操作と<em>インビトロ</emの>成熟<em>アフリカツメガエル</em細胞質内精子注入し>卵母細胞、胚発生を研究するために

注：カエルを持つすべての実験は、英国内務省の要件に従って実施した。 アフリカツメガエルの調製はツメガエル卵母細胞約卵母細胞の採取前の週、27 Gの針を1ミリリットルの滅菌注射器を使って、事前にプライミングのために妊馬血清性性腺刺激ホルモン（PMSG）の150 Uでメスのカエルを注入する。注射は、背側リンパ嚢に皮下に行われます。 注：それは長い時間のための卵を産むなかったカエルの前に卵を置いたことがない（少なくとも半年以上）またはを使用するのが最適である。 水槽に保管プレプライミングカエルは光制御室で18℃で（オフ：：、午後7時 – 午前7時に午前7時 – 午後7時）を設定します。 卵母細胞の収集の日に、1×1 Lは、二重蒸留水（ddH 2 O）で希釈して10×MBSストックからバース溶液（MBS）を改変、および10μg/ mlの最終濃度で、ペニシリンおよびストレプトマイシンを追加する準備各（MBS + PS）。 10×MBSストック880のNaCl、10mMの塩化カリウム、24mMのNaHCO 3を、8.2 mMのをMgSO 4·7H 2 O、3.3のCa（NO 3）2·4H 2 O、4.1のCaCl 2·6H 2 O、100から構成されmMのHEPES、pHは7.5。 トリカインメタン（MS222）120mgの（400μL中）の皮下注射によって事前にプライミングカエルを麻酔。水と小さなタンクに注入されたカエルにしてください。 10分後、成功裏に麻酔をかけたカエルはこれに応答しないので、それを上に回して、麻酔したカエルをチェック。麻酔が不完全な場合、タンクに氷を追加し、さらに10分間待つ。 拭く湿った上背側横臥の小さなタンクと場所からカエルをピックアップ。 鉗子と小さな外科用ハサミを使用して、皮膚を​​つまんで正中線に横方向の腹部、下部に小さな切開（2 cm）を作る。他の側で別の切開を行います。 皮膚を切断した後、筋層w iを持ち上げる鉗子番目と筋肉層の切開を作る。 筋層を切断した後に卵巣を観察し、ピンセットを用いて切開部から卵巣を引き出します。 転送は、MBS溶液を50mlチューブに卵巣を抽出した。 注：両方の切開からできるだけ多くの卵巣を収集してみてください。 その後の適切な処分のために凍結が続く放血による女性のカエルを、スローター。 血液が洗い流されるまでMBS + PSで抽出卵巣を数回すすいでください。その後、PS + MBSを含む9センチメートルペトリ皿に卵巣を転送注：この時点で、解剖顕微鏡下で卵母細胞の品質を確認してください。卵母細胞は、そのような動物の半分に不均一な色素沈着と卵母細胞として明らかに品質が悪い、（ 図1A）であれば、さらに処 ​​理して、代わりに新しい卵巣を得ることはありません。理想的には、卵母細胞は、均等に着色された動物の半球を持っており、約等しいサイズでなければなりません。 小さな断片に卵巣をいじめる（1-2 cm 2）を 、新たな50mlチューブに卵母細胞を5mlを収集。 MBS + PSで引き裂かれた卵巣の5ミリリットルを数回すすぎ、15ミリリットルにMBS + PSを追加します。 （材料リストを参照してください）​​卵巣懸濁液にdefolliculationに対する酵素の7台を追加します。 注：のddH 2 O（28単位/ ml）10mlを、凍結乾燥酵素で再構成。時折穏やかに旋回しながら氷上で30分間、バイアルを置きます。使用するまで-80℃で小分けし、250μlの店舗。 穏やかにシェーカー（約0.014 XGと等価15回転/分の速度、）上で振盪しながら1時間酵素と卵巣作品をインキュベートする。 NOTE：包細胞のほぼ完全な除去のために、酵素を用いた2時間から2時間15分のインキュベーションは、通常必要とされる。より長いインキュベーションは、卵母細胞の核移植実験16のために必要とされる。 