Transfection, sélection et Colony-cueillette des induite par l'homme Cellules souches pluripotentes TALEN ciblées avec un gène de la GFP dans le AAVS1 Safe Harbor
Summary
TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.
Abstract
Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral vector mediated random integration. This protocol describes a universal and efficient transgene targeted addition platform in human iPSCs based on utilization of validated open-source TALENs and a gene-trap-like donor to deliver transgenes into a safe harbor locus. Importantly, effective gene editing is rate-limited by the delivery efficiency of gene editing vectors. Therefore, this protocol first focuses on preparation of iPSCs for transfection to achieve high nuclear delivery efficiency. When iPSCs are dissociated into single cells using a gentle-cell dissociation reagent and transfected using an optimized program, >50% cells can be induced to take up the large gene editing vectors. Because the AAVS1 locus is located in the intron of an active gene (PPP1R12C), a splicing acceptor (SA)-linked puromycin resistant gene (PAC) was used to select targeted iPSCs while excluding random integration-only and untransfected cells. This strategy greatly increases the chance of obtaining targeted clones, and can be used in other active gene targeting experiments as well. Two weeks after puromycin selection at the dose adjusted for the specific iPSC line, clones are ready to be picked by manual dissection of large, isolated colonies into smaller pieces that are transferred to fresh medium in a smaller well for further expansion and genetic and functional screening. One can follow this protocol to readily obtain multiple GFP reporter iPSC lines that are useful for in vivo and in vitro imaging and cell isolation.
Introduction
La possibilité de reprogrammer des cellules somatiques humaines en cellules souches pluripotentes souches embryonnaires cellulaires comme induites (CSPi) a été découvert par Takahashi et al. En 2007 1. Fibroblastes dermiques humaines transduites avec rétrovirus exprimant quatre facteurs de transcription (Le Yamanaka soi-surnommé facteurs Oct3 / 4, Sox2, c-Myc, et Klf4) ont été montrés être très similaire à des cellules souches embryonnaires humaines (hESC) en fonction de la morphologie, la prolifération, l'expression du gène, et l'état épigénétique; surtout, iPSCs sont également capables de se différencier en cellules des trois couches germinales 1. La capacité potentielle et la différenciation de prolifération des CSPi les rend très attractifs outils; par reprogrammation des cellules provenant de patients souffrant de maladies spécifiques, iPSCs peuvent être utilisés à la fois comme systèmes de modèle in vitro de la maladie et en tant qu'agents thérapeutiques potentiels.
Pour ce dernier objectif, plusieurs questions doivent être réglées avant que le plein potentiel de CSPidans un cadre clinique peut être réalisé; le potentiel tumorigène des CSEh et CSPi, l'utilisation de dérivés xénogéniques lors de la reprogrammation et l'entretien des cellules cultivées in vitro, et la nécessité de suivre les cellules transplantées in vivo sont tous les obstacles cruciaux à l'application clinique des cellules souches pluripotentes (Commenté par Hentze et au. 2). Une solution idéale pour la nécessité pour le suivi des cellules différenciées post-transplantation impliquerait un marqueur visuellement détectable qui résiste taire et panachées indépendamment de l'application. Expression forte et soutenue de transgènes intégrés est plus facilement réalisable lorsque l'ADN exogène est introduit dans Coffre-port loci; ce est-à emplacements génomiques qui permettent la transcription suffisante d'un vecteur intégré en même temps l'atténuation des perturbations de l'expression dans trois gènes voisins. Un tel site qui a été très bien caractérisé depuis sa découverte est le virus intégr adéno-associésite ation 1 (AAVS1), dans le premier intron de la protéine phosphatase une sous-unité régulatrice 12C (PPP1R12C) gène. Ce lieu a été démontré non seulement pour permettre l'expression soutenue et robuste de transgènes intégrés dans le temps étendu dans la culture et dans la différenciation in vitro 3, mais aussi pour protéger les gènes de la perturbation de la transcription 4 entourant; les deux éléments sont considérées comme étant dues à la présence d'éléments d'isolateur chromatine endogènes flanquant le site de AAVS1 5.
