Манипуляция и<em> In Vitro</em> Созревание<em> Xenopus Laevis</em> ооциты, а затем внутриклеточное инъекции сперматозоида в целях изучения эмбрионального развития

ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты с лягушками проводилась в соответствии требованиям внутренних дел Великобритании. 1. Подготовка Xenopus Laevis ооцитов Примерно за неделю до сбора яйцеклеток, вводят женщин лягушек с 150 U беременных Маре Сыворотка гонадотропин (PMSG) для предварительного грунтования с помощью 1 мл стерильного шприца с иглой 27 G. Инъекции делается подкожно в спинной лимфатический мешок. ПРИМЕЧАНИЕ: оптимальным является использование лягушек, которые не откладывают яйца в течение длительного времени (по крайней мере, более чем полтора года), или что никогда не откладывали яйца раньше. Хранения предварительно загрунтовать лягушек в резервуар с водой, установленной на 18 ° С в легкой комнате с управляемой (7 утра-7 вечера: на, 7 вечера-7 утра: выключено). В день сбора ооцитов, подготовка 1 л 1x модифицированных Барта раствор (MBS) от 10x MBS наличии разбавлением дважды дистиллированной воде (DDH 2 O), и добавить пенициллин и стрептомицин в конечной концентрации 10 мкг / млкаждый (MBS + PS). 10x MBS фонд состоит из 880 мм NaCl, 10 мМ KCl, 24 мМ NaHCO 3, 8,2 мМ MgSO 4 · 7H 2 O, 3,3 мм Ca (NO 3) 2 · 4H 2 O, 4,1 мм CaCl 2 · 6H 2 O, 100 мМ HEPES, рН 7,5. Обезболить предварительно загрунтованных лягушки путем подкожной инъекции 120 мг (в 400 мкл) Tricaine метансульфоната (MS222). Держите вводят лягушку в небольшой емкости с водой. После 10 мин, проверьте наркозом лягушку, повернув его на так успешно анестезию лягушки не реагируют на это. Если анестезия является неполным, добавить лед в бак и подождать еще 10 минут. Возьмите лягушку из небольшой емкости и места в спинной лежачее положение на влажной салфеткой. Использование щипцов и небольшие хирургические ножницы, ущипнуть кожу и сделать небольшой разрез (2 см) в нижней части живота, сбоку от средней линии. Сделайте еще один разрез на другой стороне. После разреза кожи, поднять мышечный слой Wiго щипцы и сделать надрез в мышечный слой. Обратите внимание на яичник после мышечный слой разрезают и тянуть яичник из разрезов с помощью щипцов. Передача экстрагируют яичника в 50 мл пробирку с раствором МБС. ПРИМЕЧАНИЕ: Попробуйте собрать как можно больше яичник, как это возможно с обеих разрезов. Убоя женский лягушку обескровливания, а затем путем замораживания для последующего надлежащей утилизации. Промойте извлеченные яичника несколько раз с MBS + PS пока кровь не смывается. Затем перенесите яичник в 9 см чашки Петри, содержащей MBS + PS ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте качество ооцитов при вскрытии микроскопом в этой точке. Если ооциты, по-видимому плохое качество, такие как ооциты с неравномерной пигментацией у животного половины (рис 1а), не обрабатывают дальше и вместо получения нового яичника. В идеале, ооциты должны иметь не менее пигментированные полушария животных и примерно равных по размеру. Дразнить яичник на мелкие кусочки(1-2 см 2), и собирают 5 мл ооцитов в новую пробирку на 50 мл. Промыть 5 мл разорванной яичника несколько раз с MBS + PS и добавить MBS + PS 15 мл. Добавить 7 единиц фермента для defolliculation яичника суспензии (см список материалов). Примечание: Восстановить лиофилизированного фермента с 10 мл DDH 2 O (28 ед / мл). Помещают пробирку в течение 30 мин на льду при периодическом осторожном закрученной. Аликвоты 250 мкл и хранить при -80 ° С до использования. Инкубируйте яичников часть с ферментом в течение 1 ч при осторожном встряхивании на качалке (скоростью 15 об / мин, что эквивалентно примерно 0,014 мкг). Примечание: Для практически полного удаления фолликулярных клеток, 2 ч до 2 ч 15 мин инкубации с ферментом, как правило, необходимы. Более инкубации необходимо для ооцитов переноса ядра эксперимента 16. После 1 ч инкубации, забрать небольшое количество обработанных