1時間インキュベートした後、MBSを含む6センチメートルシャーレに小さな治療の卵母細胞の数（10〜20卵母細胞）と転送を拾う+ PSエクステを確認してください解剖顕微鏡下defolliculationのNT。卵母細胞は、互いに分離され、少なくとも部分的に（ 図1B）、濾胞除去している場合は、すぐに次の停止反応（ステップ18）に進む。卵母細胞が依然として強く包細胞に囲まれている場合は、最大で余分な15分間インキュベートする。 反応を停止し、上清を廃棄するようにMBS + PSの多くを追加します。 10回洗濯を繰り返します。 注：直接ではなく卵母細胞に、50ミリリットルチューブの壁に注ぐことによって、MBS + PSを追加します。 MBS + PSに懸濁した後、小さい未成熟卵母細胞を洗浄緩衝液の上部に浮遊し、このような小さなフローティング卵母細胞を廃棄する傾向がある。 洗浄した後、PS + MBSを含む9センチメートルペトリ皿に移す注：このステップ以降は、16〜18℃で可能な限り卵母細胞を維持するから。これは、温度制御されたステージに卵母細胞を含有する皿を保持することによって行うことができる。 デュモンの分類に従って、段階VI卵母細胞を選択MBS + PSの卵母細胞の移動を含む新しい9センチメートルシャーレに続く使用および転送のために適切なチップサイズ（卵母細胞のサイズよりも大きい）を有するガラスピペットを使用して行うことができる。 注：良質の卵母細胞は、動物半球と植物半球の間に明確なコントラストで均等に着色された動物の半球を持つべき、とほぼ等しく大きさにする（ 図1C）。ステージVI卵母細胞（卵母細胞の直径は約1.2〜1.4ミリメートルである）プロゲステロンに応答することができ、完全に成長した卵母細胞を表す。 卵母細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはmRNAの2注入注：このセクションのすべてのステップは、温度制御され、循環水や氷で満たされたプラスチックの箱に備えた顕微鏡ステージ上に16〜18°Cで行ってください。 マイクロインジェクションが実行される中でMBS + PS、で満たされた新しい9センチメートルシャーレに200〜300が選択した卵母細胞を転送します。 注：EACで時間条件は、200〜300卵母細胞は、通常使用されている。合計で、約1,000卵​​母細胞は、1つの実験で使用されている。 アンチセンスオリゴまたはmRNAの注射を調製するために、インジェクターの金属プランジャを吐出する。 注射器を用いて鉱物油とガラスキャピラリーを記入し、マイクロインジェクターの金属プランジャにオイルを充填したガラスキャピラリーを挿入します。 注：ガラスキャピラリーは、マイクロピペットプラーによって引っ張られている。これらの針は、先端にダメージを与えることなく、ボックスに保存されています。 できるだけ注射のための小径のヒントとして目指すことで、顕微鏡下で小さな外科用ハサミを使用して、針の先端をカットします。 注：ニードルチップは、マイクロ鍛造またはマイクロピペットbevelerを使用して先鋭化することができる。 25°の角度で針を面取りするには、卵母細胞壁を貫通能力を向上させる。 解剖顕微鏡のステージ上にパラフィルムの小さなストリップを置き、アンチセンスオリゴまたはmRNA溶液を3μlの低下を分配する。 TIを移動溶液の小液滴への注射針のpと溶液と針を埋めるが注入される。 注：注射針の先端が小さすぎると、気泡は、金属プランジャの先端に表示されます。そこで、この現象が発生しなくなるまで注射針に大きなヒントを作る。 マーク約0.5mm離れて先端から注射針。このマークは、注入深さの指標として用いられる。 穏やかに注入中に望ましくない卵母細胞の移動を防止するための鉗子で注入点に卵母細胞の反対側を保持しながら（卵核胞の下）卵母細胞の中心点に照準することにより、赤道境界に沿って卵母細胞に針の先端を挿入する。 注：包細胞（ 図1B）の空き領域を検索し、さらには細い針がしばしば包細胞の層を貫通することはできませんので、その場所から針を挿入します。 