إعداد خلايا منتسب للتصوير الإسفار الأشعة السينية من قبل التثبيت الكيميائية
Summary
Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.
Abstract
X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.
Introduction
الأشعة السينية التصوير مضان يسمح لكل من الهوية وكمية من العناصر الموجودة في عينة لحلها مكانيا. حادث الأشعة السينية، من الطاقة مختارة لتكون أكبر من الإلكترون الطاقة من أعنف عنصر من مصلحة ملزمة، والتغلب على طاقة الربط الإلكترونات الداخلية قذيفة إلى النواة 1. وهذا يخلق "ثقب" في قذيفة الإلكترون. كما الإلكترونات طاقة أعلى تسقط في هذه الثقوب، وتنبعث الفلورسنت الأشعة السينية التي تعتمد على الطول الموجي فصل الطاقة من تلك المدارات. منذ تباعد الطاقة في المدارات هو سمة من عنصر معين، لديه الانبعاثات مضان الأشعة السينية أيضا موجات مميزة، تعتمد على العنصر. هذا هو الانبعاثات في الطول الموجي المميز الذي يتيح التعرف على العناصر الحالية. معايرة كثافة مضان تسمح الكميات من العناصر الحالية.
الأشعة السينية مضان microscopأصبح ص (XFM) تستخدم على نحو متزايد، ويرجع ذلك جزئيا إلى تطوير مصادر السنكروترون الأشعة السينية رائعة جدا، مثل تلك التي في الربيع-8 في اليابان، ومرفق الأوروبي الإشعاع السنكروترون (ESRF) في فرنسا، وفوتون المصدر المتقدم ( APS) في الولايات المتحدة (2). وتوفر هذه المصادر كثافة عالية جدا الحزم الأشعة السينية. في نفس الوقت، وإدخال تحسينات في مجال البصريات والأشعة السينية، مثل تكنولوجيا لوحة منطقة، سمح التركيز من هذه الحزم إلى البقع ميكرون الفرعي، وإن كان غير فعال بدلا 3. مع جدا الحزم عالية الكثافة، حتى كمية صغيرة نسبيا من الضوء الذي يمكن أن تركز كافية لإثارة المعادن الذاتية في الخلايا، وتنتج إشارة التي يمكن قياسها مع التكنولوجيا كاشف المتاحة حاليا. وهكذا، ودراسة البيولوجيا الكيميائية للمعادن في الخلية هي تطبيق واحد على وجه الخصوص أن يجعل من استخدام العديد من التطورات الأخيرة في هذه التقنية 4-10.
هناك العديد من العوامل الحاسمة لأخذها في الاعتبار عند التطبيقالكذب XFM للتحقيق في توزيع الأولي والكمي لخلايا الثدييات مثقف أو عينات بيولوجية أخرى. أولا، تحتاج العينة أن تبقى سليمة من الناحية الهيكلية وفيما يتعلق تكوينها عنصر، وذلك لقياس لتكون ذات مغزى. ثانيا، لا بد من الحفاظ على عينة أيضا في بعض الطريق بحيث يكون هاردي إلى أضرار الأشعة التي يمكن أن تسببها تركيزا شعاع الأشعة السينية. إحدى الطرق التي عينة يمكن تلبية كل من هذه المعايير في آن واحد هو أن يتم تجميدها بسرعة إلى الجسم الزجاجي، والجليد غير متبلور 11،12. كثيرا ما يتم تحقيق التجميد السريع من خلال تقنيات الحفظ بالتبريد مختلفة مثل يغرق تجميد أو ارتفاع ضغط تجميد 13-16. ومن المسلم به عموما أن الحفظ بالتبريد يحفظ العمارة الخلوية الشاملة والتراكيب الكيميائية في العينات البيولوجية أقرب إلى الدولة الأم وقت ممكن. تثبيت الكيميائية، من ناحية أخرى، ويرجع ذلك إلى انتشار بطيء والانتقائي للمثبتات إلى الخلايا والأنسجة كما ثالذراع تغييرات لاحقة كما في نفاذية الغشاء، قد تسمح مختلف أيونات الخلوية وخاصة أيونات إنتشاري مثل الكلور، الكالسيوم وK إلى أن ترشح، المفقودة أو نقلهم، مما يجعل التحقيق في هذه العناصر دون المستوى الأمثل 17-19. وعلى الرغم من ميزة واضحة من البرد التثبيت على تثبيت الكيميائية بشكل عام، لخلايا الثدييات ملتصقة على وجه الخصوص، الحفظ بالتبريد لديها مختلف القيود 20-23. أكثرها وضوحا هو أن ليس كل مختبر البحوث ويسهل الوصول إلى أدوات الحفظ بالتبريد. معظم المجمدات ارتفاع ضغط الحالية أو حتى يغرق المجمدات مكلفة ومملوكة فقط من قبل مجموعة فرعية من مرافق البرد، والتي قد تكون بعيدة عن حيث يتم تحضين الخلايا. قد يتم تداولها صالح الحفظ بالتبريد لعيب الإجهاد السفر المفروضة على الخلايا. وهكذا، في حين الحفظ بالتبريد هو بالتأكيد الطريق الأكثر صرامة للحفاظ على عينات للتحليل مضان الأشعة السينية، فمن المؤكد أنها ليست الأكثر في متناول جميع الباحثين في جميع الظروف.كما أنها ليست دائما ضرورية – إذا كان المعادن ذات الأهمية لا بد بإحكام على الجزيئات يمكن حلها، والقرار الذي سيتم تصويرها على عينة أكبر من الأضرار التي لحقت-المجهرية جدا التي قد تحدث أثناء التجفيف. وإذ تضع في اعتبارها المحاذير 24، تثبيت الكيميائية وتجفيف قد يكون خيارا مناسبا.