яйцеклеток (10-20 ооцитов) и передачу в 6 см чашку Петри, содержащую МБС + PS Проверьте EXTEнт defolliculation при вскрытии микроскопом. Если ооциты отделены друг от друга, и, по меньшей мере, частично defolliculated (фиг.1В), сразу же перейти к следующей реакции останова (шаг 18). Если ооциты все еще сильно в окружении фолликулярных клеток, инкубировать в течение дополнительных 15 мин при максимуме. Добавить много MBS + PS, чтобы остановить реакцию, и отбросить супернатант. Повторите промывку в 10 раз. Примечание: Добавить MBS + PS путем заливки в стенке 50 мл пробирку, но не непосредственно на ооцитах. После суспензии в MBS + PS, небольшие ооциты незрелые может плавать в верхней части промывочного буфера и отбросить такие малые плавающие ооцитов. После мытья, трансфер в 9 см чашки Петри, содержащей MBS + PS Примечание: на этой стадии и далее, сохранить ооцитов при 16-18 ° С в максимально возможной степени. Это может быть сделано путем поддержания ооцитов, содержащих блюдо на стадии контролируемой температурой. Выберите этапа VI ооцитов в соответствии с классификацией Думонтадля последующего использования и переход к новой 9 см чашки Петри, содержащей MBS + PS ооцитов может осуществляться передача с помощью стеклянной пипетки с подходящего размера наконечника (больше, чем размер яйцеклетки). Примечание: Качественное ооциты должны иметь равномерно пигментированные животных полушарие с четким контрастом между полушарии животных и вегетативного полушария, и быть примерно одинакового размера (рис 1в). Сценическое VI ооциты представляют окреп ооцитов, которые могут реагировать на прогестерон (диаметр ооцитов о 1,2-1,4 мм). 2. Введение антисмысловых олигонуклеотидов или мРНК в ооциты ПРИМЕЧАНИЕ: Все описанные в этом разделе должно быть сделано на 16-18 ° С на столике микроскопа, оснащенного контролируемой температурой циркулирующей воде или на пластиковой коробке со льдом. Передача 200-300 выбранных ооцитов в новый 9 см чашки Петри, заполненной MBS + Ps, в которой будет выполнена микроинъекции. ПРИМЕЧАНИЕ: В ВАСч состояние, 200-300 яйцеклеток обычно используется. В общей сложности примерно 1000 ооциты используются в одном эксперименте. Для приготовления инъекции антисмысловых олигонуклеотидов или мРНК, извлеките металлический поршень в microinjector. Заполните стеклянного капилляра с минеральным маслом с помощью шприца и вставить стеклянный капилляр, заполненный маслом с металлическим плунжером microinjector. ПРИМЕЧАНИЕ: стеклянный капилляр тянет микропипетки съемник. Эти иглы хранятся в коробку, не повреждая советы. Отрежьте кончик иглы, используя небольшие хирургические ножницы под микроскопом с целью как наконечник малого диаметра для инъекций, как это возможно. ПРИМЕЧАНИЕ: кончик иглы можно уточнить с помощью микро кузницы или микропипетки beveler. Для скос иглы под углом 25 ° повышает способность проникать ооцита стенку. Поместите небольшую полоску парафильмом на этапе вскрытии микроскопом и выдачи капли 3 мкл антисмысловой олиго или раствора мРНК. Перемещение Tiр инъекционной иглы в небольшой капли раствора и заполнения иглы с раствором для инъекций. Примечание: Если кончик иглы для инъекций слишком мал, пузырьки воздуха должны отображаться на кончике металлического плунжера. Затем, сделать больше чаевых на инъекционной иглы, пока это не произойдет. Отметить инъекционной иглы приблизительно 0,5 мм от кончика. Эта метка используется в качестве индикатора глубины инъекции. Вставьте кончик иглы в ооцит по экваториальной границы, направляя к центральной точке яйцеклетки (под зародышевого пузырька), мягко удерживая противоположную сторону яйцеклетки к точке ввода щипцами для предотвращения нежелательного движения яйцеклетки во время инъекции , ПРИМЕЧАНИЕ: Найти зоны, свободной от фолликулярных клеток (рис 1б) и вставить иглу с этого места, так как даже тонкая игла часто не могут проникнуть в слой фолликулярных клеток. Извлеките 4,6 нг / 4,6 NL или 9,2 