4.6 NG / NL 4.6または9.2 NG / ANTISの9.2 NLを取り出しENSEオリゴ、またはフットスイッチを使用することにより、mRNAの適切な音量（13.8 NGに250 PG）。アンチセンスオリゴ調製の詳細は、7に記載されている。 0.1％BSAを補充したMBS + PSを充填した6センチメートルペトリ皿に注入した卵母細胞を移す（卵母細胞のインキュベーション培地、孔径0.45μmフィルターを用いて溶液を滅菌する）。 16の卵母細胞をインキュベート °Cまたは1〜2日間、18℃。 注：注入した卵母細胞は、4.6 ngのアンチセンスオリゴの注入が好ましく、その場合、注入後のインビトロ成熟数時間、に供することができる。一般的なルールは、その後の胚発生良い、潜伏期間が短いことである。 卵母細胞の体外成熟（IVM）3. 卵成熟実験の夜、℃の冷凍庫-80℃からプロゲステロンストック溶液（エタノール中30 mm）をフェッチし、室温TEMで沈殿物を溶解させる時折渦と温度。 注：プロゲステロンストックは、通常、1時間に30分間室温で放置する。 MBS + PSの50ミリリットルでプロゲステロン株式の5μL（成熟培地、3μmとプロゲステロンの最終濃度）を追加し、同じように、溶液中のプロゲステロンを配布するために30分間シェーカー上振る。 体外成熟治療のためのアガロースコートした6センチの皿を準備します。 マグネシウムとカルシウムなしで1X MBSの50ミリリットルにアガロースの1グラムを追加します。 電子レンジで加熱してアガロースを溶解させる。 皿の底部を覆うように6cm皿にアガロース少量の溶液を注ぐ。 固化するまで少なくとも30分間待ちます。 注：アガロースコーティングが皿に卵母細胞の付着を防ぐことができます。一度しっかりと皿に接続されている体外成熟卵子では、卵母細胞は、それらがDISから剥離時に受け取ることが刺激によって活性化される可能性が最も高いHES。 成熟培地5-8 mlの料理をアガロースコーティングし、それぞれ6センチメートル皿に200〜300卵母細胞を転送するために注ぐ。 注：卵母細胞インキュベーション培地最小量の卵母細胞を転送してみてください。 16℃で16時間インキュベートする。 注：たとえば、次の日の午前9時から午後5時までとフィニッシュでの治療を開始する。 4.細胞質内精子注入法（ICSI） 凍結精子の株式準備注：以下の精子の準備は卵成熟実験を開始する前に行う必要があり、かつ凍結精子のストックは、ICSIのために-80℃に保たれている。 下記によって男性のカエルから精巣を収集することは脂肪を引っ張り、鉗子を使用し、脂肪からの精巣を除去した切開部から精巣を除いて、1.11に1.4を繰り返します。 1X Marcの修正リンガー（MMR、100mMのNaCl、2のKCl、1mMのMgSO 4を、2のCaCl 2、5mMのHEPES、pH7.4）中で精巣を洗ってください。 脂肪ANを削除鉗子を使用して残りの血管を除去することによって清浄なティッシュペーパーで洗浄した精巣を圧延することによってdの血管。 1X MMRの1ミリリットルを含む3.5センチメートルペトリ皿に各精巣を配置します。 細かいハサミで縦に切断し、大した片がなくなるまでピンセットで細かく裂く。 ピペットアップし、1mlの末端が切断され、負荷破砕精巣溶液1mlをガラスホモジナイザーにプラスチックチップを用いてダウン。 2-3ストロークによってそれらを均質化した後、15mlの遠心管の上部に取り付けられた50μmのポアフィルター上に溶液を注ぐ。液がフィルターを通過することを許可する。 1X MMRの1ミリリットルの残りのカット精巣を再懸濁することによって手順を繰り返し4.1.7。最後に、1X MMRでホモジナイザーを数回洗浄し、フィルターに通し。 繰り返します1 15ミリリットルの遠心管に他の精巣やプール2精巣のために4.1.8に4.1.5を繰り返します。 4で800×gで細胞をスピン6; 20分間、C。 上清を捨て、1X MMRの2ミリリットルでペレット化した細胞を懸濁します。