הכנת תאים חסידים הדמיה הקרינה רנטגן על ידי קיבוע כימי
Summary
Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.
Abstract
X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.
Introduction
X-ray הדמיה הקרינה מאפשרת לשניהם זהות והכמות של אלמנטים קיימים במדגם להיפתר במרחב. תקרית צילומים רנטגן, של אנרגיה נבחרה להיות גדול יותר מהאלקטרון מחייב אנרגיה של היסוד הכבד ביותר של עניין, להתגבר על אנרגית הקשר של אלקטרונים פנימי קליפה לגרעין 1. זה יוצר "חור" בקליפת האלקטרונים. כאלקטרונים גבוהות אנרגיה ליפול לתוך חורים אלה, צילומי רנטגן ניאון נפלטים אורך הגל שהוא תלוי בהפרדת האנרגיה של אורביטלים אלה. מאז את מרווח האנרגיה של אורביטלים אופייני לאלמנט מסוים, פליטת הקרינה X-ray יש גם אורכי גל אופייניים, תלוי באלמנט. זה פליטה זה באורך גל אופייני המאפשר זיהוי של האלמנטים הנוכחיים. כיול של עוצמת הקרינה מאפשר לכמת את האלמנטים הנוכחיים.
microscop הקרינה רנטגןy (XFM) הפך יותר ויותר מנוצל, בין ההיתר בשל פיתוח מקורות מאוד מבריקים X-ray סינכרוטרון, כגון אלה באביב-8 ביפן, המתקן האירופי הקרינה Synchrotron (ESRF) בצרפת, והפוטון המתקדם המקור ( APS) בארה"ב 2. מקורות אלה מספקים קורות X-ray גבוהה מאוד בעוצמה. באותו הזמן, שיפורים באופטיקה רנטגן, כגון טכנולוגית צלחת האזור, אפשרו התמקדות של קורות אלה לכתמים תת-מיקרון, אם כי לא באופן בלתי יעיל 3. עם מאוד קורות בעוצמה גבוהה, גם כמות קטנה יחסית של אור שיכול להיות ממוקדת מספיק כדי להלהיב את מתכות אנדוגני בתאים, אות ייצור שניתן למדוד עם טכנולוגית גלאי זמינה כרגע. כך, מחקר על הביולוגיה הכימית של מתכות בתא הוא יישום אחד בפרט שעושה שימוש ברבים מההתפתחויות האחרונות בטכניקה זו 4-10.
ישנם גורמים קריטיים רבים כדי להיחשב בעת יישוםשוכב XFM לחקור את ההפצה וכימות הבסיסיות של תאי יונקים בתרבית או דגימות ביולוגיות אחרות. ראשית, המדגם צריך להיות כל הזמן בשלמות, גם מבני והן ביחס לרכב היסודות שלה, על מנת שהמדידה יהיה משמעותי. שנית, המדגם חייב גם יישמר בדרך כלשהי, כך שהוא קשוח לניזקי הקרינה שיכול להיגרם על ידי קרן רנטגן ממוקדת. אחת דרכים שמדגם יכול לפגוש שני הקריטריונים הללו בבת אחת הוא להיות מוקפאים במהירות לתוך קרח זגוגי, אמורפי 11,12. הקפאה מהירה מושגת לעתים קרובות באמצעות טכניקות שונות, כגון הקפאת הקפאה לצלול או בלחץ גבוה הקפאת 13-16. הדעה מקובלת היא שההקפאה שומרת ארכיטקטורה הסלולר כוללת והרכבים כימיים בדגימות ביולוגיות קרובות למצב טבעי ככל האפשר. קיבעון כימי, ומצד שני, בשל החדירה האיטית וסלקטיבית של fixatives לתאים ורקמות כמו well שינויים לאחר כבחדירות קרום, עשויים לאפשר יונים סלולריים שונים במיוחד יוני diffusible כגון Cl, Ca ו- K להיות דלפו, שאבדו או הועברו, וכך הופכים חקירה של האלמנטים האלה לא טובים 17-19. למרות היתרון ברור של cryo-קיבעון על קיבעון כימי באופן כללי, לתאי יונקים חסיד בפרט, יש הקפאת מגבלות שונות 20-23. הברור ביותר הוא שלא לכל מעבדת מחקר גישה קלה למכשירי הקפאה. רוב המקפיאים לחץ גבוה הנוכחיים או אפילו לצלול מקפיאים הם יקרים ובעלות רק על ידי קבוצת משנה של מתקני cryo, אשר עשויים להיות רחוק מהמקום שבי תאים מודגרת. היתרון של הקפאה עשוי להיסחר בחסרון של מתח נסיעות מונח על התאים. וכך, בעוד ההקפאה היא ללא ספק הדרך המחמיר ביותר לשמירת דגימות לבדיקת הקרינה רנטגן, זה בהחלט לא נגיש ביותר לכל החוקרים בכל הנסיבות;זה גם לא תמיד חיוני – אם המתכות של ריבית הדוקה למקרו-מולקולות הניתנים לקביעה, ואת הרזולוציה שבי המדגם יהיה צילמה גדולה מהניזק לאולטרה-המייקר שעלול להתרחש במהלך ייבוש. מודע לאזהרות 24, קיבעון כימי וייבוש עשוי להיות בחירה מתאימה.