وتشمل العوامل الأخرى في الأشعة السينية تجربة التصوير مضان ناجحة تحليل سليم. الأشعة السينية التصوير مضان هو في الأساس الأشعة السينية الطيفي الانبعاثات مضان جنبا إلى جنب مع النقطية المسح إلى توفير تحليل المكاني. أطياف الانبعاث مضان الأشعة السينية التي تم جمعها تحتوي على مزيج من تداخل القمم الانبعاثات، الخلفية، والقمم نثر المرنة وغير المرنة من شعاع الحادث. البرمجيات التي تمكن من الإلتواء اجتثاث هذه المساهمات، وتركيب قمم الانبعاثات كان، وهو تطور حاسمة في هذا المجال 25. أيضا، وتطوير وشعبة نظم التجاريribution المعايير الأغشية الرقيقة من تكوين معروفة، وتستخدم لمعايرة كثافة مضان بالنسبة لكمية المواد، وقد تم أيضا مهم جدا.
يوفر هذا البروتوكول وصفا لإعداد الخلايا الملتصقة من قبل التثبيت الكيميائية والتجفيف في الهواء. خطوة حيوية في هذه العملية هي نمو الخلايا على النوافذ نيتريد السيليكون، والتي غالبا لا تلتزم بشكل جيد، مما يجعل الشطف لطيف في مفتاح الأزياء معين لتحقيق النجاح.
Protocol
Representative Results
Discussion
الأشعة السينية التصوير مضان مفيد في العديد من المجالات، بما في ذلك علوم الأرض، وعلوم المواد، والبيولوجيا الكيميائية 26-34. أنتجت التقدم في السنكروترون الأشعة السينية، والتركيز، وللغاية الحزم عالية الكثافة. الحزم تركيزا الأشعة السينية كافية لإثارة المعادن المح…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge Stefan Vogt for his assistance in the fitting of the representative data shown in this paper, and helpful discussions. The authors also acknowledge Chris Jacobsen for his support to Q. J.
Use of the Advanced Photon Source, beamlines 2-ID-E and 8-BM-B, at Argonne National Laboratory was supported by the U. S. Department of Energy, Office of Science, Office of Basic Energy Sciences, under Contract No. DE-AC02-06CH11357.
Materials
| silicon nitride windows | Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom | No part numbers available. Order by size. Membrane size: 1.5 mm x 1.5 mm. Thickness 500 nm. Frame size: 5 mm x 5 mm. Frame thickness: 200 µm | Alternate source: SPI Supplies / Structure Probe, Inc.West Chester, PA |
| reverse tweezers | Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 | 78520-5X | EMS 5X, NC – Ultra Fine Tweezers |
| rubber grid mat | Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 | 71170 | Round Grid Mat |
| acetic acid | Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052 | 338826 | trace metals grade concentrated acetic acid |
| PIPES buffer | Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052 | P6757 | solid PIPES buffer |
| formaldehyde stock solution | Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 | RT 17113 | 10 x 10mL ampules of 20% aqueous paraformaldehyde |
References
- Thompson, A. C. . Center for X-ray Optics and Advanced Light Source. , 1-53 (2009).
- Helliwell, J. R. Synchrotron radiation facilities. Nat. Struct. Biol. 5, 614-617 (1988).
