Manipülasyon ve<em> İn Vitro</emVe> Olgunlaşma<em> Xenopus laevis</emIntrasitoplazmik sperm enjeksiyonu izledi> oositler, Embriyonik Geliştirme Çalışması

NOT: kurbağa ile tüm deney İngiltere Home Office gereklerini takip yürütülmüştür. Xenopus 1. Hazırlık laevis oosit Yaklaşık bir hafta oosit alma önce bir 27 G iğne ile, 1 ml steril bir şırınga ile ön astarlanması için Gebe Kısrak Serumu Gonadotropin (PMSG) 150 U dişi kurbağa enjekte edilir. Enjeksiyon dorsal lenf kese içine deri altından yapılır. NOT: Bu uzun bir süre için yumurtalarını vermedi kurbağaları önce yumurta koydu asla (en azından yarısından fazlası yıllık) ya da kullanmak için en uygunudur. (: On, 07:00-7:00: off 07:00-7:00) Mağaza ışık kontrollü odada 18 ° C'ye ayarlanmış bir su tankında kurbağa-prime önceden. Oosit toplama gününde, (GKD 2 O) çift damıtılmış su ile inceltilerek 10x MBS stoktan 1x Modifiye Barth solüsyonu (MBS) 'nin 1 L' nin Hazırlanması ve 10 ug / ml son konsantrasyonda penisilin ve streptomisin ilaveHer (MBS + PS). 10x MBS hazır 880 mM NaCI, 10 mM KCI, 24 mM NaHCO3, 8.2 mM MgSO oluşmaktadır 4 H2O .7H, 3.3 mM Ca (NO 3) 2 .4H 2, O, 4,1 mM CaCl2 .6H 2, O, 100 mM HEPES, pH 7.5 olarak değiştirilmişti. Tricaine metansülfonat (400 ul) 120 mg olarak deri altma enjeksiyonu (MS222) ile önceden astarlanmış kurbağa anestezisi. Su ile küçük bir tank içinde enjekte kurbağa tutun. 10 dakika sonra, başarılı bir anestezi kurbağalar, bu yanıt vermeyen beri üzerinde çevirerek anestezi kurbağa kontrol edin. Anestezi eksik ise, tanka buz ekleyin ve 10 dakika daha bekleyin. Silin nemli sırt yatma küçük tank ve yerden kurbağa Pick up. Forseps ve küçük cerrahi makas kullanarak, cilt çimdik ve orta hatta lateral karın, alt kısmında küçük bir kesi (2 cm) yapmak. Diğer tarafında başka bir kesi yapmak. Cildi kestikten sonra, kas tabakası wi kaldırıninci forseps kas tabakasında kesi yapmak ve. Kas tabakası kesilir sonra yumurtalık gözlemleyin ve forseps kullanarak kesiler gelen yumurtalık çekin. Aktarım MBS çözeltisi ile 50 ml tüp yumurtalık ekstre edilmiştir. NOT: Her iki kesiler mümkün olduğunca çok yumurtalık toplamaya çalışın. Sonraki uygun bertarafı için dondurma ardından kansız bırakılarak kadın kurbağa, katliam. Kan yıkanarak kadar MBS + PS ile ekstre yumurtalık birkaç kez durulayın. Ardından, PS MBS içeren + 9 cm Petri kabı yumurtalık aktarmak NOT: Bu noktada bir mikroskop altında oosit kalitesini kontrol edin. Oosit, hayvan yarısı (Şekil 1A) düzensiz pigmentasyon ile oosit olarak görünüşte kötü kalite, varsa, daha fazla işlemek ve bunun yerine yeni bir yumurtalık elde değil. İdeal olarak, oosit eşit pigmentli hayvan hemisfer ve yaklaşık eşit büyüklükte olmalıdır. Küçük parçalar halinde yumurtalık Tease(1-2 cm2) ve yeni bir 50 ml tüp içinde oosit 5 ml toplar. MBS + PS ile yırtık yumurtalık 5 ml birkaç kez durulayın ve 15 ml MBS + PS ekleyin. Yumurtalık süspansiyon defolliculation için enzimin 7 birimleri ekleyin (Malzeme Listesi'ne bakın). Not: GKD 2 O, 