Méthode de isolé<em> Ex Vivo</em> Lung perfusion dans un modèle rat: Leçons tirées élaboration d'un programme EVLP Rat
Summary
Ex-Vivo pulmonaire Perfusion (EVLP) a permis la transplantation pulmonaire chez l'homme pour devenir plus facilement accessible en permettant la capacité d'évaluer les organes et d'élargir le bassin de donneurs. Ici, nous décrivons l'élaboration d'un programme et des améliorations qui permettent un modèle reproductible pour l'expansion future EVLP de rat.
Abstract
Le nombre de poumons de donneurs acceptables disponibles pour la transplantation pulmonaire est très limitée en raison de la mauvaise qualité. Ex-Vivo pulmonaire Perfusion (EVLP) a permis la transplantation pulmonaire chez l'homme pour devenir plus facilement accessible en permettant la capacité d'évaluer les organes et d'élargir le bassin de donneurs. Comme cette technologie se développe et se améliore, la capacité d'évaluer et potentiellement améliorer la qualité des poumons aux normes avant la transplantation est un besoin critique. Afin d'évaluer plus rigoureusement ces approches, un modèle animal reproductible doit être établie qui permettrait pour les tests de techniques améliorées et la gestion des poumons donnés ainsi que pour le destinataire du poumon transplantation. En outre, un modèle animal de EVLP des pathologies associées, par exemple, la ventilation induit des lésions pulmonaires (IVL), fournirait une nouvelle méthode pour évaluer les traitements pour ces pathologies. Ici, nous décrivons le développement d'un programme de poumon EVLP de rat et des améliorations à ce qui methode qui permettent un modèle reproductible pour une expansion future. Nous décrivons également l'application de ce système de EVLP de modéliser IVL dans les poumons de rats. L'objectif est de fournir à la communauté de recherche des informations essentielles et «perles de sagesse" / techniques qui ont découlé de tâtonnements et sont essentielles à l'établissement d'un système de EVLP qui est robuste et reproductible.
Introduction
Pertinence clinique
Il ya actuellement une pénurie de poumons disponibles pour la transplantation appropriés avec seulement 19% des poumons pouvant être utilisés à l'échelle nationale menant à temps prolongée liste d'attente ou en attente de greffe patients mourants 1. La pénurie peut être en raison de donneurs plus âgés, traumatisme, infection, défaillance multi-système et poumons de donneurs parfois blessés sur la récolte 2. En outre, le poumon est un organe fragile à l'extérieur de la cavité thoracique et les techniques de transport et de conservation classiques peut conduire à une détérioration et non viables poumons. Par conséquent, le maintien et l'amélioration de la viabilité du poumon ex-vivo a récemment devenue une préoccupation majeure dans la médecine de transplantation pulmonaire.
Ex-vivo pulmonaire Perfusion (EVLP)
Ex-vivo poumon perfusion (EVLP) a évolué pour perfuser constamment organes étant évalués à la transplantation et permet une période d'évaluation que tous lesux pour le potentiel de la réanimation du poumon ou reconditionnement. EVLP peut prolonger totale sur l'organe du corps temps d'ischémie et de permettre les dons d'organes de voyager de plus grandes distances 3. Typiquement, les poumons sont ventilés à 50% de la capacité pulmonaire totale ou 20 cmH 2 O de pression des voies aériennes pic avec une fraction d'oxygène inspiré (FiO 2) de 30% à 50% 4. Solution de préservation est perfusé à 40-60 ml / kg (environ 40% du débit cardiaque prédite de 100 ml / kg) chez les humains et les animaux de grande taille 5,6, mais est perfusé à environ 20% du débit cardiaque chez les rats 7. L'inclusion de la solution a permis STEEN poumons humains de voyager dans des environnements RT sans développement d'un œdème pulmonaire neuf. Ce travail de pionnier a été affinée par l'Université de Toronto Lung Transplant Program 10-13 et est en cours d'évaluation pour une meilleure évaluation des poumons de donneurs marginaux pour la transplantation 14,15. Cependant, le VENTILATION optimalen et de perfusion conditions nécessaires pour régénérer les poumons marginales et / ou sous-standard pour la transplantation ne est pas connue et est actuellement un domaine de recherche actif.
