Подготовка прилипшие клетки для рентгеновской флуоресценции изображений по химической фиксации

Рентгеновской визуализации флуоресценции позволяет как идентичности и количества элементов, присутствующих в образце, чтобы быть пространственным разрешением. Инцидент рентгеновские лучи, из энергии выбранной быть больше энергии связи электрона самого тяжелого элемента интересов, преодолеть энергию связи электронов внутренних оболочек к ядру ^1. Это создает "дыру" в электронной оболочке. Как выше электроны падают в эти отверстия, флуоресцентные рентгеновские лучи испускаются, длина волны которого зависит от разности энергий этих орбиталей. С энергетический интервал орбиталей характерна для данного элемента, X-Ray флуоресценции также имеет характерные длины волн, в зависимости от элемента. Именно это излучение на характерной длине волны, что позволяет идентифицировать элементов, присутствующих. Калибровка интенсивности флуоресценции позволяет количественно оценивать элементов, присутствующих.

Рентгено-флуоресцентный microscopу (XFM) стала шире используются, отчасти в связи с развитием очень ярких рентгеновских источников синхротронного, таких, как в весенне-8 в Японии, Европы радиационной синхротронного фонда (ESRF) во Франции, и Advanced Photon Source ( APS) в США ^2. Эти источники обеспечивают очень высокой интенсивности рентгеновских лучей. В то же время, улучшения в рентгеновской оптики, такие как зона пластины технологии, позволило фокусировки лучей в этих субмикронных пятен, хотя и довольно неэффективно ^3. С очень пучков высокой интенсивности, даже относительно небольшое количество света, который может быть сфокусирован достаточно, чтобы возбудить эндогенные металлов в клетках, создавая сигнал, который может быть измерен с доступной в настоящее время технологии детектора. Таким образом, изучая химической биологии металлов в клетке одно приложение, в частности, позволяет использовать многие из недавних разработок в этой технике ^4-10.

Есть много критических факторов, которые необходимо учитывать при приложениележа XFM исследовать распределение элементов и количественно культивируемых клеток млекопитающих или других биологических образцов. Во-первых, образец должен быть сохранены, как структурно, так и в отношении его химического состава, для того, чтобы измерения, чтобы иметь смысл. Во-вторых, образец также должны быть сохранены в некотором роде, так что он вынослив к повреждению излучения, которые могут быть вызваны с помощью сфокусированного пучка рентгеновских лучей. Один из способов, что образец может удовлетворить обоим этим критериям сразу будет быстро замораживают в стекловидное тело, аморфного льда ^11,12. Быстрое замораживание часто достигается с помощью различных методов криоконсервации, таких как падение замораживания или высокого давления замораживания ^13-16. Общепризнано, что криоконсервации сохраняет общую клеточную архитектуру и химические составы в биологических образцах как можно ближе к нативном состоянии, насколько это возможно. Химической фиксации, с другой стороны, из-за медленной и селективной проникновения фиксаторов в клетках и тканях, как шELL как последующие изменения в проницаемости мембран, может позволить различные клеточные ионы особенно к диффузии ионы, такие как Cl, Ca и K для выщелачивания, потерянных или перемещены, таким образом делая расследование этих элементов неоптимальных ^17-19. Несмотря на явное преимущество в крио-фиксации в течение химической фиксации в целом, для прикрепленных клеток млекопитающих, в частности, криоконсервация имеет различные ограничения ^20-23. Наиболее очевидным является то, что не каждый исследовательская лаборатория имеет легкий доступ к криоконсервации инструментов. Большинство современных морозильники высокого давления или даже погрузить морозильники являются дорогостоящими и принадлежит только подмножество крио объектов, которые могут быть далеко, где клетки инкубируют. Преимущество криоконсервации может быть обменены на недостаток хода стресса, размещенной на клетках. Таким образом, в то время как криоконсервация, безусловно, самый строгий способ сохранить образцы для анализа рентгеновской флуоресценции, это, конечно, не самый доступный для всех исследователей при всех обстоятельствах;и это не всегда необходимо – если металлы, представляющие интерес, тесно связан с фиксируемым макромолекул, и разрешение, с которым образец будет изображена больше, чем ущерб, к ультра-микроструктуры, которые могут возникнуть в процессе сушки. Памятуя о оговорками ^24, химической фиксации и сушки может быть подходящим выбором.

Другие факторы в успешном рентгеновского эксперимента флуоресцентной томографии включают надлежащий анализ. Флуоресценции формирования изображений рентгеновским излучением в корне рентгеновской спектроскопии флуоресценции в сочетании с растровым сканированием, чтобы обеспечить пространственное разрешение. Спектры флуоресценции рентгеновских собранные содержат комбинацию совпадающих вершин выбросов, фон, и упругие и неупругие пики рассеяния падающего луча. Программное обеспечение, которое позволяет де-свертку этих взносов, а также установку пиков выбросов, был критический развитие в этой области ^25. Кроме того, развитие и коммерческое расстояниеribution тонкопленочных стандартам известного состава, используемого для калибровки интенсивности флуоресценции по отношению к материальной количестве, также очень важно.

Этот протокол содержит описание приготовления адгезивных клеток с помощью химической фиксации и сушки на воздухе. Важным шагом в этом процессе является рост клеток на нитрида кремния окон, которые часто не придерживаются хорошо, что делает нежный промывания в определенном ключе моды к успеху.