10 ml (28 birim / ml) ile liyofilize enzim sulandırın. Ara sıra nazik bir döndürme ile buz üzerinde 30 dakika boyunca şişe yerleştirin. Kullanılana kadar -80 ° C'de kısım 250 ul saklayın. Yumuşak (yaklaşık 0.014 x g eşdeğer 15 devir / dakika, en hızı) bir karıştırıcı üzerinde çalkalayarak 1 saat süreyle enzim ile yumurtalık parça inkübe edin. NOT: folikül hücreleri, 2 saat enzim normalde gerekli olan min inkübasyon 15 saat 2 neredeyse tamamen kaldırılması için. Daha uzun inkübasyon oosit nükleer transfer deney 16 için gereklidir. 1 saat inkübasyondan sonra, MBS içeren 6 cm Petri kabı küçük tedavi oosit sayısı (10-20 oosit) ve transfer pick up + PS EXTE kontrolbir tahlil mikroskobu altında defolliculation nt. Oosit birbirinden ayrılmış ve en azından kısmen (Şekil 1B) defolike ise, hemen bir sonraki durdurma reaksiyonu (aşama 18) devam edin. Oositler hala ağır folikül hücreleri tarafından çevrelenmiş ise, en fazla bir ilave 15 dakika boyunca inkübe edin. Reaksiyonu durdurmak ve süpernatant atmak için MBS + PS bol ekleyin. 10 kez yıkama tekrarlayın. Not: ancak doğrudan oosit, bir 50 ml tüp çeperine dökülerek MBS + PS ekleyin. MBS + PS süspansiyon sonra, küçük olgunlaşmamış oosit yıkama tamponu üstündeki şamandıra ve küçük yüzen oosit atmak için eğilimindedir. Yıkandıktan sonra, PS MBS içeren + 9 cm Petri kabı transfer NOT: Bu adım itibaren, 16-18 ° C'de mümkün olduğunca oosit tutmak itibaren. Bu sıcaklık kontrollü bir sahnede oosit içeren çanak tutarak yapılabilir. Dumont'un sınıflamasına göre evre VI oosit seçinMBS + PS Oosit transferi içeren yeni 9 cm Petri sonraki kullanımlar ve transferi için uygun bir uç boyutu (oosit boyutundan daha büyük) bir cam pipet kullanılarak yapılabilir. NOT: Kaliteli oosit hayvan yarımkürede ve bitkisel yarımkürede arasında açık kontrast bir eşit pigmentli hayvan yarımkürede olmalıdır ve yaklaşık eşit (Şekil 1C) boyutta olması. Sahne VI oosit tam (oosit çapı yaklaşık 1.2-1.4 mm) progesteron yanıt verebilir oosit yetiştirilen temsil eder. Oositlerine antisens oligonükleotidler veya mRNA 2. Enjeksiyon NOT: Bu bölümde tüm adımlar sıcaklık kontrollü sirkülasyon su veya buz dolu bir plastik kutu üzerinde donatılmış bir mikroskop sahnede 16-18 ° C'de yapılmalıdır. Mikro-enjeksiyon yapılan edilecektir MBS + PS ile dolu yeni bir 9 cm Petri için, içine 200-300 seçilen oositlerin transferi. NOT: EAC olarakh durumu, 200-300 oosit normal kullanılmaktadır. Toplam olarak, yaklaşık 1000 oositler bir deneyde kullanılmıştır. Antisens oligo veya mRNA enjeksiyon hazırlamak için, bir mikropüskürtücü metal pistonunu çıkarın. Şırınga kullanılarak, mineral yağı ile bir cam kılcal doldurun ve mikroenjektör metal pistonun yağ ile dolu cam kılcal yerleştirin. NOT: Bir cam kılcal mikropipet çektirmesi ile çekilir. Bu iğneler ipuçları zarar vermeden bir kutuda muhafaza edilir. Mümkün olduğunca enjeksiyon için küçük çaplı ucu gibi amaçlayan bir mikroskop altında küçük cerrahi makas kullanarak iğne ucu kesin. NOT: İğne ucu mikro dövme veya mikropipet beveler kullanılarak bilenmiş edilebilir. 