Manipulation et<em> In Vitro</em> Maturation du<em> Xenopus laevis</em> ovocytes, Suivi par injection intracytoplasmique de spermatozoïdes, pour étudier le développement embryonnaire

REMARQUE: Tous expérimentation de grenouilles a été réalisée exigences du Home Office britannique suivante. 1. Préparation des ovocytes de Xenopus laevis Environ une semaine avant le prélèvement d'ovocytes, injecter grenouilles femelles avec 150 U de jument gravide gonadotrophine sérique (PMSG) de pré-amorçage en utilisant une seringue stérile ml avec une aiguille 27 G. L'injection est effectuée en sous-cutané dorsal lymphatique sac. NOTE: Il est optimale à utiliser grenouilles qui ne pondent des œufs pendant une longue période (au moins plus de la moitié année) ou qui ne ont jamais pondu avant. Magasin grenouilles pré-amorcée dans un réservoir d'eau fixé à 18 ° C dans la chambre contrôlée de la lumière (7 heures-19 heures: on, 19 heures-7 heures: off). Le jour de la collecte des ovocytes, préparer 1 L de 1x modifiés Solution (MBS) de Barth de 10x MBS stocks en diluant avec de l'eau distillée deux fois (ddH 2 O), et ajouter de la pénicilline et de la streptomycine à la concentration finale de 10 pg / mlchacun (MBS + PS). 10x MBS stocks se compose de 880 mM de NaCl, 10 mM de KCl, 24 mM NaHCO 3, 4 mM MgSO 8,2 7H 2 O, 3,3 mM de Ca (NO 3) 2, 4H 2 O, 4,1 mM CaCl 2, 6H 2 O, 100 mM d'HEPES, pH 7,5. Anesthésier une grenouille pré-amorcée par injection sous-cutanée de 120 mg (dans 400 pi) de tricaïne méthanesulfonate (MS222). Gardez la grenouille injecté dans un petit réservoir avec de l'eau. Après 10 minutes, vérifiez la grenouille anesthésié en le retournant avec succès depuis grenouilles anesthésiés ne répondent pas à cette question. Si l'anesthésie est incomplète, ajouter de la glace dans le réservoir et attendre un autre 10 min. Ramassez la grenouille du petit réservoir et le lieu en décubitus dorsal sur une humide essuyez. En utilisant des pinces et un petits ciseaux chirurgicaux, pincez la peau et faire une petite incision (2 cm) dans la partie inférieure de l'abdomen, en dehors de la ligne médiane. Faire une autre incision de l'autre côté. Après avoir coupé la peau, soulever la couche musculaire wie pinces et faire l'incision dans la couche musculaire. Observez l'ovaire après la couche musculaire est coupé et tirez l'ovaire à partir des incisions à l'aide de forceps. Transfert extrait ovaire à un tube de 50 ml avec une solution de MBS. REMARQUE: Essayez de recueillir autant que possible de l'ovaire deux incisions. Abattre la grenouille femelle par exsanguination, suivie par la congélation pour élimination ultérieure appropriée. Rincer l'ovaire extrait plusieurs fois avec MBS + PS jusqu'au sang est emporté. Ensuite, transférer l'ovaire à un plat 9 cm de Pétri contenant MBS + PS NOTE: Vérifier la qualité des ovocytes sous un microscope de dissection à ce point. Si ovocytes sont apparemment mauvaise qualité, tels que des ovocytes avec la pigmentation inégale dans la moitié des animaux (figure 1A), ne pas traiter plus loin et obtenir une nouvelle place ovaire. Idéalement, les ovocytes doivent avoir hémisphères animales aussi pigmentées et être approximativement de même taille. Taquiner l'ovaire en petits morceaux(2.1 cm 2) et recueillir 5 ml d'ovocytes dans un nouveau tube de 50 ml. Rincer 5 ml de l'ovaire déchiré quelques fois avec MBS + PS et ajouter MBS + PS à 15 ml. Ajouter 7 unités de l'enzyme pour defolliculation à la suspension de l'ovaire (voir liste des matières). REMARQUE: Reconstituer enzyme lyophilisée avec 