нг / 9,2 нл AntisEnse олигонуклеотиды, или соответствующий объем мРНК (250 мкг до 13,8 нг) с помощью ножной переключатель. Информация о подготовке антисмысловой олиго описаны в 7. Передача инъекционные ооциты в чашку 6 см Петри заполнены MBS + PS с добавлением 0,1% BSA (ооцитов в среду инкубации; стерилизации раствор, используя фильтр 0,45 мкм пор). Инкубируйте ооцитов на 16 ° C или 18 ° C в течение 1-2 дней. Примечание: Вводимый ооциты могут быть подвергнуты пробирке созревания в течение нескольких часов после инъекции, и в этом случае инъекции 4,6 нг антисмысловых олигонуклеотидов является предпочтительным. Общее правило заключается в том, что короче инкубационный период, тем лучше последующее развитие эмбриона. 3. In Vitro созревания (IVM) ооцитов Вечером созревания эксперимента ооцитов, принеси прогестерон маточного раствора (30 мм в этаноле) от -80 ° C морозильника и растворить осадок при комнатной мепературе с редкими вихря. Примечание: прогестерон складе, как правило, оставляют при комнатной температуре в течение 30 мин до 1 ч. Добавить 5 мкл прогестерона наличии в 50 мл MBS + PS (Созревание среды; конечной концентрации прогестерона в 3 мкм) и встряхивают на шейкере в течение 30 мин, чтобы распределить прогестерон в растворе в равной степени. Подготовка агарозном покрытием 6 см блюда на экстракорпорального созревания лечения. Добавить 1 г агарозы с 50 мл 1x MBS без магний и кальций. Растворить агарозы путем нагревания в микроволновой печи. Налейте небольшой объем раствора агарозы до 6 см чашки, чтобы покрыть дно посуды. Подождите, по крайней мере, в течение 30 минут до затвердевания. ПРИМЕЧАНИЕ: Агароза покрытие предотвращает налипание ооциты блюд. После того, как в пробирке созрел ооцитов плотно прикреплена к блюдам, наиболее вероятно, что ооциты будут активированы с помощью стимулов, которые они получают во время отрыва от DISГЭС. Залить 5-8 мл Созревание среды в агарозном покрытием блюда и передать 200-300 яйцеклеток в каждые 6 см блюд. Примечание: старайтесь, чтобы передать ооциты с минимальным количеством яйцеклеток среде инкубации. Инкубируют в течение 16 часов при 16 ° С. ПРИМЕЧАНИЕ: Например, начать лечение в 5 часов вечера и закончится в 9 утра на следующий день. 4. Интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида (ИКСИ) Замороженной спермы Массоподготовка ПРИМЕЧАНИЕ: следующие подготовительные спермы должно быть сделано до начала созревания эксперимент ооцитов, и замороженные запасы спермы хранятся при температуре -80 ° С в течение ИКСИ. Соберите яички от мужчины лягушки, выполнив действия 1,4 до 1,11, для буксировки жира, кроме и яички из разрезов с помощью щипцов и удаления яичек из жира. Промыть яички в 1x Марк модифицированной Рингера (MMR, 100 мМ NaCl, 2 мМ KCl, 1 мМ MgSO 4, 2 мМ CaCl 2, 5 мМ HEPES, рН 7,4). Удалить жира А.Н.D кровеносные сосуды, прокат промытый яички на чистую папиросной бумаги, а затем, удалив оставшиеся кровеносные сосуды, используя пинцет. Место каждого яичка в блюдо 3,5 см Петри, содержащую 1 мл 1x MMR. Разрезанные продольно с мелкими ножницы, и разорвать на мелкие кусочки с помощью хирургического пинцета, пока не большие куски остаются. Пипетка вверх и вниз с помощью 1 мл пластиковый наконечник конец которой разрезают и нагрузки 1 мл дробленого семенников раствора в стакан гомогенизатора. Однородный их на 2-3 ударов, а затем заливают раствор на пор фильтра 50 мкм, прикрепленной к верхней части 15 мл центрифужную пробирку. Разрешить решение, чтобы пройти через фильтр. Повторите шаг 4.1.7 ресуспендированием оставшиеся вырезать яичка в 1 мл 1x MMR. Наконец, мыть Гомогенизатор пару раз 1х MMR и передать его через фильтр. Повторите шаги 4.1.5 4.1.8 для другого яичка и бассейн два яичек в одну 15 мл центрифужную пробирку. Спин клетки при 800 мкг при 46; С в течение 20 мин. Жидкость над осадком сливают и вновь суспендируют осажденные клетки в 2 мл 1x MMR. Затем передать в новую пробирку. ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что никаких видимых кровяных клеток нет. Подготовка ступенчатый градиент в 14 мл ультра-ясный центрифужную пробирку. Нижний слой: 4 мл 30% иодиксанола. Второй нижний слой: 1 мл 20% иодиксанола. В-третьих нижний слой: 5 мл 12% иодиксанола. Верхний слой: яичка клетки в 2 мл 1x MMR. Перекрытие градиентов очень осторожно пипетки 1 мл (наложения медленно, чтобы не нарушить нижнюю фазу). ПРИМЕЧАНИЕ: Только один слой 30% иодиксанола также должны работать для выделения только сперму. Спин в роторе SW40, используя ультрацентрифугу на 10000 мкг при 4 ° С в течение 15 мин (замедление без перерыва). Аккуратно снимите трубку от ультрацентрифуге. Подтверждение интерфейс между каждым слоем градиента и осадок на дне. Соберите часть спермы от осадка. Ресуспендируют PEL спермыпусть в 1x MMR для вымывания иодиксанол. Спин при 800 х г при 4 ° С в течение 20 мин. ПРИМЕЧАНИЕ: Если много спермы все еще остаются в суспензии после вращения, повторного спина супернатант в 3220 мкг при 4 ° С в течение 20 мин и бассейн на гранулированный сперму. Жидкость над осадком сливают и вновь суспендируют таблетку спермы в 1 мл 1х ядерной подготовки буфера (НПБ; 250 мМ сахарозы, 0,5 мМ спермидина тригидрохлорид, 0,2 мМ спермин тетрагидрохлорид, 1 мМ ЭДТА, 15 мМ HEPES, рН 7,7) 13. Затем перенесите в пробирку Эппендорфа. Добавить 50 мкл 10 мг / мл раствора дигитониновых в 1x НПБ (Ресуспендируют дигитониновых порошка в ДМСО при 50 мг / мл и замораживают аликвот при -80 ° С. Перед использованием разбавить 50 мг / мл аликвоты с 10 мг / мл с 1x НПБ. Неиспользованный 10 мг / мл дигитонинового можно заморозить и хранить при -20 ° С и повторно использовать), чтобы 1 мл раствора сперматозоидов. Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре. Проверить скорость проницаемости по DAPI окрашивания (0,3 мкг / мл DAPI в FINAКонцентрация л). Если меньше, чем 95% клеток проницаемыми, инкубировать немного дольше. Примечание: Иногда, если слишком много сперматозоиды инкубируют в то же время (особенно, когда сперма, собранной из нескольких семенников), трудно проницаемыми, и в этом случае может быть необходимо добавить дополнительный небольшое количество дигитониновых; Например, если 20% спермы не проницаемыми, дополнительно 20 мкл дигитониновых добавлен. Остановка пермеабилизации добавлением 10% BSA до 3% конечной концентрации. Спин клеток при 4 ° С. Примечание: старайтесь как можно меньше скорость центрифугирования, как можно, начиная с 100 мкг в течение 5 мин. Если не достаточно, увеличить скорость и / или времени. Промыть клетки с 0,3% BSA в 1X НПБ и центрифуги с той же скоростью, как на стадии 4.1.22. Между тем, подготовить спермы буферной памяти (SSB; 2 мл 2 раза в НПБ, 120 мкл 10% BSA, 1,2 мл автоклавного глицерин, 680 мкл H 2 O). Добавить 500 мкл SSB в спермеПелле. Пипеток несколько раз вверх и вниз для ресуспендирования с разрезом наконечник для того, чтобы не повредить клетки. Разрешить уравновешиваться в течение ночи при 4 ° С. Внесите клетки вверх и вниз несколько раз с разрезом наконечник. Развести пару мкл 10 раз в 1x MMR или в 1X PBS рассчитывать клеток с использованием гемоцитометра. Замораживание в виде аликвот в 30 000 сперматозоидов / мкл (или выше) непосредственно при -80 ° С и хранят при -80 ° С в одном аликвоты использования. ИКСИ в пробирке созрел ооцитов ПРИМЕЧАНИЕ: Все процессы, связанные с ооциты должно быть сделано на 16-18 ° С. Подготовьте стеклянную пипетку для переноса созрели ооцитов. ПРИМЕЧАНИЕ: стеклянную пипетку должен быть достаточно широким, чтобы вместить ооцитов без сжатия. Шестнадцать часов после перемещения ооциты с прогестероном среде, содержащей, передача зрелости ооцитов в 6 см агарозном покрытием блюдо, заполненной MBS + PS для стирки. ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, мatured ооциты должны рассматриваться исключительно тщательно. Грубое обращение ооцитов может вызвать самопроизвольное включение до инъекции сперматозоидов. Граф созрели ооцитов, подтвердив появление белых пятен, которая подразумевает зародышевого пузырька срыв (рисунок 2). Если скорость созревания составляет менее 80%, то маловероятно, чтобы получить достаточное количество выживших эмбрионов для дальнейших анализов. ПРИМЕЧАНИЕ: Остальные фолликул клетки отслаиваются после созревания яйцеклетки (рис 2). Передача ооцитов из MBS промывки к новому агарозном покрытием чашку диаметром 6 см, заполненной инъекционной среды (приготовления 500 мл: 30 г Ficoll (6%), 20 мл 10-кратного MMR и 500 мкл 1,000x PS наличии). Выдержите по меньшей мере, в течение 30 минут перед началом ИКСИ. Настройте microinjector как описано в шагах 2.2-2.4. Примечание: Размер кончик иглы для инъекций хранится как можно меньше в соответствии с методикой, описанной на стадии 2.6. Диаметриглы 20-40 мкм. Для скос кончик иглы, как описано в стадии 2,4 могло бы позволить эффективно инъекции. Выборка аликвоту спермы и разбавления суспензии сперматозоидов в сперме Буфер для разведения (SDB; 250 мМ сахарозы, 75 мМ KCl, 0,5 мМ Спермидин, 0,2 мМ спермина, 200 мкМ HEPES рН 7,5). Примечание: Разбавление может изменяться в зависимости от размера иглы и так далее. Развести 120 раз на 30 000 сперматозоидов / мкл складе в качестве первоначального попытки и настроить далее, если это необходимо. Поместите небольшую полоску парафильмом на сцене вскрытии микроскопом. Смешайте спермы раствора для инъекций с помощью пипетки и обойтись несколько мкл каплю раствора сперматозоидов. Сосать разбавленной суспензии сперматозоидов в иглу, вводят 4,6 NL в 10 последовательных капель, содержащих 0,3 мкг / мл DAPI на предметное стекло микроскопа, и быстро подсчитать количество сперматозоидов поставленного на инъекцию на флуоресцентного микроскопа. ПРИМЕЧАНИЕ: Цель 1-2 сперму на инъекцию. При необходимости, разбавить раствор для инъекций сперму болееи не проверить количество сперматозоидов в инъекции раз до получения нужной концентрации. Извлеките решение тест впрыска и заполнить новый инъекция сперматозоида решение с должной концентрации. Внедрить 4,6 нл спермы раствора до 100 зрелых ооцитов. ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы постоянно вводить раствор. Первый определить время, необходимое для выталкивания 4,6 NL (обычно 1-2 сек). Повторите следующую процедуру; вводить в яйцеклетки, подождите несколько секунд, снимите иглу и макет инъекции в раствор для инъекций, подождите несколько секунд, вводят в ооцит. Этот непрерывный впрыск также предотвращает блокирование кончике иглы. Альтернативно, способ с использованием насоса может быть использован 13. После примерно 100 инъекции, извлеките оставшийся раствор спермы и пополнение решение спермы (используйте один и тот же раствор спермы, но пипетки вверх и вниз перед нанесением). ПРИМЕЧАНИЕ: Если игла не сосать решение спермы и, вырезать верхушку необходимостиле. Если это не улучшит ситуацию, подготовить новую иглу. Повторите процесс впрыска, пока все ооциты не вводится. ПРИМЕЧАНИЕ: Если качество ооцитов хорошо и инъекции успешно, сокращение вводимых ооцитов рассматривается в течение 20 мин времени впрыска. Перемещение инъекционные блюда до 16 ° С или 18   ° C инкубатор. 4-5 ч после инъекции, проверьте скорость расщепления эмбрионов ИКСИ. Примечание: расщепления борозды этих эмбрионов может быть не столь очевидно, как у нормальных оплодотворенных эмбрионов. Некоторые эмбрионы также показывают неправильные раскол, что может быть вызвано многократным инъекции сперматозоидов. Передача расщепляется эмбрионов в том числе аномально расщепленных эмбрионов в среде инкубации (Подготовка 500 мл: 20 г фиколлом (4%), 5 мл 10х MMR и 500 мкл 1,000x PS складе). Выдержите эмбрионов либо в 16   ° C или 18 ° C инкубатор в течение ночи. На следующее утро, передача ЭмбриОС 0.1x MMR и рассчитывать выжить эмбрионов. В среднем, около 10% спермы-инъекции ооцитов могут развиваться до стадии головастика бассейн (фиг.3А).