25 ° 'lik bir açıyla iğne konik için oosit duvarına geçen kapasitesini artırır. Diseksiyon mikroskobu sahnede Parafilm küçük bir şerit yerleştirin ve antisens oligo veya mRNA çözümün bir 3 ul damla dağıtmak. Ti Taşıçözeltinin küçük bir damlacık içine enjeksiyon iğnesinin p hem çözeltisi ile iğne doldurmak enjekte edilecek. NOT: Enjeksiyon iğne ucu kadar küçük olursa, hava kabarcıkları, metal piston ucunda görünmelidir. Ardından, bu olmaz kadar enjeksiyon iğnesi üzerinde büyük bir ipucu yapmak. Yaklaşık 0,5 mm uzakta ucundan bir iğne işaretleyin. Bu işaret enjeksiyon derinliği bir göstergesi olarak kullanılmaktadır. Yavaşça enjeksiyon sırasında istenmeyen oosit hareketini önlemek için forseps ile enjeksiyon noktasına oosit karşı tarafına tutarak (torbacığı altında) oosit merkez noktasına yönelik ekvator sınır boyunca bir oosit içine iğne ucu yerleştirin . NOT: folikül hücreleri (Şekil 1B) serbest alanını bulun ve hatta ince iğne genellikle folikül hücreleri tabakası nüfuz edemez çünkü o noktadan iğneyi. 4.6 ng / 4.6 nl veya Karşıtları 9.2 ng / 9.2 nl Çıkarense oligolar ya da ayak anahtarı kullanarak mRNA uygun bir hacmi (13.8 ng 250 mikrogram) verilmiştir. Antisens oligo üretimine ilişkin ayrıntılı bilgi 7'de tarif edilmektedir. % 0.1 BSA ile takviye edilmiş MBS + PS ile doldurulmuş bir 6 cm Petri için enjekte oosit aktarın (Oosit kuluçka ortamı, bir 0.45 mikron gözenek filtresi kullanılarak çözelti sterilize). 16 yaşında oosit inkübe ° C veya 1-2 gün süreyle 18 ° C. Not: Enjekte edilen oositler, bu durumda 4.6 ng antisens oligo enjeksiyon tercih edilir, enjeksiyondan sonra in vitro olgunlaşması birkaç saat tabi tutulabilir. Genel bir kural sonraki embriyonik gelişim daha iyi, kuluçka dönemi kısadır olmasıdır. OOSİT Vitro Olgunlaşma (IVM) 3. Oosit olgunlaştırma deney akşamı, ° C derin dondurucuda -80 progesteron stok solüsyonu (etanol içinde 30 mM) getirme ve oda tem de çökeltilerin çözünmesizaman zaman girdap ile lığı. Not: progesteron hazır normalde 1 saat 30 dakika için oda sıcaklığında bırakılmıştır. (, 3 uM progesteron nihai konsantrasyon Olgunlaştırma ortamı) ile aynı çözelti içinde progesteron dağıtmak için 30 dakika boyunca bir karıştırıcı üzerinde çalkalayın MBS + PS 50 ml progesteron stoklar 5 ul ekle. In vitro olgunlaşması tedavisi için agaroz kaplı 6 cm yemekler hazırlayın. Magnezyum ve kalsiyum olmadan 1x MBS 50 ml agaroz 1 gr. Bir mikrodalga içinde ısıtılarak agaroz içinde çözülür. Yemekler alt kapak 6 cm tabaklara agaroz bir çözelti küçük bir hacme dökün. Katılaşma gerçekleşene dek 30 dakika boyunca en az bekleyin. NOT: Agaroz kaplama yemekleri oosit yapışmasını önler. Bir kez sıkıca yemekleri bağlı in vitro olgunlaştı oosit, bu oosit onlar dis gelen dekolmanı sırasında aldığınız uyaranlarla aktive olacağı muhtemeldirhes. Olgunlaşma orta 5-8 ml yemekleri agaroz kaplı ve her 6 cm yemekleri içine 200-300 oosit transfer dökün. NOT: oosit inkübasyon ortamı az miktarda oosit aktarmak için deneyin. 