10 ml d'ddH 2 O (28 unités / ml). Placer le flacon pendant 30 minutes sur la glace avec remuant doucement occasionnelle. Aliquote de 250 pi et conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation. Incuber la pièce ovaire avec l'enzyme pendant 1 heure en agitant doucement sur l'agitateur (vitesse à 15 tr / mn, ce qui équivaut à environ 0,014 xg). REMARQUE: Pour l'élimination presque complète des cellules folliculaires, 2 h à 2 h 15 min d'incubation avec l'enzyme est normalement nécessaire. Incubation plus longue est nécessaire pour l'expérience ovocyte de transfert nucléaire 16. Après une heure d'incubation, ramasser un petit nombre d'ovocytes traités (10-20 ovocytes) et le transfert à une boîte de Pétri de 6 cm contenant MBS + PS Vérifiez la extent de defolliculation sous un microscope à dissection. Si ovocytes sont séparées l'une de l'autre et au moins partiellement défolliculés (figure 1B), procéder immédiatement à la réaction d'arrêt suivant (étape 18). Si ovocytes sont encore fortement entourés de cellules folliculaires, incuber pendant 15 minutes supplémentaires au maximum. Ajouter beaucoup de MBS + PS pour arrêter la réaction et jeter le surnageant. Répétez le lavage pour 10 fois. REMARQUE: Ajouter MBS + PS en versant à la paroi d'un tube de 50 ml, mais pas directement sur les ovocytes. Après suspension dans MBS + PS, petits ovocytes immatures ont tendance à flotter au sommet du tampon de lavage et jeter ces petits ovocytes flottants. Après les lavages, transférer dans un plat de 9 cm de Pétri contenant MBS + PS NOTE: A partir de cette étape en avant, garder ovocytes à 16-18 ° C, autant que possible. Ceci peut être effectué en maintenant le récipient contenant les ovocytes sur un étage à température contrôlée. Sélectionnez scène VI ovocytes selon la classification de Dumontpour des utilisations ultérieures et le transfert à un nouveau plat 9 cm de Pétri contenant MBS + PS de transfert des ovocytes peut être fait en utilisant une pipette en verre avec une taille de la pointe appropriée (plus grand que la taille de l'ovocyte). REMARQUE: Bon ovocytes de qualité devraient avoir un hémisphère animal uniformément pigmentés avec un contraste évident entre l'hémisphère animal et l'hémisphère végétatif, et être à peu près également de taille (figure 1C). Scène VI représentent ovocytes ovocytes qui peuvent répondre à la progestérone complètement développés (diamètre est d'environ 1/2 à 1/4 ovocyte mm). 2. Injection d'oligonucléotides antisens ou de l'ARNm dans des ovocytes NOTE: Toutes les étapes de cette section doivent être effectuées à 16-18 ° C sur une scène de microscope équipé d'une circulation d'eau à température contrôlée ou sur une boîte en plastique rempli de glace. Transfert 200-300 ovocytes sélectionnés dans un nouveau plat 9 cm de Pétri remplie avec MBS + PS, dans lequel la micro-injection sera effectuée. NOTE: Dans each condition, 200-300 ovocytes sont normalement utilisés. Au total, environ 1 000 ovocytes sont utilisés dans une expérience. Pour la préparation de l'injection d'oligos antisens ou ARNm, éjecter le plongeur métallique d'un micro-injecteur. Remplir un tube capillaire en verre avec de l'huile minérale en utilisant une seringue et insérer le tube capillaire en verre rempli d'huile au piston de métal de micro-injecteur. NOTE: Un capillaire en verre est tiré par micropipette extracteur. Ces aiguilles sont conservés dans une boîte sans endommager conseils. Coupez la pointe de l'aiguille à l'aide de petits ciseaux chirurgicaux sous un microscope en visant que la pointe