Preparando células aderentes para fluorescência de raios-X Imagem por Chemical Fixation

De raios-X de imagens por fluorescência permite tanto a identidade e quantidade de elementos presentes numa amostra a ser espacialmente resolvido. Incidentes raios-X, de uma energia seleccionada para ser maior do que a energia do elemento mais pesado de interesse de ligação de electrões, ultrapassar a energia de ligação dos electrões de concha interior do núcleo ^1. Isso cria um "buraco" na camada de elétrons. Tal como electrões de alta energia cair para estes orifícios, raios-X fluorescentes são emitidos cujo comprimento de onda é dependente da energia de separação dessas orbitais. Uma vez que o espaçamento entre a energia das orbitais é característica de um dado elemento, a emissão de fluorescência de raios-X também tem comprimentos de onda característicos, dependentes do elemento. É esta emissão a um comprimento de onda característico que permite a identificação dos elementos presentes. A calibração da intensidade de fluorescência permite a quantificação dos elementos presentes.

Fluorescência de raios X microscopy (XFM) tornou-se cada vez mais utilizada, em parte devido ao desenvolvimento de fontes de síncrotron de raios-X muito brilhantes, como as que estão em Spring-8 no Japão, o Mecanismo Europeu de Radiação Síncrotron (ESRF) em França, eo Advanced Photon Source ( APS) em os EUA ^2. Estas fontes fornecem muito elevado de intensidade de raios-X. Ao mesmo tempo, as melhorias na óptica de raios-X, tal como a tecnologia de placa de zona, permitiu a focagem de feixes para estes pontos de sub-micron, embora bastante ineficiente ^3. Com muito feixes de alta intensidade, mesmo uma quantidade relativamente pequena de luz que pode ser focado é suficiente para excitar os metais endógenos nas células, produzindo sinal que pode ser medido com a tecnologia atualmente disponível detector. Assim, o estudo da biologia química de metais na célula é uma aplicação em particular, que faz uso de muitos dos desenvolvimentos recentes nesta técnica ^4-10.

Há muitos fatores críticos a serem considerados ao appdeitada XFM para investigar a distribuição elementar e quantificação de células de mamíferos em cultura ou outras amostras biológicas. Em primeiro lugar, a amostra tem de ser mantidas intactas, quer estruturalmente quer no que diz respeito à sua composição elementar, em ordem para a medição de ser significativa. Em segundo lugar, a amostra deve ser também preservada de alguma forma de modo que seja resistente aos danos que a radiação pode ser causada por um feixe de raios-X concentrado. Uma maneira que uma amostra pode atender a esses critérios ao mesmo tempo, deve ser rapidamente congelados em um vítreo, gelo amorfo ^11,12. Congelação rápida é muitas vezes conseguida através de várias técnicas de criopreservação, como o congelamento de mergulho ou de alta pressão congelamento ^13-16. É geralmente aceite que a criopreservação preserva arquitectura celular em geral e composições químicas em amostras biológicas quanto à proximidade estado nativo quanto possível. Fixação química, por outro lado, devido à penetração lenta e selectiva de fixadores em células e tecidos como well alterações posteriores como na permeabilidade da membrana, pode permitir que vários íons celulares especialmente os íons difusíveis, como Cl, Ca e K a ser lixiviados, perdidos ou realocados, tornando assim investigação destes elementos sub�timas ^17-19. Apesar da clara vantagem de crio-fixação sobre fixação química em geral, para células de mamíferos aderentes, em particular, a criopreservação tem várias limitações ^20-23. A mais óbvia é que nem todo laboratório de pesquisa tem fácil acesso a instrumentos de criopreservação. A maioria dos congeladores alta pressão actuais nem mergulhar congeladores são dispendiosos e de propriedade apenas de um subconjunto de instalações de crio, que pode ser medida a partir de onde as células são incubadas. O benefício de criopreservação pode ser trocado por a desvantagem de estresse viagens colocado sobre as células. Assim, enquanto a criopreservação é certamente a forma mais rigorosa para preservar amostras para análise de fluorescência de raios-X, não é certamente o mais acessível a todos os investigadores em todas as circunstâncias;nem sempre é essencial – se os metais de interesse estão fortemente ligados a macromoléculas fixável, e a resolução na qual a amostra vai ser trabalhada é maior do que o dano para o ultra-microestrutura que pode ocorrer durante a secagem. Ciente das ressalvas ^24, fixação química e secagem pode ser uma escolha adequada.

Outros fatores em um raio-X experimento imagens de fluorescência de sucesso incluir uma análise adequada. Fluorescência de raios X de imagem é, fundamentalmente, de raios-X espectroscopia de emissão de fluorescência combinado com raster-digitalização para fornecer resolução espacial. Os espectros de emissão de fluorescência de raios-X recolhidos conter uma combinação de sobreposição de picos de emissão de fundo, e os picos de espalhamento de elásticos e inelásticos do feixe incidente. Software que permite que o de-convolution dessas contribuições e na concepção dos picos de emissão, tem sido um desenvolvimento crítico a esse campo ^25. Além disso, o desenvolvimento comercial e distribution de padrões de película fina de composição conhecida e utilizada para calibrar a intensidade da fluorescência em relação à quantidade de material, também tem sido muito importante.

Este protocolo fornece uma descrição da preparação de células aderentes por fixação química e secagem ao ar. Um passo fundamental neste processo é o crescimento das células nas janelas de nitreto de silício, que muitas vezes não aderem bem, fazendo lavagem suave em uma chave de moda especial para o sucesso.