16 ° C'de 16 saat inkübe edilir. NOT: Örneğin, 17:00 de tedaviye başlamak ve ertesi gün 09:00 de bitirmek. 4. İntrasitoplazmik Sperm Enjeksiyonu (ICSI) Dondurulmuş sperm stok hazırlama Not: Aşağıdaki sperm hazırlama oosit olgunlaşma deney başlamadan önce yapılmalıdır, ve dondurulmuş sperm stokları ICSI için -80 ° C'de tutulur. Yağ çekme hariç, adımları 1,4-1,11 takip ederek bir erkek kurbağa testis toplayın ve kesiler forseps kullanarak ve yağdan testislerin çıkarılması dışarı testisler. 1x Marc Modifiye Ringers (MMR, 100 mM NaCI, 2 mM KCI, 1 mM MgSO 4, 2 mM CaCI2, 5 mM HEPES, pH 7.4) içinde testisler yıkayın. Yağın bir çıkarınforseps kullanarak kalan kan damarlarını kaldırarak temiz bir kağıt mendil üzerine yıkanmış testisler haddeleme tarafından d kan damarları. 1x MMR 1 ml ihtiva eden bir 3.5 cm Petri için, her testis yerleştirin. Ince makas ile uzunlamasına kesin ve hiçbir büyük parçalar kalmayıncaya kadar forseps ile küçük parçalar halinde gözyaşı. Pipet yukarı ve 1 ml'lik plastik olan ucu kesilir ucu ve yük cam homojenleştirici içine ezilmiş testis solüsyonu 1 ml kullanarak aşağı. 2-3 vuruş bunları homojen ve daha sonra 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne en bağlanmış bir 50 mikron gözenek filtresi üzerine dökün. Çözelti filtre üzerinden gitmek için izin. 1x MMR 1 ml kalan kesim testis resuspending adımı yineleyin 4.1.7. Son olarak, 1x MMR ile homojenleştirici birkaç kez yıkayın ve filtreden geçirin. Tekrar bir 15 ml santrifüj tüpüne diğer testis ve havuz iki testis için 4.1.8 için 4.1.5 adımları. 4 800 x g'de hücreleri Spin6; 20 dakika işleme sokuldu. Süpernatantı atın ve 1x MMR 2 ml pelet hücreleri tekrar süspansiyon. Daha sonra, yeni bir tüpe aktarılır. NOT: görünür kan hücreleri mevcut olduğundan emin olun. 14 ml ultra net santrifüj tüpüne bir adım degrade hazırlayın. Alt tabaka:% 30 iyodiksanol 4 ml. İkinci alt tabaka:% 20 iyodiksanol 1 ml. Üçüncü alt tabaka:% 12 iyodiksanol 5 ml. Üst katman: 1x MMR 2 ml hücreleri testis. (Alt faz rahatsız değil yavaş yavaş bindirmek) 1 ml pipet ile çok nazikçe geçişlerini Yerleşimi. NOT:% 30 iyodiksanol Sadece bir katman da sadece sperm izole etmek için çalışması gerekir. (Ara vermeden yavaşlama), 15 dakika boyunca 4 ° C'de 10,000 x g'de ultrasantrifüj kullanarak SW40 rotor içinde spin. Yavaşça ultrasantrifüjdeki tüpü çıkarın. Gradyan her bir katmanı ve altında bulunan pelet arasında bir ara kontrol edin. Pelet sperm fraksiyonu toplayın. Sperm Pel yeniden süspanseiyodiksanol dışarı yıkamak için 1x MMR izin. 20 dakika boyunca 4 ° C'de 800 x g'de spin. NOT: sperm bir sürü hala 4 ° C'de 3,220 x g'de yüzer madde 20 dakika için spin, yeniden dönüş sonra süspansiyon kalır ve topak haline sperm havuz varsa. Süpernatant atılır ve 1x Nükleer hazırlanması 1 ml tampon sperm pelletini (NPB 250 mM sukroz, 0.5 mM spermidin trihidroklorit, 0.2 mM Spermin, tetrahidroklorür, 1 mM EDTA, 15 mM HEPES, pH 7.7), 13. Daha sonra, bir Eppendorf tüpüne aktarılır. 