Manipulatie en<em> In Vitro</em> Rijping van<em> Xenopus laevis</em> Eicellen, Gevolgd door intracytoplasmatische sperma-injectie, om embryonale ontwikkeling

OPMERKING: Alle experimenten met kikkers werd volgende eisen van de Britse ministerie van Binnenlandse Zaken uitgevoerd. 1. Bereiding van Xenopus laevis Eicellen Ongeveer een week voor de eicel collectie, injecteren vrouwelijke kikkers met 150 U van drachtige merrie Serum Gonadotropine (PMSG) voor pre-priming met behulp van 1 ml steriele spuit met een 27 G naald. Injectie wordt subcutaan gedaan naar dorsale lymfe weg. LET OP: Het is optimaal om kikkers die geen eieren had gelegd voor een lange tijd (ten minste meer dan een half jaar) of die nooit hebben eieren gelegd alvorens te gebruiken. Kant-en-gegrond kikkers in een watertank ingesteld op 18 ° C in het licht gecontroleerde kamer (07:00-19:00: op, 19:00-07:00: uit). Op de dag van de eicel collectie, voor te bereiden 1 liter 1x gewijzigd Barth's Solution (MBS) uit 10x MBS voorraad door verdunning met dubbel gedestilleerd water (DDH 2 O), en voeg penicilline en streptomycine met de uiteindelijke concentratie van 10 ug / mlelke (MBS + PS). 10x MBS voorraad bestaat uit 880 mM NaCl, 10 mM KCl, 24 mM NaHCO3, 8,2 mM MgSO4 .7H 2 O, 3,3 mM Ca (NO 3) 2 .4H 2 O, 4,1 mM CaCl2 .6H 2 O, 100 mM HEPES, pH 7,5. Verdoven een vooraf geprepareerd kikker door subcutane injectie van 120 mg (in 400 pl) van tricaïne methaansulfonaat (MS222). Houd de geïnjecteerde kikker in een kleine tank met water. Na 10 min, controleer dan de verdoofde kikker door hem over sinds succes verdoofde kikkers niet reageren op dit. Als anesthesie is onvolledig, ijsblokjes toevoegen in de tank en wacht nog eens 10 min. Pick-up van de kikker uit de kleine tank en plaats in dorsale decubitus op een vochtig doekje. Met behulp van een tang en een kleine chirurgische schaar, neem de huid en een kleine incisie (2 cm) in het onderste gedeelte van de buik, lateraal van de middellijn. Maak nog een incisie aan de andere kant. Na het snijden van de huid, til de spierlaag with pincet en maken de incisie in de spierlaag. Let op de eierstok na de spierlaag wordt gesneden en trek de eierstok uit de incisies met behulp van een tang. Overdracht geëxtraheerd eierstok in een 50 ml buis met MBS oplossing. OPMERKING: Probeer zoveel eierstok te verzamelen als mogelijk uit beide insnijdingen. Slacht de vrouwelijke kikker door verbloeding, gevolgd door bevriezing voor verdere geschikte verwijdering. Spoel de uitgepakte eierstok een paar keer met MBS + PS totdat het bloed wordt weggespoeld. Breng dan de eierstok een 9 cm petrischaal met MBS + PS OPMERKING: Controleer de kwaliteit van eicellen onder een dissectiemicroscoop op dit punt. Als eicellen zijn blijkbaar slechte kwaliteit, zoals eicellen met ongelijke pigmentatie in het dier de helft (figuur 1A), hoeft niet verder te verwerken en een nieuwe eierstok plaats te verkrijgen. Idealiter zou eicellen even gepigmenteerde dier hersenhelften hebben en ongeveer even groot. Plagen de eierstok in kleine stukjes(1-2 cm2) en verzamel 5 ml van oöcyten in een nieuwe buis van 50 ml. Spoel 5 ml van de gescheurde eierstok enkele malen met MBS + PS en MBS toevoegen + PS 15 ml. Voeg 7 eenheden van het enzym voor defolliculation aan de eierstok suspensie (zie Materials List). OPMERKING: Reconstitueer gevriesdroogd enzym met 10 ml van DDH 2 O (28 eenheden / ml). Plaats het flesje gedurende 30 minuten op ijs met af en toe voorzichtig om te zwenken. Aliquot 250 ul en bewaar bij -80 ° C tot gebruik. Incubeer de eierstok stuk met het enzym gedurende 1 uur onder zacht schudden op het schudapparaat (snelheid 15 REV / min, overeenkomend met ongeveer 0.014 xg). OPMERKING: Bij nagenoeg volledige verwijdering van follikel cellen 2 uur tot 2 uur 15 min incubatie met het enzym normaliter niet vereist. Langere incubatietijd is nodig voor eicel kernoverdracht