- Lai, B., et al. X-ray Phase Zone Plate Fabricated by Lithographic Techniques. Appl. Phys. Lett. 61 (16), 1877-1879 (1992).
- Dodani, S. C., et al. Calcium-dependent copper redistributions in neuronal cells revealed by a fluorescent copper sensor and X-ray fluorescence microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (15), 5980-5985 (2011).
- Finney, L., et al. X-ray fluorescence microscopy reveals large-scale relocalization and extracellular translocation of cellular copper during angiogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (7), 2247-2252 (2007).
- Kehr, S., et al. X-ray fluorescence microscopy reveals the role of selenium in spermatogenesis. J. Mol. Biol. 389 (5), 808-818 (2009).
- McCormick, N., Velasquez, V., Finney, L., Vogt, S., Kelleher, S. L. X-ray fluorescence microscopy reveals accumulation and secretion of discrete intracellular zinc pools in the lactating mouse mammary gland. PloS One. 5 (6), (2010).
- Paunesku, T., Vogt, S., Maser, J., Lai, B., Woloschak, G. X-ray fluorescence microprobe imaging in biology and medicine. J. Cell. Biochem. 99 (6), 1489-1502 (2006).
- Twining, B. S., et al. Quantifying trace elements in individual aquatic protist cells with a synchrotron X-ray fluorescence microprobe. Anal. Chem. 75 (15), 3806-3816 (2003).
- Chen, S., et al. The Bionanoprobe: hard X-ray fluorescence nanoprobe with cryogenic capabilities. J Synchrotron Radiat. 21, 66-75 (2014).
- Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).
- Forster, F., Medalia, O., Zauberman, N., Baumeister, W., Fass, D. Retrovirus envelope protein complex structure in situ studied by cryo-electron tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (13), 4729-4734 (2005).
- Muller, M., Moor, H. . Science of Biological Specimen. , 131-138 (1984).
- Moor, H., Riehle, U. . Proceedings of the 4th Eur. Reg. Conference Electron. , 33-34 (1968).
- Sitte, H. Advanced instrumentation and methodology related to cryoultramicrotomy: a review. Scanning Microsc Suppl. 10, 387-463 (1996).
- Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. A new approach for cryofixation by high-pressure freezing. J. Microsc. 203, (Pt. 3, 285-294 (2001).
- Matsuyama, S., et al. Elemental mapping of frozen-hydrated cells with cryo-scanning x-ray fluorescence microscopy). X-Ray Spectrom. 39, 260-266 (2010).
- Schrag, M., et al. The effect of formalin fixation on the levels of brain transition metals in archived samples. Biometals. 23 (6), 1123-1127 (2010).
- James, S. A., et al. Quantitative comparison of preparation methodologies for X-ray fluorescence microscopy of brain tissue. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401 (3), 853-864 (2011).
- Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23 (18), 3583-3588 (2004).
- Bouchet-Marquis, C., Hoenger, A. Cryo-electron tomography on vitrified sections: a critical analysis of benefits and limitations for structural cell biology. Micron. 42 (2), 152-162 (2011).
- Bouchet-Marquis, C., Dubochet, J., Fakan, S. Cryoelectron microscopy of vitrified sections: a new challenge for the analysis of functional nuclear architecture. Histochem. Cell Biol. 125 (1-2), 1-2 (2006).
- Mesman, R. J. A novel method for high-pressure freezing of adherent cells for frozen hydrated sectioning and CEMOVIS. J. Struct. Biol. 183 (3), 527-530 (2013).
- Hackett, M. J., et al. Chemical Alterations to murine brain tissue induced by formalin fixation: implications for biospectroscopic imaging and mapping studies of disease pathogenesis. Analyst. 136 (14), 2941-2952 (2011).
- Vogt, S. MAPS: A set of software tools for analysis and visualization of 3D x-ray fluorescence data sets. J Phys IV France. 104, 635-638 (2003).
- Vantelon, D., Lanzirotti, A., Scheinost, A. C., Kretzschmar, R. Spatial distribution and speciation of lead around corroding bullets in a shooting range soil studied by micro-X-ray fluorescence and absorption spectroscopy. Environ. Sci. Technol. 39 (13), 4808-4815 (2005).
- Robison, G., et al. X-ray fluorescence imaging of the hippocampal formation after manganese exposure. Metallomics : Integrated Biometal Science. 5 (11), 1554-1565 (2013).
- Hard Kemner, K. M. X-ray micro(spectro)scopy: a powerful tool for the geomicrobiologists. Geobiology. 6 (3), 270-277 (2008).