Les progrès dans les outils d'ingénierie des génomes plus juste de la dernière décennie ont grandement facilité la facilité et l'efficacité avec lesquelles les manipulations génétiques dans ne importe quel type de cellule peuvent être atteints. Bien que les expériences réussies début invoqués excessivement faibles niveaux de recombinaison homologue endogène (HR) avec un donneur présenter à atteindre ciblage de gène dans les CES 6,7, l'utilisation des nucléases spécifiques au site, tels que les nucléases à doigts de zinc (de ZFN), qui signitivement induire la recombinaison homologue grâce à la génération d'une rupture d'ADN double brin a considérablement augmenté l'efficacité de ces expériences 8,9. La réorientation des deux transcription activateur comme effecteurs (contes) de plantes pathogène Xanthomonas genres et les cluster régulièrement espacées répétitions palindromiques courts procaryotes (CRISPR) / système Cas9 dans efficaces nucléases de créateurs propres à chaque site a fait le ciblage de gènes dans les cellules souches pluripotentes un accessible et méthodologie possible 10-13.
Un article récent décrit une méthode efficace pour l'intégration stable d'une cassette de rapporteur fluorescent vert dans le AAVS1 Coffre-port locus CSPi humaines à l'aide de nucléases TALE (Talens) 14. Ces CSPi ciblées ont maintenu leur fluorescence même après la différenciation dirigé vers les cardiomyocytes et la transplantation dans un modèle de souris de l'infarctus du myocarde (IM), fournissant des preuves solides pour l'utilité de cettede manière stable des cellules souches pluripotentes 14 fluorescent. Pour obtenir des colonies cibles, un procédé de piégeage de gènes a été utilisé dans lequel un épissage accepteur (SA), une séquence de peptide de l'auto-clivage 2A place la puromycine N-acétyl-transférase (PAC) gène sous le contrôle du promoteur PPP1R12C endogène; Ainsi, seules iPSCs qui ont incorporé le donneur d'ADN au locus AAVS1 expriment PAC, les rendant sélectionnable sur la base de la résistance à la puromycine; (Figure 1, 15). Ce protocole détaille les procédures de générer AAVS1-GFP CSPi signalé dans le récent article 14, y compris le processus de transfection CSPi avec TALENs et un donneur de 9,8 kb pour intégrer un fragment d'ADN de 4,2 kb dans le locus AAVS1 Coffre-port, la sélection CSPi basé sur puromycine-résistance, et les colonies de cueillette pour l'expansion clonale. Les techniques décrites ici peuvent être appliqués à de nombreuses expériences d'ingénierie du génome.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les étapes les plus critiques pour la génération réussie de AAVS1 Coffre-port ciblées CSPi humaines sont: (1) délivrant efficacement Talen et donateurs plasmides dans CSPi par transfection; (2) optimiser la dissociation des CSPi dans des cellules individuelles avant la transfection et le placage densité après transfection; (3) l'optimisation dose et l'heure de la drogue sélection basée sur la croissance de la ligne iPSC; (4) disséquant soigneusement et choisir colonies ciblées et le transfert à la n…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the NIH Common Fund and Intramural Research Program of the National Institute of Arthritis, Musculoskeletal, and Skin Diseases.
