Het voorbereiden hechtende cellen voor X-stralen fluorescentie beeldvorming door Chemical Fixatie

X-ray fluorescentie beeldvorming maakt zowel de identiteit en hoeveelheid van elementen in een monster ruimtelijk worden opgelost. Invallende röntgenstraling, van een energie groter gekozen dan het elektron bindingsenergie van het zwaarste onderdeel van belang, overwonnen de bindingsenergie van binnenste electronen naar de kern ^1. Hierdoor ontstaat een 'gat' in het elektron shell. Als hogere energie elektronen vallen in deze gaten worden fluorescente röntgenstraling waarvan de golflengte afhangt van de energie scheiding van deze orbitalen. Aangezien de energie afstand van de orbitalen is kenmerkend voor een bepaald element, de röntgenfluorescentie emissie ook karakteristieke golflengten, afhankelijk van het element. Hierdoor emissie bij een karakteristieke golflengte die de identificatie van de aanwezige elementen toelaat. Kalibratie van de fluorescentie-intensiteit maakt de kwantificering van de aanwezige elementen.

X-ray fluorescentie microscopy (XFM) is in toenemende mate benut, mede door de ontwikkeling van zeer briljante X-ray synchrotron bronnen, zoals die bij Spring-8 in Japan, de Europese Radiation Synchrotron Facility (ESRF) in Frankrijk, en de Advanced Photon Source ( APS) in de US ^2. Deze bronnen bieden zeer hoge intensiteit röntgenstralen. Tegelijkertijd, verbetering röntgenoptiek, zoals zoneplaat technologie, kon de concentratie van deze bundels op submicron spots, zij het ​​wat inefficiënt ^3. Met zeer hoge intensiteit balken, een betrekkelijk kleine hoeveelheid licht kan worden gericht voldoende om de endogene metalen in cellen wekken, produceert signaal dat kan worden gemeten met de huidige detectortechnologie. Aldus bestuderen van de chemische biologie van metalen in de cel een applicatie met name gebruik van veel van de recente ontwikkelingen in deze techniek maakt ^4-10.

Er zijn veel kritische factoren worden beschouwd, terwijl appliggend XFM de elementaire verdeling en kwantificering van gekweekte zoogdiercellen of andere biologische monsters te onderzoeken. Ten eerste moet het monster intact te blijven, zowel structureel als wat betreft de elementaire samenstelling, zodat de meting zinvol zijn. Ten tweede moet het monster worden bewaard andere manier zodat het winterhard tot stralingsschade die kan worden veroorzaakt door een gerichte röntgenbundel. Een manier die een monster kan aan deze beide criteria tegelijk is om snel tot een glasachtig, amorfe ijs ^11,12 worden bevroren. Snel invriezen wordt vaak bereikt door middel van verschillende cryopreservatie technieken zoals invallend bevriezing of hoge druk invriezen ^13-16. Het is algemeen aanvaard dat cryopreservatie bewaart totale cellulaire architectuur en de chemische samenstellingen in biologische monsters dicht natieve toestand mogelijk. Chemische fixatie, anderzijds, vanwege de langzame en selectieve penetratie van fixeermiddelen in cellen en weefsels well als latere wijzigingen in membraanpermeabiliteit, kunnen verschillende cellulaire ionen vooral de diffundeerbare ionen zoals Cl, Ca en K worden uitgeloogd, verloren of verplaatst, dus waardoor het onderzoek van deze elementen suboptimale ^17-19 mogelijk te maken. Ondanks het duidelijke voordeel van cryo-fixatie dan chemische fixatie in het algemeen, voor adherente cellen van zoogdieren in het bijzonder, cryopreservatie heeft verschillende beperkingen ^20-23. De meest voor de hand liggende is dat niet elk onderzoek lab heeft een gemakkelijke toegang tot cryopreservatie instrumenten. De meeste huidige hoge druk diepvriezers of zelfs dompelen vriezers zijn kostbaar en bezit alleen een subset van cryo faciliteiten, ver van waar cellen worden geïncubeerd zijn. Het voordeel van cryopreservatie zou kunnen worden verhandeld voor het nadeel van reizen spanning geplaatst op de cellen. Dus, terwijl cryopreservatie is zeker de meest rigoureuze manier om monsters voor X-stralen fluorescentie analyse te bewaren, het is zeker niet de meest toegankelijk is voor alle onderzoekers onder alle omstandigheden;noch is het essentieel – als de metalen worden strak gebonden aan fixeerbaar macromoleculen en de resolutie waarmee het monster wordt afgebeeld groter is dan de schade aan de ultra-microstructuur die kunnen optreden tijdens het drogen. Indachtig de kanttekeningen ^24, kan chemische fixatie en drogen een geschikte keuze te zijn.

Andere factoren in een succesvolle röntgenfluorescentie imagingexperiment omvatten juiste analyse. X-stralen fluorescentie beeldvorming is fundamenteel X-ray fluorescentie-emissie spectroscopie gecombineerd met raster-scan om ruimtelijke resolutie bieden. De X-ray fluorescentie-emissie spectra verzameld bevatten een combinatie van overlappende emissie pieken, achtergrond, en de elastische en inelastische verstrooiing toppen van de invallende bundel. Software die de de-convolutie van deze bijdragen, en de montage van de uitstoot pieken mogelijk maakt, is een kritische ontwikkeling van dit gebied ^25. Ook de ontwikkeling en commerciële distribution van dunne-film standaarden van bekende samenstelling, gebruikt voor fluorescentie-intensiteit ten opzichte materiaalhoeveelheid calibreren is ook belangrijk geweest.

Dit protocol geeft een beschrijving van de bereiding van hechtende cellen door chemische fixatie en drogen aan de lucht. Een essentiële stap in dit proces is de groei van de cellen op het siliciumnitride ramen, die vaak niet goed hechten, waardoor zacht spoelen op een bepaalde wijze sleutel tot succes.