- Walsh, W. Scientific Testing of Beethoven’s Hair. 17, (2000).
- Casadio, F., Rose, V. High-resolution fluorescence mapping of impurities in historical zinc oxide pigments: hard X-ray nanoprobe applications to the paints of Pablo Picasso. Applied Physics A: Materials Science and Processing. 111 (1), 1-8 (2013).
- Leonardo, T., et al. Determination of elemental distribution in green micro-algae using synchrotron radiation nano X-ray fluorescence (SR-nXRF) and electron microscopy techniques–subcellular localization and quantitative imaging of silver and cobalt uptake by Coccomyxa actinabiotis. Metallomics : Integrated Biometal Science. 6 (2), 316-329 (2014).
- Wang, P., et al. Quantitative determination of metal and metalloid spatial distribution in hydrated and fresh roots of cowpea using synchrotron-based X-ray fluorescence microscopy. Sci. Total Environ. , 463-464 (2013).
- Ducic, T., et al. X-ray fluorescence analysis of iron and manganese distribution in primary dopaminergic neurons. J. Neurochem. 124 (2), 250-261 (2013).
- Kim, A. M., Vogt, S., O’Halloran, T. V., Woodruff, T. K. Zinc availability regulates exit from meiosis in maturing mammalian oocytes. Nature Chemical Biology. 6 (9), 674-681 (2010).
- Ortega, R., Cloetens, P., Deves, G., Carmona, A., Bohic, S. Iron storage within dopamine neurovesicles revealed by chemical nano-imaging. PloS One. 2 (9), (2007).
- Bohic, S., et al. Synchrotron hard X-ray microprobe: fluorescence imaging of single cells. Appl. Phys. Lett. 78 (22), 3544-3546 (2001).
- Kosior, E., et al. Combined use of hard X-ray phase contrast imaging and X-ray fluorescence microscopy for sub-cellular metal quantification. J. Struct. Biol. 177 (2), 239-247 (2012).
- Glesne, D., Vogt, S., Maser, J., Legnini, D., Huberman, E. Regulatory properties and cellular redistribution of zinc during macrophage differentiation of human leukemia cells. J. Struct. Biol. 155 (1), 2-11 (2006).
- McRae, R., Lai, B., Vogt, S., Fahrni, C. J. Correlative microXRF and optical immunofluorescence microscopy of adherent cells labeled with ultrasmall gold particles. J. Struct. Biol. 155 (1), 22-29 (2006).
- Yang, L., et al. Imaging of the intracellular topography of copper with a fluorescent sensor and by synchrotron x-ray fluorescence microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (32), 11179-11184 (2005).
- Wagner, D., et al. Elemental analysis of Mycobacterium avium-, Mycobacterium tuberculosis-, and Mycobacterium smegmatis-containing phagosomes indicates pathogen-induced microenvironments within the host cell’s endosomal system. J. Immunol. 174 (3), 1491-1500 (2005).
- Harris, H. H., et al. Time-dependent uptake, distribution and biotransformation of chromium(VI) in individual and bulk human lung cells: application of synchrotron radiation techniques. Journal Of Biological Inorganic Chemistry : JBIC : a publication of the Society of Biological Inorganic Chemistry. 10 (2), 105-118 (2005).
- Corezzi, S., et al. Synchrotron-based X-ray fluorescence imaging of human cells labeled with CdSe quantum dots. Anal. Biochem. 388 (1), 33-39 (2009).
- Marmorato, P., et al. Cellular distribution and degradation of cobalt ferrite nanoparticles in Balb/3T3 mouse fibroblasts. Toxicol. Lett. 207 (2), 128-136 (2011).
- Weekley, C. M., et al. distribution, and speciation of selenoamino acids by human cancer cells: X-ray absorption and fluorescence methods. Biochemistry. 50 (10), 1641-1650 (2011).
- Yuan, Y., et al. Epidermal growth factor receptor targeted nuclear delivery and high-resolution whole cell X-ray imaging of Fe3O4@TiO2 nanoparticles in cancer cells. ACS Nano. 7 (12), 10502-10517 (2013).
- McRae, R., Bagchi, P., Sumalekshmy, S., Fahrni, C. J. In situ imaging of metals in cells and tissues. Chem. Rev. 109 (10), 4780-4827 (2009).
- Carter, E. A., et al. Silicon nitride as a versatile growth substrate for microspectroscopic imaging and mapping of individual cells. Molecular Biosystems. 6 (7), 1316-1322 (2010).