גורמים אחרים בניסוי הדמיה הקרינה רנטגן מוצלח כוללים ניתוח נכון. ההדמיה הקרינה רנטגן היא ביסוד ספקטרוסקופיה פליטת הקרינה רנטגן בשילוב עם סריקה סריקה כדי לספק רזולוציה מרחבית. ספקטרום פליטת הקרינה X-ray שנאסף מכיל שילוב של חופף פסגות פליטה, רקע, ואת פסגות פיזור אלסטי והקשיחות של קורה האירוע. תוכנה המאפשרת דה-פיתול של תרומות אלה, וראויים של פסגות הפליטה, הייתה התפתחות קריטית לתחום זה 25. כמו כן, הפיתוח וdist המסחריribution של תקני סרט דק של הרכב ידוע, המשמש לכיול עוצמת הקרינה יחסית לכמות חומר, גם היה מאוד חשוב.
פרוטוקול זה מספק תיאור של הכנת תאים חסיד ידי קיבוע כימי וייבוש באוויר. צעד חיוני בתהליך זה הוא הצמיחה של התאים על חלונות סיליקון ניטריד, אשר לעתים קרובות אינו דבקים גם, מה שהופך את השטיפה עדינה במפתח אופנה מסוים להצלחה.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההדמיה הקרינה רנטגן שימושית בתחומים רבים, כולל geosciences, מדע חומרים, וביולוגיה כימית 26-34. התקדמות בצילומי רנטגן סינכרוטרון, והפוקוס שלהם, יצרה מאוד קורות בעוצמה גבוהה. X-ray הממוקד קורות מספיק כדי לעורר את מתכות אנדוגני בתאים קיימות כיום, לייצר אות שניתן למדוד עם טכנ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge Stefan Vogt for his assistance in the fitting of the representative data shown in this paper, and helpful discussions. The authors also acknowledge Chris Jacobsen for his support to Q. J.
Use of the Advanced Photon Source, beamlines 2-ID-E and 8-BM-B, at Argonne National Laboratory was supported by the U. S. Department of Energy, Office of Science, Office of Basic Energy Sciences, under Contract No. DE-AC02-06CH11357.
Materials
| silicon nitride windows | Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom | No part numbers available. Order by size. Membrane size: 1.5 mm x 1.5 mm. Thickness 500 nm. Frame size: 5 mm x 5 mm. Frame thickness: 200 µm | Alternate source: SPI Supplies / Structure Probe, Inc.West Chester, PA |
| reverse tweezers | Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 | 78520-5X | EMS 5X, NC – Ultra Fine Tweezers |
| rubber grid mat | Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 | 71170 | Round Grid Mat |
| acetic acid | Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052 | 338826 | trace metals grade concentrated acetic acid |
| PIPES buffer | Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052 | P6757 | solid PIPES buffer |
| formaldehyde stock solution | Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 | RT 17113 | 10 x 10mL ampules of 20% aqueous paraformaldehyde |
References
- Thompson, A. C. . Center for X-ray Optics and Advanced Light Source. , 1-53 (2009).
- Helliwell, J. R. Synchrotron radiation facilities. Nat. Struct. Biol. 5, 614-617 (1988).
- Lai, B., et al. X-ray Phase Zone Plate Fabricated by Lithographic Techniques. Appl. Phys. Lett. 61 (16), 1877-1879 (1992).
- Dodani, S. C., et al. Calcium-dependent copper redistributions in neuronal cells revealed by a fluorescent copper sensor and X-ray fluorescence microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (15), 5980-5985 (2011).