de petit diamètre pour l'injection que possible. NOTE: La pointe de l'aiguille peut être affûtée en utilisant une forge ou micropipette micro chanfreiner. Pour biseau de l'aiguille à un angle de 25 ° permet d'améliorer la capacité de pénétrer la paroi de l'ovocyte. Placer une petite bande de Parafilm sur la scène d'un microscope à dissection et distribuer une baisse de 3 pi de l'oligo antisens ou solution ARNm. Déplacez le tip de l'aiguille d'injection dans la petite gouttelette de solution et de remplir l'aiguille avec la solution à injecter. NOTE: Si la pointe de l'aiguille d'injection est trop petite, les bulles d'air doivent apparaître au bout de la tige de métal. Ensuite, faire une plus grande pointe sur l'aiguille d'injection jusqu'à ce ne est pas. Marquez l'aiguille d'injection d'environ 0,5 mm de la pointe. Cette marque est utilisé comme un indicateur de profondeur d'injection. Insérer la pointe de l'aiguille dans un ovocyte long de la limite équatorial en visant à la pointe de l'ovocyte centrale (en dessous de la vésicule germinale) tout en maintenant doucement le côté opposé de l'ovocyte au point d'injection avec une pince pour empêcher un mouvement de l'ovocyte indésirable lors de l'injection . REMARQUE: Trouver la zone libre de cellules folliculaires (figure 1B) et insérer l'aiguille de cet endroit car même une aiguille fine ne peut pas pénétrer souvent une couche de cellules folliculaires. Ejecter 4,6 ng / nl 4,6 ou 9,2 ng / 9,2 nl d'antisoligos ense, ou un volume approprié de l'ARNm (250 pg à 13,8 ng) en utilisant la pédale. Détails de préparation antisens oligo sont décrits dans 7. Transférer les ovocytes injectés dans un plat 6 cm de Pétri remplie avec MBS + PS complété avec 0,1% de BSA (milieu d'incubation des ovocytes; stériliser la solution en utilisant un filtre de 0,45 um des pores). Incuber les ovocytes à 16 ° C ou 18 ° C pendant 1-2 jours. NOTE: Injection d'ovocytes peuvent être soumis à maturation in vitro de plusieurs heures après l'injection, dans ce cas, l'injection de 4,6 ng oligos antisens est préférable. Une règle générale est que plus la période d'incubation est, meilleure est la suite du développement embryonnaire. 3. maturation in vitro (MIV) d'ovocytes Le soir de l'expérience de la maturation de l'ovocyte, chercher la solution de progestérone stock (30 mM dans l'éthanol) à partir de -80 ° C congélateur et dissoudre précipités à temtempérature avec vortex occasionnel. NOTE: La progestérone stock est normalement laissé à température ambiante pendant 30 min à 1 h. Ajouter 5 ul de la progestérone actions dans 50 ml de MBS + PS (moyenne maturation; la concentration finale de la progestérone à 3 uM) et agiter sur l'agitateur pendant 30 min à distribuer la progestérone dans la solution aussi. Préparer boîtes de 6 cm d'agarose revêtues pour vitro un traitement de maturation. Ajouter 1 g d'agarose à 50 ml de MBS 1x sans magnésium et calcium. Dissoudre l'agarose par chauffage dans un four micro-ondes. Pour un petit volume de la solution d'agarose pour boîtes de 6 cm pour couvrir le fond de la vaisselle. Attendez au moins 30 min jusqu'à ce que la solidification. REMARQUE: revêtement Agarose empêche le collage des ovocytes aux plats. Une fois dans les ovocytes in vitro maturation sont fermement attachés à la vaisselle, il est fort probable que les ovocytes sont activés par des stimuli qu'ils reçoivent lors du détachement de dishes. Versez 5-8 ml de milieu de maturation aux plats agarose-revêtir et transférer 200-300 ovocytes dans chacun boîtes de 6 cm. REMARQUE: Essayez de transférer des ovocytes avec une quantité minimale de milieu ovocyte d'incubation. Incuber pendant 16 heures à 16 ° C. REMARQUE: Par exemple, commencer le traitement à 17:00 et finir à 9 heures le lendemain. 