusted for the specific iPSC line, clones are ready to be picked by manual dissection of large, isolated colonies into smaller pieces that are transferred to fresh medium in a smaller well for further expansion and genetic and functional screening. One can follow this protocol to readily obtain multiple GFP reporter iPSC lines that are useful for in vivo and in vitro imaging and cell isolation.
Introduction
胚性幹細胞のような多能性幹細胞（iPS細胞）へのヒト体細胞を再プログラムする能力は、最初高橋らによって発見された2007年1に4つの転写因子を発現するレトロウイルスで形質導入したヒト皮膚線維芽細胞（いわゆるダビング山中のOct3因子/ 4、Sox2の、c-Mycの、およびKlf4）の形態、増殖、遺伝子発現、およびエピジェネティックな状態に基づいて、ヒト胚性幹細胞（hESC）と非常に類似であることが示された。決定的に、iPS細胞はまた、3つの胚葉全て1の細胞に分化することができる。性IPSCの増殖能と分化能力は、彼らに非常に魅力的なツールになります。特定の疾患に罹患している患者からの細胞を再プログラミングすることによって、iPS細胞は、in vitro疾患モデル系としての潜在的治療薬としての両方に使用することができる。
後者の目的のために、いくつかの問題がiPS細胞の可能性を最大限前に対処する必要があります臨床設定で実現することができる。 in vitroで培養したhESCおよびiPSCの再プログラミングおよび細胞メンテナンス時異種誘導体の使用の腫瘍形成能、およびin vivoで移植された細胞を追跡する必要性は 、Hentze らによるレビュー、多能性幹細胞の臨床応用（のすべての重要なハードルである。 2）。移植後に関係なく、アプリケーションのサイレンと斑入り抵抗し、視覚的に検出可能なマーカーを伴うだろう分化した細胞を追跡する必要性に理想的なソリューション。外来DNAが安全ハーバー遺伝子座に導入されたときに統合された導入遺伝子の堅牢かつ持続的な表現は、最も容易に達成可能である。つまり、統合されたベクターの十分な転写を可能にするゲノム部位の隣接遺伝子3における発現の摂動を緩和し、同時に一方で。非常によく、その発見以来、特徴付けられているそのようなサイトには、アデノ随伴ウイルスINTEGRですタンパク質ホスファターゼ1調節サブユニット12C（PPP1R12C）遺伝子の第1イントロンにおけるATIONサイト1（AAVS1）、。この遺伝子座は、培養およびインビトロ分化3 に伸長時を統合導入遺伝子の持続的かつ強固な発現を可能にするだけでなく、転写摂動4から周囲の遺伝子を保護するだけでなく、示されている。両方の機能に起因AAVS1部位5に隣接する内因性のクロマチンインスレーターエレメントの存在のためであると考えられている。
単に過去10年間のゲノムエンジニアリングツールの進歩は著しく、任意の細胞型で遺伝子操作を達成することができる容易さと効率性を促進した。初期の成功した実験では、ESCは6,7に遺伝子ターゲッティングを達成するために導入された供与体と内因性相同組換え（HR）の非常に低レベルの依拠が、このようなジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFNは）、有意と、部位特異的ヌクレアーゼの使用ficantlyような実験8,9の効率を大幅に増加している二本鎖DNA切断の生成を介して相同組換えを誘導する。効率的なサイト固有のデザイナーヌクレアーゼに植物病原性キサントモナス属の転写活性化因子のようなエフェクター（テイルズ）および原核クラスタ化され、定期的にinterspaced短い回文反復（CRISPR）/ Cas9システムの両方の再利用は、多能性幹細胞でアクセス可能な遺伝子ターゲティングを行っていると実用的な方法論10-13。
最近の論文は、TALEヌクレアーゼ（TALENs）14を用いてヒトiPS細胞でAAVS1セーフハーバー座への緑色蛍光レポーターカセットの安定した組み込みのための効率的な方法を説明した。これらの標的性IPSCは、このような有用性のための強力な証拠を提供しても、心筋梗塞（MI）のマウスモデルへの心筋細胞移植に向け分化後に蛍光を維持安定した蛍光多能性幹細胞14。標的コロニーを得るために、遺伝子トラップ法は、スプライシングアクセプター（SA）は、図2（a）の自己切断ペプチド配列は、内因性PPP1R12Cプロモーターの制御下のピューロマイシン-N-アセチルトランスフェラーゼ（PAC）の遺伝子を配置し、前記使用された。したがって、AAVS1遺伝子座にDNA供与体を取り込んだだけiPS細胞は、彼らがピューロマイシン耐性に基づいて選択可能なレンダリング、PACを表現。 （ 図1、15）。このプロトコルは、AAVS1-GFP iPS細胞を生成する手順は、上のベースの性IPSCを選択、AAVS1セーフハーバー座に4.2キロバイトのDNA断片を統合するTALENsでiPS細胞をトランスフェクトするプロセスを含む、最近の論文14、および9.8キロバイトドナーで報告詳細をピューロマイシン耐性、およびクローン増殖のためにコロニーを選ぶ。本明細書に記載の技術は、多くのゲノム工学実験に適用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
（1）効率的にトランスフェクションにより性IPSCにTALENとドナープラスミドを提供する：AAVS1セーフハーバーの成功の世代のための最も重要なステップは、人間のiPS細胞であるターゲット（2）トランスフェクション後、トランスフェクションとメッキ密度の前に単一細胞にiPS細胞の解離を最適化する。 （3）用量およびIPSCラインの成長に基づく薬剤選択の時間を最適化する。 （4）を慎重に解…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the NIH Common Fund and Intramural Research Program of the National Institute of Arthritis, Musculoskeletal, and Skin Diseases.