- Finney, L., et al. X-ray fluorescence microscopy reveals large-scale relocalization and extracellular translocation of cellular copper during angiogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (7), 2247-2252 (2007).
- Kehr, S., et al. X-ray fluorescence microscopy reveals the role of selenium in spermatogenesis. J. Mol. Biol. 389 (5), 808-818 (2009).
- McCormick, N., Velasquez, V., Finney, L., Vogt, S., Kelleher, S. L. X-ray fluorescence microscopy reveals accumulation and secretion of discrete intracellular zinc pools in the lactating mouse mammary gland. PloS One. 5 (6), (2010).
- Paunesku, T., Vogt, S., Maser, J., Lai, B., Woloschak, G. X-ray fluorescence microprobe imaging in biology and medicine. J. Cell. Biochem. 99 (6), 1489-1502 (2006).
- Twining, B. S., et al. Quantifying trace elements in individual aquatic protist cells with a synchrotron X-ray fluorescence microprobe. Anal. Chem. 75 (15), 3806-3816 (2003).
- Chen, S., et al. The Bionanoprobe: hard X-ray fluorescence nanoprobe with cryogenic capabilities. J Synchrotron Radiat. 21, 66-75 (2014).
- Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).
- Forster, F., Medalia, O., Zauberman, N., Baumeister, W., Fass, D. Retrovirus envelope protein complex structure in situ studied by cryo-electron tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (13), 4729-4734 (2005).
- Muller, M., Moor, H. . Science of Biological Specimen. , 131-138 (1984).
- Moor, H., Riehle, U. . Proceedings of the 4th Eur. Reg. Conference Electron. , 33-34 (1968).
- Sitte, H. Advanced instrumentation and methodology related to cryoultramicrotomy: a review. Scanning Microsc Suppl. 10, 387-463 (1996).
- Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. A new approach for cryofixation by high-pressure freezing. J. Microsc. 203, (Pt. 3, 285-294 (2001).
- Matsuyama, S., et al. Elemental mapping of frozen-hydrated cells with cryo-scanning x-ray fluorescence microscopy). X-Ray Spectrom. 39, 260-266 (2010).
- Schrag, M., et al. The effect of formalin fixation on the levels of brain transition metals in archived samples. Biometals. 23 (6), 1123-1127 (2010).
- James, S. A., et al. Quantitative comparison of preparation methodologies for X-ray fluorescence microscopy of brain tissue. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401 (3), 853-864 (2011).
- Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23 (18), 3583-3588 (2004).
- Bouchet-Marquis, C., Hoenger, A. Cryo-electron tomography on vitrified sections: a critical analysis of benefits and limitations for structural cell biology. Micron. 42 (2), 152-162 (2011).
- Bouchet-Marquis, C., Dubochet, J., Fakan, S. Cryoelectron microscopy of vitrified sections: a new challenge for the analysis of functional nuclear architecture. Histochem. Cell Biol. 125 (1-2), 1-2 (2006).
- Mesman, R. J. A novel method for high-pressure freezing of adherent cells for frozen hydrated sectioning and CEMOVIS. J. Struct. Biol. 183 (3), 527-530 (2013).
- Hackett, M. J., et al. Chemical Alterations to murine brain tissue induced by formalin fixation: implications for biospectroscopic imaging and mapping studies of disease pathogenesis. Analyst. 136 (14), 2941-2952 (2011).
- Vogt, S. MAPS: A set of software tools for analysis and visualization of 3D x-ray fluorescence data sets. J Phys IV France. 104, 635-638 (2003).
- Vantelon, D., Lanzirotti, A., Scheinost, A. C., Kretzschmar, R. Spatial distribution and speciation of lead around corroding bullets in a shooting range soil studied by micro-X-ray fluorescence and absorption spectroscopy. Environ. Sci. Technol. 39 (13), 4808-4815 (2005).
- Robison, G., et al. X-ray fluorescence imaging of the hippocampal formation after manganese exposure. Metallomics : Integrated Biometal Science. 5 (11), 1554-1565 (2013).
- Hard Kemner, K. M. X-ray micro(spectro)scopy: a powerful tool for the geomicrobiologists. Geobiology. 6 (3), 270-277 (2008).
- Walsh, W. Scientific Testing of Beethoven’s Hair. 17, (2000).