experiment 16. Na 1 uur incubatie, pick-up een klein aantal behandelde eicellen (10-20 eicellen) en overbrengen in een 6 cm petrischaal met MBS + PS Controleer de extent van defolliculation onder een stereomicroscoop. Als oöcyten worden gescheiden van elkaar en ten minste gedeeltelijk defolliculated (Figuur 1B), onmiddellijk over tot het volgende halte reactie (stap 18). Als oöcyten nog sterk omringd door follikel cellen incubeer een extra 15 min maximaal. Tal van MBS + PS toevoegen aan de reactie te stoppen en gooi het supernatant. Herhaal het wassen voor 10 keer. OPMERKING: Voeg MBS + PS door uitgieten aan de wand van een buis van 50 ml, maar niet rechtstreeks aan oöcyten. Na suspensie in MBS + PS, kleine onrijpe eicellen neiging te zweven boven in wasbuffer en gooi dergelijke kleine drijvende oöcyten. Na het wassen, over te dragen aan een 9 cm petrischaal met MBS + PS Opmerking Vanaf deze stap verder, houden oöcyten bij 16-18 ° C zoveel mogelijk. Dit kan gedaan worden door het houden van de oöcyten met schotel op een temperatuurgeregelde fase. Selecteer fase VI eicellen volgens Dumont's classificatievoor de volgende toepassingen en transfer naar een nieuwe 9 cm petrischaal met MBS + PS Eicel overdracht kan worden gedaan met behulp van een glazen pipet met een geschikt formaat tip (groter dan de eicel grootte). OPMERKING: Goede kwaliteit eicellen moet een gelijkmatig gepigmenteerde dier halfrond met duidelijke contrast tussen het dier halfrond en de plantaardige halfrond hebben, en worden ongeveer even groot (figuur 1C). Fase VI eicellen vertegenwoordigen volgroeid eicellen die kunnen reageren op progesteron (eicel diameter is ongeveer 1,2-1,4 mm). 2. Injectie van antisense-oligonucleotiden of mRNA in Eicellen LET OP: Alle stappen in deze sectie moeten worden gedaan op 16-18 ° C op een microscoop podium uitgerust met temperatuurgestuurde circulerende water of op een plastic doos gevuld met ijs. Overdracht 200-300 geselecteerde eicellen in een nieuwe 9 cm petrischaal gevuld met MBS + PS, waarbij micro-injectie wordt uitgevoerd. LET OP: In each staat, worden 200-300 eicellen normaal gebruikt. In totaal zijn ongeveer 1.000 eicellen gebruikt in een experiment. Voor het bereiden van de injectie van antisense oligo's of mRNA, werpen de metalen zuiger van een microinjector. Vul een glas capillair met minerale olie met behulp van spuit en plaats de glazen capillair gevuld met olie aan de metalen zuiger van microinjector. OPMERKING: Een glazen capillair wordt getrokken door micropipet trekker. Deze naalden worden in een doos bewaard zonder beschadiging tips. Snij de punt van de naald met kleine chirurgische schaar onder een microscoop door te streven kleine diameter tip voor injectie mogelijk. OPMERKING: De naald kan worden aangescherpt door het gebruik van een micro smederij of micropipet beveler. Om de naald onder een schuine hoek van 25 ° verbetert de capaciteit van het penetreren van de eicel wand. Plaats een kleine strook Parafilm op het podium van een dissectie microscoop en breng een 3 ui druppel van de antisense oligo of mRNA oplossing. Verplaats de tip van de injectienaald in de kleine druppel oplossing en vul de naald met de oplossing te injecteren. Opmerking: Als de punt van de injectienaald te klein is, moet luchtbellen aan het uiteinde van de metalen plunjer. Maak dan een grotere tip over de injectienaald totdat dit niet gebeurt. Markeer de injectienaald ongeveer 0,5 mm van de punt. Dit merkteken wordt gebruikt als indicator van injectiediepte. Steek de punt van de naald in een oöcyt langs de equatoriale grens door te streven naar het middelpunt van de eicel (onder de kiemblaasje) onder zacht houdt de tegenoverliggende zijde van de eicel bij het injectiepunt met een tang voor het voorkomen van ongewenste beweging eicel tijdens de injectie . OPMERKING: Vind het gebied dat vrij is van follikel cellen (Figuur 1B) en