50 mg / ml 1 x NPB (DMSO içinde yeniden süspanse Digitonin'dir toz içinde 50 ila 10 mg arasında ul / ml Digitonin'dir solüsyonu eklenir ve -80 ° C'de alikot dondurma. Önce kullanımı, 10 mg, 50 mg / ml lik bir seyreltik / ml 1x NPB. 10 mg / ml Digitonin'dir dondurulmuş ve -20 ° C'de ve yeniden kullanılabilir) sperm çözeltisi 1 ml saklanabilir Kullanılmayan. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir. DAPI boyama (bir fina olarak 0.3 ug / ml DAPI tarafından permeabilizasyon hızını kontroll konsantrasyonu). Hücrelerin daha az% 95 geçirgenleştirildi ise, biraz daha uzun kuluçkaya yatmaktadır. NOT: Çok sayıda sperm hücreleri (sperm birden testis toplanan özellikle) aynı anda inkübe edilir Bazen, eğer bu durumda Digitonin'in ek bir küçük bir miktar eklemek gerekebilir, geçirgenliği zordur; sperm% 20 permeabilize takdirde, örneğin Digitonin'in ek 20 ul ilave edilir. % 3 nihai bir konsantrasyona kadar% 10 BSA eklenerek geçirgenliği durdurun. 4 ° C'de hücreler dönerler. NOT: 5 dakika boyunca 100 x g ile başlayarak mümkün olduğu kadar az santrifüj hızı deneyin. Yeterli değilse, hız ve / veya süresini arttırmak. Aşama 4.1.22 ile aynı hızda% 0.3 1x NPB BSA ve santrifüj ile hücreler yıkanır. Bu arada, sperm Depolama tamponu hazırlamak (SSB 2x NPB 2 ml,% 10 BSA, gliserol otoklava 1.2 ml, H2 O 680 ul 120 ul). Sperm SSB 500 ul ekleyinpelet. Yukarı ve aşağı Pipet birkaç kez hücrelere zarar vermemek için bir kesim ucu ile tekrar süspansiyon. 4 ° C'de bir gece boyunca dengelenmeye bırakın. Yukarı ve bir kesim ucu ile birkaç kez aşağı hücreleri pipetle. Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak için 10 kez 1x MMR veya 1x PBS içinde mikrolitre birkaç seyreltin. Tek kullanımlık alikotları -80 ° C'de 30.000 sperm / ul (veya daha yüksek) doğrudan -80 ° C'de ve mağaza alikotları olarak dondurun. In vitro ICSI oosit olgunlaştı NOT: oosit içeren tüm süreçler 16-18 ° C'de yapılmalıdır. Olgunlaştı oosit aktarmak için bir cam pipet hazırlayın. NOT: Cam pipet yeterince geniş sıkma yapmadan oosit karşılamak için olmalıdır. Onaltı saat progesteron içeren ortamda oosit hareket ettikten sonra, Transfer yıkama MBS + PS ile doldurulmuş bir 6 cm agaroz kaplı çanak içine oosit olgunlaşması. Not: Daha da önemlisi, m,Nativ oosit son derece dikkatli bir şekilde tedavi edilmelidir. Oosit Kaba tedavi sperm enjeksiyonu öncesi spontan aktivasyonu neden olabilir. Germinal vezikül dökümü (Şekil 2) ima beyaz lekelerin görünümünü, onaylayarak olgunlaştı oosit sayın. Olgunlaşma oranı% 80'den az ise, daha analizler için embriyo hayatta yeterli sayıda elde etmek mümkün değildir. NOT: Kalan folikül hücreleri oosit olgunlaşması sonra soyulmuş (Şekil 2). Enjeksiyon ortamı ile doldurulmuş yeni bir agaroz kaplı 6 cm'lik tabağı MBS yıkama transfer oosit (: Ficoll (% 6), 30 g, 20 10 x MMR mi ve 1,000x PS stokunun 500 ul, 500 ml hazırlayın). ICSI başlamadan önce en az 30 dakika inkübe edilir. Adımlarda 