- Casadio, F., Rose, V. High-resolution fluorescence mapping of impurities in historical zinc oxide pigments: hard X-ray nanoprobe applications to the paints of Pablo Picasso. Applied Physics A: Materials Science and Processing. 111 (1), 1-8 (2013).
- Leonardo, T., et al. Determination of elemental distribution in green micro-algae using synchrotron radiation nano X-ray fluorescence (SR-nXRF) and electron microscopy techniques–subcellular localization and quantitative imaging of silver and cobalt uptake by Coccomyxa actinabiotis. Metallomics : Integrated Biometal Science. 6 (2), 316-329 (2014).
- Wang, P., et al. Quantitative determination of metal and metalloid spatial distribution in hydrated and fresh roots of cowpea using synchrotron-based X-ray fluorescence microscopy. Sci. Total Environ. , 463-464 (2013).
- Ducic, T., et al. X-ray fluorescence analysis of iron and manganese distribution in primary dopaminergic neurons. J. Neurochem. 124 (2), 250-261 (2013).
- Kim, A. M., Vogt, S., O’Halloran, T. V., Woodruff, T. K. Zinc availability regulates exit from meiosis in maturing mammalian oocytes. Nature Chemical Biology. 6 (9), 674-681 (2010).
- Ortega, R., Cloetens, P., Deves, G., Carmona, A., Bohic, S. Iron storage within dopamine neurovesicles revealed by chemical nano-imaging. PloS One. 2 (9), (2007).
- Bohic, S., et al. Synchrotron hard X-ray microprobe: fluorescence imaging of single cells. Appl. Phys. Lett. 78 (22), 3544-3546 (2001).
- Kosior, E., et al. Combined use of hard X-ray phase contrast imaging and X-ray fluorescence microscopy for sub-cellular metal quantification. J. Struct. Biol. 177 (2), 239-247 (2012).
- Glesne, D., Vogt, S., Maser, J., Legnini, D., Huberman, E. Regulatory properties and cellular redistribution of zinc during macrophage differentiation of human leukemia cells. J. Struct. Biol. 155 (1), 2-11 (2006).
- McRae, R., Lai, B., Vogt, S., Fahrni, C. J. Correlative microXRF and optical immunofluorescence microscopy of adherent cells labeled with ultrasmall gold particles. J. Struct. Biol. 155 (1), 22-29 (2006).
- Yang, L., et al. Imaging of the intracellular topography of copper with a fluorescent sensor and by synchrotron x-ray fluorescence microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (32), 11179-11184 (2005).
- Wagner, D., et al. Elemental analysis of Mycobacterium avium-, Mycobacterium tuberculosis-, and Mycobacterium smegmatis-containing phagosomes indicates pathogen-induced microenvironments within the host cell’s endosomal system. J. Immunol. 174 (3), 1491-1500 (2005).
- Harris, H. H., et al. Time-dependent uptake, distribution and biotransformation of chromium(VI) in individual and bulk human lung cells: application of synchrotron radiation techniques. Journal Of Biological Inorganic Chemistry : JBIC : a publication of the Society of Biological Inorganic Chemistry. 10 (2), 105-118 (2005).
- Corezzi, S., et al. Synchrotron-based X-ray fluorescence imaging of human cells labeled with CdSe quantum dots. Anal. Biochem. 388 (1), 33-39 (2009).
- Marmorato, P., et al. Cellular distribution and degradation of cobalt ferrite nanoparticles in Balb/3T3 mouse fibroblasts. Toxicol. Lett. 207 (2), 128-136 (2011).
- Weekley, C. M., et al. distribution, and speciation of selenoamino acids by human cancer cells: X-ray absorption and fluorescence methods. Biochemistry. 50 (10), 1641-1650 (2011).
- Yuan, Y., et al. Epidermal growth factor receptor targeted nuclear delivery and high-resolution whole cell X-ray imaging of Fe3O4@TiO2 nanoparticles in cancer cells. ACS Nano. 7 (12), 10502-10517 (2013).
- McRae, R., Bagchi, P., Sumalekshmy, S., Fahrni, C. J. In situ imaging of metals in cells and tissues. Chem. Rev. 109 (10), 4780-4827 (2009).
- Carter, E. A., et al. Silicon nitride as a versatile growth substrate for microspectroscopic imaging and mapping of individual cells. Molecular Biosystems. 6 (7), 1316-1322 (2010).