steek de naald van die plek, omdat zelfs een fijne naald kan niet vaak dringen een laag van follikel cellen. Eject 4.6 ng / 4.6 nl of 9.2 ng / 9.2 nl van anti'sense oligo's, of een geschikt volume van mRNA (250 pg tot 13,8 ng) met behulp van de voetschakelaar. Details van antisense oligo bereiding worden beschreven in 7. Breng de geïnjecteerde oöcyten in een schaal 6 cm Petri vol MBS + PS aangevuld met 0,1% BSA (Oocyte incubatiemedium, steriliseren van de oplossing met een 0,45 um poriën filter). Incubeer de oöcyten 16 ° C of 18 ° C gedurende 1-2 dagen. OPMERKING: Geïnjecteerde oöcyten kunnen worden onderworpen aan in vitro rijping enkele uren na injectie, waarbij injectie van 4,6 ng antisense oligo voorkeur. Een algemene regel is dat hoe korter de incubatietijd, hoe beter de verdere embryonale ontwikkeling. 3. In vitro maturatie (IVM) van Eicellen Op de avond van de eicel rijping experiment, haal progesteron voorraad-oplossing (30 mM in ethanol) van -80 ° C vriezer en los neerslagen bij kamertemperatuur temtuur met af en toe een vortex. OPMERKING: De progesteron voorraad wordt normaal bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten tot 1 uur. Voeg 5 ul van de progesteron voorraad in 50 ml MBS + PS (Rijping medium, de uiteindelijke concentratie progesteron 3 uM) en schud de shaker gedurende 30 min progesteron verdeel eveneens in de oplossing. Bereid-agarose gecoate 6 cm schalen voor in vitro rijping. Voeg 1 g agarose met 50 ml 1 x MBS zonder magnesium en calcium. Los agarose door verwarmen in een magnetron. Giet een klein volume van de agarose oplossing van 6 cm schalen onderaan gerechten dekken. Wacht minstens 30 minuten tot stollen. OPMERKING: Agarose coating voorkomt kleven van eicellen om gerechten. Eenmaal in vitro gerijpte oöcyten stevig aan gerechten, is het zeer waarschijnlijk dat eicellen worden geactiveerd door de stimuli die zij ontvangt gedurende de onthechting van dishes. Giet 5-8 ml Rijping medium agarose-beklede schalen en breng 200-300 eicellen in elk 6 cm schalen. OPMERKING: Probeer om eicellen te dragen met een minimale hoeveelheid van eicel incubatiemedium. Incubeer gedurende 16 uur bij 16 ° C. OPMERKING: Start bijvoorbeeld de behandeling in 05:00 en eindigen om 09:00 op de volgende dag. 4. intracytoplasmatische sperma-injectie (ICSI) Ingevroren sperma stampreparaat OPMERKING: De volgende sperma voorbereiding moet worden gedaan voordat de eicel rijping experiment, en ingevroren sperma voorraden worden bewaard bij -80 ° C voor ICSI. Verzamel de testes van een mannelijke kikker door de stappen 1.4 tot 1.11, behalve voor het trekken van vet en de testikels uit de incisies met behulp van een tang en het verwijderen van testikels uit het vet. Was testes 1x Marc's Modified Ringers (MMR, 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH 7,4). Verwijder vet eend bloedvaten door het rollen van de gewassen testikels op een schone tissue en vervolgens door de resterende bloedvaten met behulp van een tang verwijderen. Plaats elke testis in een 3,5 cm petrischaal met 1 ml 1 x MMR. Snijd in de lengte met fijne schaar, en scheur in kleine stukjes met een pincet tot er geen grote stukken blijven. Pipet op en neer met 1 ml plastic tip waarvan het einde wordt afgesneden en apparatuur 1 ml gemalen testis oplossing in een glazen homogenisator. Meng ze met 2-3 slagen en giet de oplossing op een 50 pm porie filter bevestigd aan de top van een 15 ml centrifugebuis. Laat de oplossing om te gaan door het filter. Herhaal stap 4.1.7 door resuspenderen de restsnede testis in 1 ml 1x MMR. Tot slot was de homogenisator een paar keer met 1x BMR en doorgeven door het filter. Herhaal de stappen 4.1.5 tot 4.1.8 voor de andere testis en het zwembad twee testikels in een centrifugebuis van 15 ml. Draai de cellen bij 800 xg bij 46; C gedurende 20 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de gepelleteerde cellen