2.2-2.4 açıklandığı gibi Mikroenjektör ayarlayın. Not: enjeksiyon iğnesinin ucu boyutu adım 2.6 de tarif edilen prosedür takip edilerek mümkün olduğu kadar küçük tutulur. çapiğne 20-40 mm. Verimli enjeksiyon izin verebilir adım 2.4 açıklandığı gibi iğne ucu konik için. Sperm kısım Al ve sperm Seyreltme Tamponu (SDB, 250 mM sukroz, 75 mM KCI, 0.5 mM spermidin, 0.2 mM spermin, 200 uM HEPES pH 7.5) içinde, sperm süspansiyonu seyreltin. Not: bir iğne boyutu ve bu yüzden bağlı Seyreltme değişebilir. Ilk denemede olarak 30.000 sperm / ul stokunun 120 kez sulandırmak ve gerekirse daha ayarlayın. Diseksiyon mikroskobu sahnede Parafilm küçük bir şerit yerleştirin. Pipetleme sperm enjeksiyonu çözüm karıştırın ve sperm solüsyonu birkaç damla ul dağıtmak. , Iğne içine seyreltilmiş sperm süspansiyon Suck bir mikroskop lamı üzerine 0.3 ug / ml DAPI içeren 10 ardışık damla içine 4.6 nl enjekte ve hızlı bir floresan mikroskop enjeksiyon başına teslim sperm sayısını. NOT: enjeksiyon başına 1-2 sperm hedefliyoruz. Gerekirse, daha fazla sperm enjeksiyonu çözümü sulandırmakve istenen konsantrasyon elde kadar tekrar enjeksiyon başına sperm sayısını kontrol edin. Test enjeksiyon çözüm çıkarın ve uygun bir konsantrasyon ile yeni bir sperm enjeksiyonu çözümü doldurun. 100 olgunlaşmış oositlerin sperm çözeltisi 4.6 nl enjekte edilir. NOT: Sürekli çözüm enjekte etmek önemlidir. İlk 4.6 nl (normalde 1-2 sn) püskürtülmesi için gerekli süreyi belirlemek. Aşağıdaki işlemi tekrarlayın; Bir oosit enjekte, bir oosit enjekte birkaç saniye bekleyin, enjeksiyon çözeltisi içinde bir iğne ve sahte-enjeksiyon kaldırmak, bir kaç saniye bekleyin. Bu sürekli enjeksiyonu da iğne ucu tıkanmasını engeller. Seçenek olarak ise, bir pompa kullanılarak bir yöntem 13 kullanılabilir. Yaklaşık 100 enjeksiyon, kalan sperm çözüm çıkarmak ve (dağıtım önce yukarı ve aşağı aynı sperm çözümü kullanın, ancak pipet) sperm çözümü yeniden doldurun. NOT: İğne iyi sperm çözümü emmek yoksa, ihtiyaç ucunu kestile. Bu durumun iyileştirilmesi değil, yeni bir iğne hazırlayın. Tüm oosit enjekte kadar enjeksiyon işlemi tekrarlayın. NOT: oosit kalitesi iyi ve enjeksiyon başarılı olursa, enjekte edilen oositlerin daralma enjeksiyon süresi 20 dakika içinde görülür. 16 ° C veya 18 enjekte yemekler taşı   C inkübatör °. 4-5 saat enjeksiyonundan sonra, ICSI embriyoların bölünme oranını kontrol edin. NOT: Bu embriyoların yarılması oluklar, normal döllenmiş embriyo gibi net olmayabilir. Bazı embriyolar aynı zamanda birden fazla sperm enjeksiyonu sebep olabilir anormal bölünmelere, göstermektedir. Kuluçka ortamına anormal yarılan embriyon transferleri de bölünen embriyolar (500 mi hazırlayın: Ficoll (% 4), 5 10x MMR mi ve 1,000x PS stokunun 500 ul 20 g) eklenmiştir. 16 ya embriyolar inkübe   Gecede ° C veya 18 ° C inkübatör. Ertesi sabah, transfer Embryve 0.1x MMR ile os embriyolar hayatta saymak. Ortalama olarak, sperm-oosit enjekte yaklaşık 10% yüzme iribaş aşamasında (Şekil 3A) gelişebilir.