次に、新しいチューブに移す。 注：目に見える血液細胞が存在しないことを確認してください。 14ミリリットルの超明確な遠心管に段階勾配を準備します。ボトム層：30％イオジキサノールの4ミリリットル。二番底層：20％イオジキサノールの1ミリリットル。第三の下部層：12％イオジキサノールを5ml。最上層：1×MMR 2ml中の精巣細胞。 （下相を乱さないようにゆっくりとオーバーレイ）を1mlのピペットチップで非常に穏やかに勾配を重ねる。 注：わずか30％のイオジキサノールの1つの層はまた、唯一の精子を分離するために働く必要があります。 （休憩なしで減速）15分間、4℃で万×gで超遠心機を使用して、SW40ローターでスピン。 静かに超遠心からチューブを外します。グラデーションの各層と下部のペレットとの間のインタフェースを確認してください。 ペレットから精子画分を収集する。 精子ペルを再懸濁イオジキサノールを洗浄するための1X MMRでみましょう。 20分間、4℃で800×gでスピン。 注：場合は精子の多くはまだ20分間、4℃で3220×gでスピン、再スピン上清後に懸濁液中に残り、ペレット化した精子をプール。 上清を捨て、1X原子力準備緩衝液1mlに精子ペレットを再懸濁（NPB; 250 mMのスクロース、0.5 mMのスペルミジン三塩酸塩、0.2 mMのスペルミン四塩酸、1mMのEDTA、15mMのHEPES、pHは7.7）13。その後、エッペンドルフチュー​​ブに移す。 50 mg / mlの時に1倍NPB（DMSO中に再懸濁しジギトニン粉末中に50〜10ミリグラムのμL/ mlのジギトニン溶液を添加し、-80℃でアリコートを凍結する。前に使用を、10 mgの50 mg / mlのアリコートを希釈/ mlの1X NPB。10mg / mlのジギトニンで凍結させ、-20℃に再使用される）の精子溶液1ml 1で保存することができる未使用。 室温で5分間インキュベートする。 FINAとしてDAPI染色（0.3 / mlのDAPIによって透過化率を確認してくださいlの濃度）。細胞の95％未満を透過処理している場合は、少し長くインキュベートする。 注：あまりにも多くの精子細胞を（精子が複数の精巣から収集される特に）が同時にインキュベートされる場合には時々、それは透過性にすることが困難であり、それは、ジギトニンの追加の少量を添加することが必要であり、その場合に、精子の20％が透過性にされていない場合、例えば、ジギトニンの追加の20μlを添加する。 3％の最終濃度になるように10％BSAを添加することによって透過処理を停止する。 4℃で細胞をスピン。 注：5分間100×gで始まるによってできるだけ少ない遠心分離速度を試してみてください。十分でない場合は、速度および/または時間を増加させる。 ステップ4.1.22と同じ速度で1X NPBと遠心機で0.3％BSAで細胞を洗浄。一方、精子格納バッファ（; 2X NPBの2ミリリットル、10％のBSA、グリセロールオートクレーブ処理1.2ミリリットル、H 2 Oの680μlの120μlのSSB）を用意。 精子にSSB500μlのを追加ペレット。上下にピペットで数回細胞を損傷しないようにするために切断チップで再懸濁する。 4℃で一晩平衡化できるようにします。 切断先端を上下に数回、細胞をピペット。 血球計数器を用いて細胞をカウントするために10回1X MMRでまたは1x PBS中マイクロリットルのカップルを希釈する。 単回使用のアリコートで-80℃で3万精子/μL（またはそれ以上）を直接-80℃で、店舗でのアリコートとして凍結する。 インビトロ成熟卵母細胞にICSI 注：卵母細胞に関連するすべてのプロセスは、16〜18℃で行われるべきである。 成熟した卵母細胞を転送するためのガラスピペットを準備します。 注：ガラスピペットを圧迫することなく、卵母細胞を収容するのに十分な幅である必要があります。 16時間プロゲステロン含有培地への卵母細胞を移動した後、転送が洗浄のためのMBS ​​+ PSで満たされた6センチメートルアガロースでコーティングされた皿に卵母細胞を成熟。 