in 2 ml 1x MMR. Vervolgens over in een nieuwe buis. OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen zichtbare bloedcellen aanwezig zijn. Bereid een stap gradiënt in een 14 ml ultra-heldere centrifugebuis. Onderste laag: 4 ml 30% iodixanol. Tweede onderlaag: 1 ml 20% iodixanol. Derde onderste laag: 5 ml van 12% iodixanol. Toplaag: testis cellen in 2 ml 1x MMR. Overlay de hellingen zeer voorzichtig met een 1 ml pipet (overlay langzaam de bodem fase niet te storen). OPMERKING: Slechts een laag van 30% iodixanol zou ook moeten werken voor het isoleren alleen sperma. Spin in de SW40 rotor met ultracentrifuge bij 10.000 xg bij 4 ° C gedurende 15 min (vertraging zonder onderbreking). Verwijder voorzichtig de buis van de ultracentrifuge. Bevestig een interface tussen elke laag van de gradiënt en de pellet op de bodem. Verzamel de zaadcel fractie uit de pellet. Resuspendeer het sperma pellaat in 1x MMR voor uitwassen iodixanol. Spin bij 800 xg bij 4 ° C gedurende 20 min. OPMERKING: Als er veel sperma nog in de schorsing blijven na de spin, re-spin het supernatant bij 3220 xg bij 4 ° C gedurende 20 min en bundelen de afgedraaid sperma. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet sperma in 1 ml van 1x Nuclear Bereiding Buffer (NPB; 250 mM sucrose, 0,5 mM spermidine trihydrochloride, 0,2 mM Spermine-tetrahydrochloride, 1 mM EDTA, 15 mM HEPES, pH 7,7) 13. Vervolgens transfer naar een Eppendorf buis. Voeg 50 ul van 10 mg / ml Digitonine oplossing 1x NPB (Resuspendeer Digitonine poeder in DMSO bij 50 mg / ml en bij -80 ° C vriezer. Verdun voor gebruik van 50 mg / mL tot 10 mg / ml met 1x NPB. Ongebruikte 10 mg / ml Digitonine kan worden ingevroren en bewaard bij -20 ° C en opnieuw gebruikt) 1 ml van het sperma oplossing. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Check een permeabilisatie tarief met DAPI kleuring (0,3 ug / ml DAPI als final concentratie). Indien minder dan 95% van de cellen worden gepermeabiliseerd, incubeer een beetje langer. OPMERKING: Soms als te veel zaadcellen geïncubeerd tegelijkertijd (vooral wanneer sperma vanuit meerdere testes), is het moeilijk om doorlaatbaar, in welk geval het noodzakelijk zijn een extra kleine hoeveelheid Digitonine voegen; bijvoorbeeld wanneer 20% van sperma niet permeabel een extra 20 pl Digitonine wordt toegevoegd. Stop permeabilisatie door 10% BSA tot 3% eindconcentratie. Draai de cellen bij 4 ° C. OPMERKING: Probeer zo weinig centrifugeersnelheid mogelijk door te beginnen met 100 g gedurende 5 min. Indien onvoldoende, de snelheid en / of tijd. Was de cellen met 0,3% BSA in 1x NPB en centrifugeer bij dezelfde snelheid als punt 4.1.22. Ondertussen bereidt de Sperma opslagbuffer (SSB; 2 ml 2x NPB, 120 ui 10% BSA, 1,2 ml geautoclaveerd Glycerol, 680 ui H2O). Voeg 500 ul van SSB om het spermapellet. Pipet een paar keer op en neer om opnieuw in suspensie met een cut tip om de cellen niet te beschadigen. Laat overnacht equilibreren bij 4 ° C. Pipetteer de cellen op en neer meerdere malen met een cut tip. Verdun een paar microliter 10 keer 1x MMR of 1x PBS aan de cellen met behulp hemocytometer tellen. Bevriezen monsters bij 30.000 sperma / ul (of hoger) direct bij -80 ° C en bewaar bij -80 ° C in één aliquots. ICSI in vitro gerijpte eicellen OPMERKING: Alle processen waarbij eicellen moet worden gedaan op 16-18 ° C. Bereid een glazen pipet voor het overbrengen van volgroeide eicellen. OPMERKING: De glazen pipet moet breed genoeg om eicellen te vangen zonder te knijpen zijn. Zestien uur na het verplaatsen van eicellen om de progesteron-bevattend medium, overdracht volgroeide eicellen in een 6 cm-agarose gecoate schotel gevuld met MBS + PS voor het wassen. OPMERKING: Belangrijk, matured oöcyten moeten zeer voorzichtig behandeld. Ruwe behandeling van eicellen kan spontane activering voordat sperma-injectie veroorzaken. Telling volgroeide eicellen door bevestiging