Materials
| NAME OF MATERIAL/EQUIPMENT | COMPANY | CATALOG # | COMMENTS/DESCRIPTION |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-Free, 10mL | Corning | 354230 | Store at -20°C. |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320-033 | Store at 4°C. |
| Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Corning | 3506 | |
| Essential 8 Medium | Life Technologies | A1517001 | Store basal medium at 4°C. Store supplement at -20°C. |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | Store at room temp. Once dissolved in H2O, store at -20°C. |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886-500G | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575-020 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-250 | |
| 100mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
| DR4 MEF 2M IRR – Academic | GlobalStem | GSC-6204G | Store in liquid Nitrogen. |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995-040 | Store at 4°C. |
| Defined Fetal Bovine Serum, US Origin | HyClone | SH30070.03 | Store at -20°C. Thaw at 4°C overnight and aliquot. Store aliquots at -20°C until needed. |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140-050 | Store at 4°C. |
| 4D-Nucleofector Core unit | Lonza | AAF-1001B | part of the electroporation system |
| 4D-Nucleofector X unit | Lonza | AAF-1001X | part of the electroporation system |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT) | Lonza | V4XP-3024 | Upon arrival, remove Primary Cell Solution and supplement and store at 4°C. |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A1110501 | Store at -20°C. Thaw overnight at 4°C and warm an aliquot in a 37°C water bath before use. |
| NutriStem XF/FF Culture Medium | Stemgent | 01-0005 | Store at -20°C. Thaw overnight at 4°C |
| AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 and pZT-AAVS1-R1) | Addgene | 52637 and 52638 | |
| AAVS1-CAG-EGFP Homologous Recombination donor | Addgene | 22212 | |
| Puromycin Dihydrochloride | Life Technologies | A11138-03 | Store at -20°C. Prepare working aliquots of 1 mg/mL in ddH2O. |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Sorvall Legend XTR (Refrigerated), 120V 60Hz | Thermo Scientific | 75-004-521 | |
| TX-750 4 × 750mL Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientific | 75003607 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Hentze, H., Graichen, R., Colman, A. Cell therapy and the safety of embryonic stem cell-derived grafts. Trends Biotechnol. 25 (1), 24-32 (2007).
- Smith, J. R., et al. Robust, persistent transgene expression in human embryonic stem cells is achieved with AAVS1-targeted integration. Stem Cells. 26 (2), 496-504 (2008).
- Lombardo, A., et al. Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer. Nat Methods. 8 (10), 861-869 (2011).
- Ogata, T., Kozuka, T., Kanda, T. Identification of an insulator in AAVS1, a preferred region for integration of adeno-associated virus DNA. J Virol. 77 (16), 9000-9007 (2003).
- Zwaka, T. P., Thomson, J. A. Homologous recombination in human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 21 (3), 319-321 (2003).
- Urbach, A., Schuldiner, M., Benvenisty, N. Modeling for Lesch-Nyhan disease by gene targeting in human embryonic stem cells. Stem Cells. 22 (4), 635-641 (2004).
- Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases. Nature biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).
- Zou, J., et al. Gene targeting of a disease-related gene in human induced pluripotent stem and embryonic stem cells. Cell stem cell. 5 (1), 97-110 (2009).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature. 29 (8), 731-734 (2011).
- Sanjana, N. E., et al. A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering. Nature protocols. 7 (1), 171-192 (2012).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell stem cell. 12 (4), 393-394 (2013).
- Luo, Y., et al. Stable Enhanced Green Fluorescent Protein Expression After Differentiation and Transplantation of Reporter Human. Induced Pluripotent Stem Cells Generated by AAVS1 Transcription Activator-Like Effector Nucleases. Stem Cells Transl Med. 3 (7), 821-835 (2014).
- Zou, J., et al. Oxidase-deficient neutrophils from X-linked chronic granulomatous disease iPS cells: functional correction by zinc finger nuclease-mediated safe harbor targeting. Blood. 117 (21), 5561-5572 (2011).
- Luo, Y., Rao, M., Zou, J. Generation of GFP Reporter Human Induced Pluripotent Stem Cells Using AAVS1 Safe Harbor Transcription Activator-Like Effector Nuclease. Curr Protoc Stem Cell Biol. 29, 5A.7.1-5A.7.18 (2014).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7, 2029-2040 (2012).