注：重要なのは、Matured卵母細胞は非常に注意深く処理しなければならない。卵母細胞のラフ治療は精子注入の前に自発的な活性化を誘導することができる。 胚胞崩壊（ 図2）を意味する白い斑点の外観を、確認することで成熟卵母細胞を数える。成熟率が80％未満であれば、さらなる分析のための胚の生存に十分な数を得ることがありそうである。 注：残りの卵胞細胞は、卵成熟（ 図2）後に剥離される。 （：10倍MMRと1,000倍のPS株式の500μLのフィコールの30グラム（6％）、20ミリリットル500ミリリットルを準備）転送注入媒体で満たされた新しいアガロースコートした6 cmディッシュに洗浄MBSから卵母細胞。 ICSIを開始する前に30分間、少なくともインキュベートする。 ステップ2.2から2.4で説明したようにマイクロインジェクターを設定します。 注：注射針の先端サイズは、ステップ2.6に記載の手順に従って、できるだけ小さく保たれる。直径針の20〜40程度である。ステップ2.4​​で説明したように、針の先端を面取りするには、効率的な注入を可能にするかもしれません。 精子のアリコートをフェッチし、精子希釈バッファー（SDB、250mMのスクロース、75のKCl、0.5 mMのスペルミジン、0.2 mMのスペルミン、200μMのHEPES pH7.5）を中に精子懸濁液を希釈。 注：希釈は、ように針のサイズに応じて変更することができる。最初のトライ30,000精子/μL株式の120倍に希釈し、必要に応じてさら​​に調整します。 解剖顕微鏡のステージ上にパラフィルムの小さなストリップを置きます。ピペッティングにより精子注射液を混合し、精子溶液を数μL低下を分配する。 針に希釈精子懸濁液サック、顕微鏡スライド上の0.3 / mlのDAPIを含む10の連続した​​液滴に4.6 NLを注入し、かつ迅速に蛍光顕微鏡に注入あたりの​​配信精子の数を数える。 注：注射当たり1〜2精子を目指す。必要であれば、より多くの精子注入溶液を希釈と所望の濃度を達成するまで、再び注射あたりの精子の数を確認。 テスト注射液を取り出し、適切な濃度で新しい精子注射液を埋める。 100成熟卵母細胞への精子溶液を4.6 NLを注入。 注：それは継続的にソリューションを注入することが重要です。まず4.6 NL（通常は1〜2秒）を吐出するために必要な時間を決定する。以下のプロセスを繰り返し、卵母細胞に注入し、数秒間待って、注射液中の針とモック注射を削除、数秒間待って、卵母細胞に注入する。この連続注入はまた、針の先端のブロッキングを防止します。代替的に、ポンプを用いる方法13を使用してもよい。 後に約100回の注射、（同じ精子液を使用するが、ピペット上下分配前）残りの精子溶液及び再充填精子液を吐出。 注：針がよく精子液を吸引していない場合、必要​​の先端をカットル。この状況を改善しない場合は、新しい針を準備します。 すべての卵母細胞が注入されるまで、注入プロセスを繰り返します。 NOTE：卵母細胞の質が良好であり、注入が成功した場合、注入した卵母細胞の収縮は噴射時間の20分以内に見られる。 16℃または18に注入された食器を移動  Cのインキュベーターを°。 注射後4-5時間後、ICSI胚の切断率を確認してください。 注：これらの胚の切断は畝は、通常の受精胚のものほど明確でないかもしれない。いくつかの胚は、複数の精子注入が原因である可能性があり、異常な切断を示す。 インキュベーション培地に異常に切断された胚を含む転送切断された胚（500ミリリットルを準備しますフィコール（4％）、5 10倍MMR mlの1,000倍のPS株式の500μLの20グラム）。 どちら16で胚をインキュベート 一晩℃、または18℃のインキュベーター。 次の朝、転送エンブリー0.1×MMRにOSと生き残った胚を数える。 平均して、精子を注入した卵母細胞の約10％は、スイミングオタマジャクシの段階（ 図3A）に開発することができます。