Método de Isolado<em> Ex Vivo</em> Perfusão pulmonar em um modelo de rato: Lições aprendidas com o desenvolvimento de um Programa PPEV Rat

SISTEMA DE VIGILÂNCIA

Que coisas parecem quando experimento está funcionando bem:

Uma vez que as cânulas foram colocadas no circuito e os pulmões são de ventilação, existem várias maneiras para garantir que o sistema está funcionando corretamente. Não deve haver vazamento de perfusato em toda a linha. A resistência vascular pulmonar (RVP) deve manter-se relativamente constante (assumindo um fluxo constante). A troca de oxigênio deve aumentar, uma vez que o ventilador está funcionando corretamente e expandir os pulmões para recrutar mais alvéolos para a troca gasosa. A Figura 12A mostra bem ventilados e perfundidos pulmões conectados ao circuito PPEV no interior do tórax artificial.

Que coisas parecem quando experimento não está funcionando bem:

Existem alguns problemas comuns que tiveram o maior índice de ocorrência durante os estágios iniciais de um experimento PPEV. O primeiro e mais fácil tO remédio é um vazamento na linha que sai do pulmão. Isso é perceptível por um pool de pooling perfusato sob parte do circuito eo nível do reservatório diminuindo continuamente. Verifique e aperte os conectores do tubo em torno da área do derramamento e inspecionar o próprio tubo de um vazamento. Se esta fuga ocorre antes do pulmão, pode também introduzir bolhas no pulmão. Isto deve ser remediado tão rapidamente quanto possível na forma de bolhas de ar no perfusato irá resultar em danos nos tecidos e causar um aumento significativo na PVR. Também pode haver uma fuga proveniente do pulmão ou uma das cânulas. Isto pode ser causado por um deslizamento de uma cânula ou de uma obstrução na linha que sai provocando uma acumulação de pressão. Inspecione a posição para ambos os cânulas para garantir nem caiu ou torcida. A pressão PA também devem ser monitorizados durante este processo, porque um aumento instantâneo na pressão PA é um sinal evidente de que uma obstrução de algum tipo ocorreu recentemente. Figura 12Bmostra um pulmão rompido que rompeu com altas pressões. Um vazamento a partir do próprio pulmão pode também ser causada por uma lágrima no tecido. Esse problema pode ou não ser reparável mas reposicionamento e reaperto das cânulas é a melhor opção neste cenário.

Principais pontos de aprendizagem / Oportunidades:

Tentativa e erro desenvolvimento do sistema de perfusão pulmonar ex-vivo nos permitiu identificar várias questões-chave que delineiam aqui para facilitar a implementação eficiente do sistema PPEV. Em primeiro lugar, no que diz respeito aos contratos, é importante que as técnicas anestésicas são seguidos os padrões para anestesiar os animais adequadamente (anestésico suficiente, injeção no peritônio) e adesão a todas as políticas IACUC é necessária. A cânula (mostrado na Figura 13 A, B, e C) deve ser repetidamente lavada a fim de remover qualquer coágulo e / ou detritos dentro da vasculat pulmonarure. No que diz respeito à seleção animal, sugerimos o uso Sprague Dawley ou Lewis ratos pesando 250-350 g. Um cuidado especial deve ser tomado quando canulação ratos pesando perto de 250 g vez que os navios será menor e, portanto, muito mais difícil de cannulate sem ferir a vasculatura. Se ratos menores, ou um modelo de rato, é para ser usado, menor cânula pode precisar de ser utilizado.