het verschijnen van witte vlekken, die de germinal vesicle verdeling (figuur 2) impliceert. Als de rijping lager is dan 80%, is het onwaarschijnlijk dat het voldoende aantal overlevende embryo's voor verdere analyse te verkrijgen. OPMERKING: resterende follikelcellen afgepeld na maturatie (figuur 2). Transfer eicellen uit MBS wassen in nieuw-agarose gecoate 6 cm schaal gevuld met injectiemedium (voorbereiden 500 ml: 30 g Ficoll (6%), 20 ml van 10x MMR en 500 pl 1000x PS voorraad). Incubeer ten minste 30 minuten voordat ICSI. Het opzetten van de microinjector zoals beschreven in de stappen 2,2-2,4. OPMERKING: De tip grootte van de injectienaald wordt zo klein mogelijk gehouden door de in stap 2.6 beschreven. De diametervan de naald van 20-40 urn. Aan de naaldtip afschuining zoals beschreven in stap 2.4 misschien efficiënte injectie toe te staan. Haal het sperma hoeveelheid en verdun het sperma suspensie in Sperma VerdunningsBuffer (SDB; 250 mM sucrose, 75 mM KCI, 0,5 mM Spermidine, 0,2 mM Spermine, 200 M HEPES pH 7,5). OPMERKING: Verdunning kan worden gevarieerd afhankelijk van een naald maat enzovoort. Verdunnen 120 keer van de 30.000 sperma / ul voorraad als een eerste keer te proberen en verder aan te passen indien nodig. Plaats een kleine strook van Parafilm op het podium van een dissectie microscoop. Meng sperma-injectie-oplossing door pipetteren en breng een paar ul druppel van het sperma oplossing. Zuig het verdunde spermasuspensie in de naald, injecteren 4.6 nl tot 10 opeenvolgende druppels die 0,3 pg / ml DAPI op een microscoopglaasje en snel tel het aantal zaadcellen geleverd per injectie een fluorescentiemicroscoop. OPMERKING: Richt 1-2 zaadcellen per injectie. Indien nodig verdunnen sperma injectieoplossing moreen controleer het aantal zaadcellen per injectie nogmaals tot het bereiken van een gewenste concentratie. Werp de proefinjectie oplossing en vul een nieuw sperma-injectie-oplossing met een goede concentratie. Injecteren 4.6 nl sperma oplossing tot 100 volgroeide eicellen. OPMERKING: Het is belangrijk om continu injecteren van de oplossing. Bepaal eerst de tijd vereist voor het uitwerpen 4.6 nl (gewoonlijk 1-2 sec). Herhaal de volgende procedure; injecteren in een eicel, wacht een paar seconden, verwijder dan een naald en mock-injectie in injectievloeistof, wacht een paar seconden, injecteren in een eicel. Deze voortdurende injectie voorkomt ook het blokkeren van de naald. Als alternatief kan de werkwijze met een pomp worden gebruikt 13. Na ongeveer 100 injecties, werpen de resterende sperma oplossing en het opnieuw vullen van de sperma-oplossing (gebruik dezelfde sperma oplossing, maar pipet op en neer voordat doseren). OPMERKING: Als de naald sperma oplossing ook niet zuigen, snijd het topje van de noodzaakle. Als dit niet het verbeteren van de situatie voor te bereiden een nieuwe naald. Herhaal de injectie totdat alle oöcyten geïnjecteerd. OPMERKING: Als de eicel kwaliteit is goed en de injectie succesvol is, wordt samentrekking van geïnjecteerde oöcyten gezien binnen 20 minuten na de injectie tijd. Beweeg de geïnjecteerde gerechten tot 16 ° C of 18   ° C incubator. 4-5 uur na de injectie, controleer dan de splitsing tarief van ICSI embryo's. OPMERKING: Splitsing voren van die embryo's zijn misschien niet zo duidelijk als die van normale bevruchte embryo's zijn. Sommige embryo's tonen ook abnormale breuklijnen, die veroorzaakt kunnen worden door meerdere sperma-injectie. Transfer gesplitst embryo's waaronder abnormaal gekliefd embryo incubatie medium (Bereid 500 ml: 20 g Ficoll (4%), 5 ml van 10x BMR en 500 ul van 1000x PS voorraad). Incubeer embryo hetzij in 16   ° C of 18 ° C incubator 's nachts. De volgende ochtend, overdracht embryos tot 0.1x BMR en tel overgebleven embryo's. Gemiddeld kan ongeveer 10% van sperma geïnjecteerde oöcyten ontwikkelen om het zwembad kikkervisje stadium (figuur 3A).