4. injection intracytoplasmique de spermatozoïdes (ICSI) Sperme congelé stocks préparation NOTE: La préparation de sperme suivante devrait être fait avant de commencer l'expérience de maturation de l'ovocyte, et les stocks de sperme congelés sont conservés à -80 ° C pour l'ICSI. Recueillir les testicules d'un grenouille mâle en suivant les étapes 01.04 à 01.11, sauf pour tirer la graisse et les testicules à partir des incisions à l'aide des pinces et enlever les testicules de la graisse. Laver les testicules en 1x modification de Marc Ringers (MMR, 100 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 1 mM de MgSO 4, CaCl 2 2 mM, HEPES 5 mM, pH 7,4). Retirer une matière grassed vaisseaux sanguins par laminage les testicules lavé sur un mouchoir en papier propre, puis en retirant restants vaisseaux sanguins en utilisant une pince. Placez chaque testicule dans un plat de 3,5 cm de Pétri contenant 1 ml de 1x ROR. Couper longitudinalement avec des ciseaux fins et déchirer en petits morceaux avec des pinces jusqu'à ce qu'aucun gros morceaux restent. Pipette de haut en bas en utilisant la pointe de 1 ml en plastique dont l'extrémité est coupé, et la charge 1 ml de la solution de testicules écrasés dans un homogénéisateur en verre. Homogénéiser par les accidents vasculaires cérébraux et 3/2 puis verser la solution sur un filtre à pores de 50 um attaché au sommet d'un tube de 15 ml de la centrifugeuse. Laisser la solution de passer par le filtre. Répétez l'étape 4.1.7 en remettant en suspension le testicule de coupe restant dans 1 ml de 1 x MMR. Enfin, laver l'homogénéisateur une couple de fois avec 1x MMR et le passer à travers le filtre. Répéter les étapes 4.1.5 à 4.1.8 pour les testicules et l'autre piscine deux testicules dans une 15 ml tube de centrifugation. Faites tourner les cellules à 800 g à 46; C pendant 20 min. Jeter le surnageant et remettre le culot cellulaire dans 2 ml de 1x ROR. Ensuite, transférer dans un nouveau tube. NOTE: Assurez-vous qu'aucun globules visibles sont présents. Préparer un gradient de l'étape dans un tube de centrifugeuse ultra-clair 14 ml. Couche inférieure: 4 ml de 30% iodixanol. Deuxième couche de fond: 1 ml de 20% iodixanol. Troisième couche de fond: 5 ml de 12% iodixanol. Couche supérieure: testicule cellules dans 2 ml de 1x ROR. Superposez les gradients très doucement avec une pipette de 1 ml (superposer lentement pour ne pas perturber la phase inférieure). REMARQUE: Juste une couche de 30% iodixanol devrait également fonctionner pour isoler le spermatozoïde seulement. Spin dans le rotor SW40 utilisant ultracentrifugation à 10 000 g à 4 ° C pendant 15 min (décélération sans interruption). Retirez délicatement le tube de l'ultracentrifugation. Confirmer une interface entre chaque couche du gradient et le culot au fond. Recueillir la fraction de sperme à partir du culot. Remettre en suspension le sperme pellaisser entrer 1x MMR pour lavage iodixanol. Centrifuger à 800 xg à 4 ° C pendant 20 min. NOTE: Si beaucoup de sperme restent dans la suspension après le spin, re-spin le surnageant à 3220 g à 4 ° C pendant 20 min et piscine le sperme granulés. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot de spermatozoïdes dans 1 ml de tampon de préparation 1x nucléaire (NPB, 250 mM de saccharose, 0,5 mM de spermidine trichlorhydrate, 0,2 mM tétrachlorhydrate de spermine, EDTA 1 mM, HEPES 15 mM, pH 7,7) 13. Ensuite, transférer dans un tube Eppendorf. Ajouter 50 ul de 10 mg / ml solution Digitonine en 1x CNLC (poudre Resuspendre Digitonine dans du DMSO à 50 mg / ml et congeler des aliquotes à -80 ° C. Avant utilisation, diluer la 50 mg / ml aliquote à 10 mg / ml avec 1x NPB. Non utilisé 10 mg / ml de digitonine peut être congelé et stocké à -20 ° C et ré-utilisés) à 1 ml de la solution de sperme. Incuber pendant 5 min à température ambiante. Vérifiez un taux de perméabilisation par coloration DAPI (0,3 pg / ml DAPI comme final Concentration). Si moins de 95% des cellules sont perméabilisées, incuber un peu plus longtemps. REMARQUE: Parfois, si un trop grand nombre de spermatozoïdes sont incubés en même temps (en particulier lorsque les spermatozoïdes sont collectés à partir de plusieurs testicules), il est difficile pour perméabiliser, auquel cas il peut être nécessaire d'ajouter une petite quantité supplémentaire de la digitonine; par exemple, si 20% des spermatozoïdes ne sont pas perméabilisée, un 20 ul supplémentaire de Digitonine est ajouté. Arrêtez perméabilisation en ajoutant 10% de BSA à 3% concentration finale. Faites tourner les cellules à 4 ° C. REMARQUE: Essayez aussi peu la vitesse de centrifugation que possible en commençant par 100 g pendant 5 min. Si ne suffit pas, augmenter la vitesse et / ou de temps. Laver les cellules avec 0,3% de BSA dans 1 x NPB et centrifuger à la même vitesse que l'étape 04.01.22. Entre-temps, préparer le tampon de stockage de sperme (SSB; 2 ml de 2x CNLC, 120 ul de 10% de BSA, 1,2 ml autoclave glycérol, 680 pi de H 2 O). Ajouter 500 pi de SSB à du spermePellet. Pipette plusieurs fois haut et bas pour remettre en suspension avec une pointe de coupe afin de ne pas endommager les cellules. Laisser se équilibrer pendant une nuit à 4 ° C. Introduire à la pipette les cellules de haut en bas plusieurs fois avec une pointe de coupe. Diluer quelques microlitres 10 fois dans 1x RRO ou en 1x PBS pour compter les cellules en utilisant un hémocytomètre. Geler sous forme d'aliquotes à 30 000 spermatozoïdes / pi (ou ultérieure) directement à -80 ° C et conserver à -80 ° C en une seule aliquotes d'utilisation. ICSI in vitro maturation des ovocytes REMARQUE: Tous les processus impliquant des ovocytes doivent être effectuées à 16-18 ° C. Préparer une pipette en verre pour transférer ovocytes maturés. NOTE: La pipette en verre doit être suffisamment large pour accueillir ovocytes sans serrer. Seize heures après le déplacement ovocytes au milieu contenant de la progestérone, transfert mûri ovocytes dans un plat d'agarose revêtu 6 cm rempli de MBS + PS pour le lavage. NOTE: Il est important, movocytes atured doivent être traités avec un soin extrême. Manipulation brutale des ovocytes peut induire l'activation spontanée avant l'injection de sperme. Comptez ovocytes maturés en confirmant l'apparition de taches blanches, ce qui implique la rupture de la vésicule germinale (Figure 2). Si le taux de maturation est inférieure à 80%, il est peu probable d'obtenir le nombre suffisant d'embryons survivants pour d'autres analyses. NOTE: les cellules de follicules restants sont détachées après maturation de l'ovocyte (figure 2). ovocytes de transfert de MBS lavage pour un nouveau 6 cm plat agarose revêtu rempli de milieu d'injection (Préparer 500 ml: 30 g de Ficoll (6%), 20 ml de 10x ROR et 500 pi de 1,000x PS stock). Incuber au moins pendant 30 min avant de commencer ICSI. Mettre en place le micro-injecteur comme décrit dans les étapes 2.2 