Traqueal de punção não é tipicamente um desafio, enquanto o fio de sutura é garantido de forma adequada por uma primeira passagem posterior sutura de seda para a traqueia após dissecção dos fáscia circundantes e antes da canulação. Siga isso com uma visão anterior incisão 1-2 anéis traqueais acima da sutura para passar a cânula. Amarrar nós quadrados entre os anéis da traqueia, de modo a fixá-lo dentro de uma ranhura para uma melhor segurança (Figura 4C). A canulação da artéria pulmonar (PA) é mais exigente em relação à cânula traqueal. Os seguintes passos foram utilizados neste estudopara este procedimento. Em primeiro lugar, segure a ponta do coração com um par de fórceps. Passar um outro par de fórceps no seio transverso e um fio de sutura para fixar a cânula na PA proximal. Inciso o ventrículo direito, imediatamente antes da saída do ventrículo direito (VSVD) (Figura 14a). Após a incisão no RVOT, a cânula será orientada para a via de saída da artéria pulmonar. Tendo a sutura em posição atrás da artéria pulmonar / aorta antes do ventriculotomy direita aumenta a eficiência (Figura 5C). A cânula deve ser fixada em posição com o fio de sutura para evitar o deslocamento. Uma das principais complicações podem ocorrer se a cânula PA não está na orientação anatómica correcta. A cânula pode ser inserido demasiado longe e apenas perfundir um ramo ou tornar-se mal posicionado com torção do espécime de coração-pulmão depois de serem removidos da cavidade torácica. Isto pode ser facilmente orientada para trás para a posição original para preservar o ângulo adequado de anatomiposição cal. Finalmente, do átrio esquerdo (LA) punção é a parte mais desafiadora do procedimento. A cânula LA necessita de ser colocado dentro do átrio esquerdo. Com os tecidos sendo extremamente friável, estar atento para não usar a força significativa ou torção, a fim de evitar uma lágrima dentro da veia pulmonar e átrio esquerdo, que passaria a fazer a experiência irrecuperável. A cânula PA está melhor colocado antes da cânula LA. Um Ventriculotomia esquerda com a remoção do vértice foi mostrado para perturbar as cordas cordoalha e permitir um acesso mais fácil através dos folhetos mitrais. Além disso, o ventriculotomy torna mais fácil para dilatar e visualizar a válvula mitral e para alimentar a cânula através da válvula mitral. A dilatação do anel da valva mitral com um par de pequenas extremidades cegas pick-ups pode ser feito, a fim de visualizar o aparelho para o LA (Figura 14B). Sutura deve ser colocado atrás do coração antes de punção. Isto pode ser feito simplesmente pelo levantamento do coração utilizando um par de small cerses pick-ups e colocando a sutura por baixo e através do coração. O LA está agora pronto para ser cânula. Alimente a cânula LA através das pick-ups, a fim de visualizar corretamente o posicionamento da cânula para o átrio esquerdo. Tome especial cuidado para não deslocar a cânula de volta para o ventrículo esquerdo. A sutura em seguida, deve ser firmemente fixados ao longo do miocárdio do ventrículo esquerdo. Protegendo o fio de sutura para o átrio esquerdo pode ocluir o todo ou parte da cânula.

Durante o processo, é essencial que nenhum ar permanecer na secção de entrada do aparelho. Qualquer ar significativa pode produzir uma embolia de ar aumentar o PVR (efectivamente um "air-lock"), o que irá resultar num fluxo perfusato muito menor para uma dada pressão. Vários pontos pode ser utilizado para remover o ar dentro do sistema. Air dentro da seção de saída é esperado e não deve ter qualquer efeito deletério sobre os pulmões. A modelo suíno para a hipertensão pulmonar tem sidomostrada para recriar a patologia de pequenas quantidades de ar contínua ao longo de um período de 8 semanas. O aumento do ar diminui a quantidade de perfusão presente enquanto causando inflamação para os tecidos circundantes ^19.

O início da perfusão pode ocorrer uma vez que o punção está completo, mas antes do tubo proveniente do LA está ligada à linha de PPEV. Perfusato deve ser executado através de limpar todos os coágulos de sangue e isso pode esvaziar perfusato para a parede torácica, sem quaisquer problemas. Ligação da bomba de perfusão para o modo manual e aumentando lentamente a taxa de fluxo de aproximadamente 2 ml / min permite acompanhar de perto a pressão PA. Pressões mais de 20-30 _cmH2O pode indicar uma obstrução e assistindo para perfusato sair do LA é também um indicador, mas isso pode ser muito difícil de ver. Se a pressão se eleva a mais de 20-30 cmH ₂ O, parar a bomba e verifique novamente ambas as cânulas. Uma vez que a pressão é constante em torno de 10-20 _cmH2O permitir the perfusato para percorrer e para a cavidade torácica por 2 min. Nesta altura, a linha de LA pode ser conectado ao circuito de PPEV. A velocidade da bomba de perfusão pode ser aumentada para 5-10 ml / min. À medida que a cabeça avança fluido através do circuito, haverá um aumento da pressão PA, devido ao aumento da altura da cabeça do fluido e, por conseguinte, a pressão estática. Se o fluido não pode fluir sobre o ponto mais alto na linha, pode ser necessário que se aplique uma força de sucção na extremidade oposta da linha ou a tentativa de reduzir a maior parte da linha. Uma vez que esta questão está superada, o perfusato deve circular sem quaisquer problemas.