Materials
| NAME OF MATERIAL/EQUIPMENT | COMPANY | CATALOG # | COMMENTS/DESCRIPTION |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-Free, 10mL | Corning | 354230 | Store at -20°C. |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320-033 | Store at 4°C. |
| Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Corning | 3506 | |
| Essential 8 Medium | Life Technologies | A1517001 | Store basal medium at 4°C. Store supplement at -20°C. |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | Store at room temp. Once dissolved in H2O, store at -20°C. |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886-500G | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575-020 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-250 | |
| 100mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
| DR4 MEF 2M IRR – Academic | GlobalStem | GSC-6204G | Store in liquid Nitrogen. |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995-040 | Store at 4°C. |
| Defined Fetal Bovine Serum, US Origin | HyClone | SH30070.03 | Store at -20°C. Thaw at 4°C overnight and aliquot. Store aliquots at -20°C until needed. |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140-050 | Store at 4°C. |
| 4D-Nucleofector Core unit | Lonza | AAF-1001B | part of the electroporation system |
| 4D-Nucleofector X unit | Lonza | AAF-1001X | part of the electroporation system |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT) | Lonza | V4XP-3024 | Upon arrival, remove Primary Cell Solution and supplement and store at 4°C. |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A1110501 | Store at -20°C. Thaw overnight at 4°C and warm an aliquot in a 37°C water bath before use. |
| NutriStem XF/FF Culture Medium | Stemgent | 01-0005 | Store at -20°C. Thaw overnight at 4°C |
| AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 and pZT-AAVS1-R1) | Addgene | 52637 and 52638 | |
| AAVS1-CAG-EGFP Homologous Recombination donor | Addgene | 22212 | |
| Puromycin Dihydrochloride | Life Technologies | A11138-03 | Store at -20°C. Prepare working aliquots of 1 mg/mL in ddH2O. |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Sorvall Legend XTR (Refrigerated), 120V 60Hz | Thermo Scientific | 75-004-521 | |
| TX-750 4 × 750mL Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientific | 75003607 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Hentze, H., Graichen, R., Colman, A. Cell therapy and the safety of embryonic stem cell-derived grafts. Trends Biotechnol. 25 (1), 24-32 (2007).
- Smith, J. R., et al. Robust, persistent transgene expression in human embryonic stem cells is achieved with AAVS1-targeted integration. Stem Cells. 26 (2), 496-504 (2008).
- Lombardo, A., et al. Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer. Nat Methods. 8 (10), 861-869 (2011).
- Ogata, T., Kozuka, T., Kanda, T. Identification of an insulator in AAVS1, a preferred region for integration of adeno-associated virus DNA. J Virol. 77 (16), 9000-9007 (2003).
- Zwaka, T. P., Thomson, J. A. Homologous recombination in human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 21 (3), 319-321 (2003).
- Urbach, A., Schuldiner, M., Benvenisty, N. Modeling for Lesch-Nyhan disease by gene targeting in human embryonic stem cells. Stem Cells. 22 (4), 635-641 (2004).
- Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases. Nature biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).
- Zou, J., et al. Gene targeting of a disease-related gene in human induced pluripotent stem and embryonic stem cells. Cell stem cell. 5 (1), 97-110 (2009).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature. 29 (8), 731-734 (2011).
- Sanjana, N. E., et al. A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering. Nature protocols. 7 (1), 171-192 (2012).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell stem cell. 12 (4), 393-394 (2013).
- Luo, Y., et al. Stable Enhanced Green Fluorescent Protein Expression After Differentiation and Transplantation of Reporter Human. Induced Pluripotent Stem Cells Generated by AAVS1 Transcription Activator-Like Effector Nucleases. Stem Cells Transl Med. 3 (7), 821-835 (2014).
- Zou, J., et al. Oxidase-deficient neutrophils from X-linked chronic granulomatous disease iPS cells: functional correction by zinc finger nuclease-mediated safe harbor targeting. Blood. 117 (21), 5561-5572 (2011).
- Luo, Y., Rao, M., Zou, J. Generation of GFP Reporter Human Induced Pluripotent Stem Cells Using AAVS1 Safe Harbor Transcription Activator-Like Effector Nuclease. Curr Protoc Stem Cell Biol. 29, 5A.7.1-5A.7.18 (2014).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7, 2029-2040 (2012).