à 2.4. REMARQUE: La taille de l'aiguille d'injection de la pointe est maintenue aussi faible que possible en suivant le mode opératoire décrit à l'étape 2.6. Le diamètrede l'aiguille est de 20 à 40 um. Pour biseauter la pointe de l'aiguille comme décrit dans l'étape 2.4 pourrait permettre l'injection efficace. Extraction de la partie aliquote de sperme et diluer la suspension de spermatozoïdes dans le tampon de dilution du sperme (PSD; 250 mM de saccharose, 75 mM de KCl, 0,5 mM de spermidine, spermine 0,2 mM, HEPES 200 uM, pH 7,5). REMARQUE: La dilution peut être modifiée en fonction d'une taille de l'aiguille et ainsi de suite. Diluer 120 fois de la 30 000 spermatozoïdes / stock ul comme un essai initial et ajuster davantage si nécessaire. Placer une petite bande de Parafilm sur la scène d'un microscope à dissection. Mélanger la solution d'injection de sperme par pipetage et distribuer une goutte peu ul de la solution de sperme. Aspirer la suspension de spermatozoïdes dilués dans l'aiguille, injecter 4,6 nl en 10 baisses successives contenant 0,3 pg / ml DAPI sur une lame de microscope, et compter rapidement le nombre de spermatozoïdes livré par injection sur un microscope à fluorescence. REMARQUE: But 1-2 spermatozoïdes par injection. Si nécessaire, diluer la solution d'injection de sperme pluset vérifier le nombre de spermatozoïdes par injection à nouveau jusqu'à obtenir une concentration souhaitée. Ejecter la solution d'injection de test et de remplir une nouvelle solution d'injection de sperme avec une concentration adéquate. Injecter 4,6 nl d'une solution de spermatozoïdes à 100 ovocytes maturés. NOTE: Il est important d'injecter en continu la solution. Tout d'abord déterminer le temps nécessaire pour éjecter 4,6 nl (normalement 1-2 secondes). Répétez le processus suivant; injecter dans un ovocyte, attendre quelques secondes, retirer une aiguille et maquette injection dans une solution d'injection, attendez quelques secondes, injecter dans un ovocyte. Cette injection continue empêche également le blocage de la pointe de l'aiguille. En variante, le procédé utilisant une pompe 13 peut être utilisée. Après environ 100 injections, éjecter la solution de sperme restant et re-remplir la solution de sperme (utiliser la même solution de sperme, mais pipette de haut en bas avant la distribution). NOTE: Si l'aiguille ne aspire pas la solution de sperme ainsi, couper la pointe de la nécessitéle. Si cela ne améliore pas la situation, préparer une nouvelle aiguille. Répétez le processus d'injection jusqu'à ce que tous les ovocytes sont injectés. NOTE: Si la qualité de l'ovocyte est bon et l'injection est réussie, la contraction des ovocytes injectés est vu dans les 20 min de la durée d'injection. Déplacez les plats injectés à 16 ° C ou 18   ° C incubateur. 4-5 heures après l'injection, vérifier le taux d'embryons ICSI de clivage. REMARQUE: sillons de clivage de ces embryons peuvent ne pas être aussi claires que celles d'embryons fécondés normales. Des embryons montrent également clivages anormales, qui pourraient être causés par l'injection de sperme multiples. Transfert clivé embryons y compris les embryons anormalement clivées à milieu d'incubation (Préparer 500 ml: 20 g de Ficoll (4%), 5 ml de 10x ROR et 500 pi de 1,000x PS stock). Incuber à 16 embryons soit   ° C ou 18 ° C incubateur pendant une nuit. Le lendemain matin, le transfert embryos à 0,1x ROR et compte embryons survivant. En moyenne, environ 10% des ovocytes de sperme injecté peut se développer à l'étape de la natation têtard (figure 3A).