Systèmes de perfusion de poumon isolées ont été utilisées chez les petits animaux de causer des lésions pulmonaires, recréer les maladies respiratoires, les poumons et perfuser des solutions différentes pour éviter des dommages ischémiques. Des chercheurs ont créé un modèle de petits animaux de transplantation du poumon en utilisant le système de perfusion pulmonaire isolée pour imiter les protocoles de EVLP qui pourraient être utilisés chez les humains et les animaux plus gros de 16 à 18. Cependant, ce modèle expérimental a de nombreux défis en ce qui concerne aux diverses techniques et paramètres utilisés pour imiter la physiologie humaine. En particulier, il ya beaucoup de subtilités dans le maintien de la viabilité du poumon au cours EVLP. Ces subtilités peuvent survenir en raison de différences de technique de récolte, les paramètres de ventilation à pression positive, les conditions de composition et de flux de perfusat et canulation du poumon. Thervant, le but ici est de fournir à la communauté de recherche avec un certain nombre de dépannage et de mise en œuvre des conseils que nous avons trouvé de plomb à une méthode robuste pour mettre en œuvre EVLP dans un modèle de rongeur.
Protocol
Representative Results
Discussion
SYSTEME DE SURVEILLANCE
Quelles sont les choses ressembler quand l'expérience est bien en cours d'exécution:
Une fois que les canules ont été placés dans le circuit et les poumons sont de ventilation, il ya plusieurs façons de se assurer que le système fonctionne correctement. Il devrait y avoir aucune fuite de liquide de perfusion à travers la ligne. La résistance vasculaire pulmonaire (RVP) doit rester relativement constant (en supposant un flux constant). L'échange d'oxygène devrait augmenter une fois que le ventilateur fonctionne correctement et en élargissant les poumons de recruter plus alvéoles pour l'échange de gaz. Figure 12A montre bien ventilé et perfusé poumons connectés au circuit EVLP l'intérieur du thorax artificielle.
Quelles sont les choses ressembler quand l'expérience ne fonctionne pas bien:
Il ya quelques questions communes qui ont eu le plus haut taux d'occurrence pendant les premiers stades d'une expérience de EVLP. La première et la plus simple to réparation d'une fuite dans la conduite sortant du poumon. Ce est perceptible par un pool de mise en commun de perfusion sous une partie du circuit et le niveau dans le réservoir cesse de diminuer. Vérifier et serrer les connecteurs de tube autour de la zone de déversement et inspecter le tube lui-même d'une fuite. Si cette fuite se produit avant le poumon, on peut également introduire des bulles dans le poumon. Cela devrait être corrigée le plus rapidement possible que des bulles d'air dans le liquide de perfusion se traduira par des lésions tissulaires et provoquer une augmentation significative dans le PVR. Il peut également y avoir une fuite provenant du poumon ou une des canules. Cela peut être provoqué soit par glissement d'une canule ou d'une obstruction dans la conduite sortant de provoquer une accumulation de pression. Inspecter la position pour les deux canules pour assurer ni a glissé ou tordu. La pression PA devrait également être surveillée pendant ce processus car une augmentation instantanée de la pression PA est un signe évident que l'obstruction d'une certaine sorte a eu lieu récemment. Figure 12Bmontre un poumon rupture qui se est rompu en raison des pressions élevées. Une fuite du poumon lui-même peut également être causée par une déchirure dans du tissu. Ce problème peut ou peut ne pas être réparable mais repositionnement et en resserrant les canules est la meilleure option dans ce scénario.