Algumas questões devem ser monitorados com relação ao ventilador. Em primeiro lugar, a torção de brônquios / traqueia e posição de coração-pulmão pode ocorrer como os pulmões se tornam mais edematoso e que o peso aumenta. É importante que a cânula permaneça numa posição anatómica relativamente estreita, por conseguinte, alterando um ou ambos os cânulae pode ser necessária. Pressão ou de volume controlado ventiladores, bem como ventilação positiva ou negativa pode ser usado com este sistema PPEV. Para o modelo de rato, temos encontrado usando pressão positiva, ventilação controlada a volume funciona bem em volumes correntes entre 4-10 ml / kg e em pressões expiratória final positiva (PEEP) entre 2-8 cmH ₂ O. No entanto, uma PEEP de 8 cmH ₂ O pode provocar uma possível ruptura na bifurcação da traqueia. Depois de cada experiência (ou conjunto de experiências se realizado back-to-back), a linha de ventilação que conduz à traquéia deve ser limpo de qualquer lavado bronco-alveolar (BAL), que podem ter viajado até a traquéia. Esse fluido vai endurecer se deixado intocado e pode bloquear completamente a linha de ventilação.

A composição do perfusato é crítico para um experimento PPEV bem sucedida. Uma mistura dextrano 5% permite a perfusão pulmonar, que é perto de condições fisiológicas, mantém uma pressão oncótica estável para conduzir fluido back na vasculatura para evitar o edema e previne a trombose no interior dos vasos pulmonares. É importante notar que algumas espécies de ratos pode ser alérgico a dextrano que pode causar edema pulmonar ^20. O conteúdo do perfusato foi consistente em todos os grupos experimentais neste estudo, por conseguinte, o teor de dextrano não deve ser um confundidor. A pressão oncótica é uma variável crítica, que tem o potencial para melhorar ou produzir edema nos tecidos. Soluções para perfusão comercialmente disponíveis, que são optimizados para o armazenamento estático frio ou perfusões normotérmicos foram usados ​​neste sistema para aumentar o tempo de viabilidade pulmão. Fazemos notar que algumas destas soluções conter albumina e uma preocupação é a possibilidade de albumina bovina desencadear uma resposta inflamatória no pulmão roedor. Embora composição do perfusato ideal é um tema permanente de investigação, o perfusato precisa levar em conta a pressão oncótica, a capacidade de pressão e de tamponamento osmótica. We recomendado que a solução ser uma solução com base em cultura de células ou de Krebs-Henseleit modificado meios. A pressão oncótica deve ser mantida por dextrano ou albumina, dependendo da aplicação. A taxa de pressão de perfusão e fluxo afeta os parâmetros de perfusão de órgãos e supra-fisiológica pode fazer o órgão propenso a trauma mecânico.

Indicadores Visuais durante a experiência:

Existem muitas pistas visuais, bem como indicações de dados em tempo real que pode ser utilizada para determinar se um experimento PPEV funcionando bem. O pulmão permanecerá o mesmo tamanho e vai esvaziar para o mesmo volume após cada respiração. Também haverá nenhum vazamento a partir do próprio pulmão. O PVR, o peso do pulmão, e conformidade permanecerá relativamente constante. A produção de oxigénio permanecerá constante ou aumentar ligeiramente.

Há muitos indicadores visuais quando o pulmão fica comprometida durante um experimento. O pulmão torna-se um edematosond cresce rapidamente em tamanho e peso. A cor das alterações de pulmão (a partir de um bronzeado-de-rosa para branco) e bolsas de líquido podem ser identificados no tecido. Se traqueia ou pulmonares rupturas de barotrauma ou mais de distensão, haverá borbulhando sob o ponto de lesão (Figura 12b). Produção de oxigênio diminui eo PVR e conformidade irá aumentar dramaticamente também.

O potencial da utilização de um modelo PPEV em pequenos animais, como roedores abre a porta para futuros estudos, melhorando o tratamento de transplante de pulmão. No entanto, o modelo animal pequeno requer uma melhor compreensão para imitar verdadeiramente um transplante de pulmão. Este modelo pode ser utilizado no futuro, para melhorar os tratamentos médicos e definir os parâmetros de linha de base para futuros estudos de transplante de pulmão.