Principaux points d'apprentissage / Opportunités:
De première instance et le développement d'erreur du système de perfusion du poumon ex-vivo a permis d'identifier plusieurs questions clés que nous décrivons ici pour faciliter la mise en œuvre efficace du système de EVLP. Tout d'abord, en ce qui concerne la passation des marchés, il est important que les techniques d'anesthésie standard sont suivies correctement pour anesthésier les animaux (assez anesthésiques, injection dans le péritoine) et le respect de toutes les politiques du IACUC est requis. Les canules (représenté sur la figure 13 A, B, et C) doit être purgé de façon répétée afin d'éliminer tout caillot et / ou de débris dans le vasculat pulmonaireure. En ce qui concerne la sélection des animaux, nous suggérons d'utiliser Sprague-Dawley ou Lewis rats pesant 250 à 350 g. Une attention particulière doit être prise lorsque cannulating rats pesant près de 250 g depuis les bateaux seront plus petits et donc beaucoup plus difficile à canuler sans blesser le système vasculaire. Si les petits rats, ou un modèle de souris, doit être utilisée, plus petite canule peut avoir besoin d'être utilisé.
Trachéale canulation ne attaque pas généralement aussi longtemps que la suture est fixée correctement par un premier passage de fil de suture postérieure de la soie à la trachée après dissection du fascia entourant et avant canulation. Suivez ce avec une incision antérieure 1-2 anneaux de la trachée-dessus de la suture de passer la canule. Nœuds carrés entre les anneaux de la trachée afin de fixer dans une rainure pour une meilleure sécurité (figure 4C). Canulation de l'artère pulmonaire (PA) est plus difficile par rapport à la canule trachéale. Les étapes suivantes ont été utilisées dans cette étudepour cette procédure. Tout d'abord, saisir l'apex cardiaque avec une paire de pinces. Passez une autre paire de pinces dans le sinus transverse et enfiler un fil de suture pour fixer la canule dans la PA proximale. Inciser immédiatement le ventricule droit avant que le droit d'éjection du ventricule (RVOT) (Figure 14A). Après l'incision dans le RVOT, la canule sera guidé vers la sortie de l'artère pulmonaire voies. Avoir la suture en position derrière l'artère pulmonaire / aorte avant que le droit ventriculotomie augmente l'efficacité (figure 5C). La canule doit être fixé en place avec la suture pour empêcher le délogement. Une complication majeure peut se produire si la canule PA ne est pas dans l'orientation anatomique correcte. La canule peut être insérée trop loin et ne perfuser une succursale ou devenir mal positionné avec torsion de l'échantillon coeur-poumon lors de l'enlèvement de la cavité thoracique. Cela peut facilement être orientée vers la position d'origine pour maintenir le bon angle de anatomiposition CAL. Enfin, auriculaire gauche (LA) canule est la partie la plus difficile de la procédure. La canule LA doit être placé à l'intérieur de l'oreillette gauche. Avec les tissus étant extrêmement friable, être attentifs à ne pas utiliser la force significative ou une torsion afin d'éviter une déchirure dans la veine pulmonaire et l'oreillette gauche qui serait alors faire l'expérience irrécupérables. La canule PA est le mieux placé avant la canule LA. Un ventriculotomie gauche avec enlèvement de l'apex a été montré pour perturber la tendineux de CORDAE et faciliter l'accès à travers les valves mitrales. En outre, le ventriculotomie rend plus facile à se dilater et de visualiser la valve mitrale et pour alimenter la canule à travers la valvule mitrale. Dilatation de l'anneau mitral avec une paire de extrémités franches petits pick-up peut être fait afin de visualiser les voies dans le LA (Figure 14B). Suture doit être placé derrière le cœur avant de cathétérisme. Cela peut être fait simplement en soulevant le coeur à l'aide d'une paire de Small extrémités franches pick-up et en plaçant en dessous et à travers le coeur de la suture. La LA est maintenant prêt à être canule. Nourrir la canule LA travers les pick-ups afin de visualiser correctement le placement de la canule dans l'oreillette gauche. Faites attention à ne pas déloger la canule de retour dans le ventricule gauche. La suture doit alors être fermement fixé le long du myocarde du ventricule gauche. Sécurisation de la suture à l'oreillette gauche pourrait obstruer la totalité ou une partie de la canule.
Au cours de la procédure, il est essentiel que l'air ne reste dans la section d'entrée de l'appareil. Tout air importante peut produire une embolie gazeuse augmenter la PVR (effectivement un «sas») qui se traduira par un flux de perfusion beaucoup plus faible pour une pression donnée. Divers points peuvent être utilisés pour éliminer l'air dans le système. L'air dans la section de sortie est prévue et ne devrait pas avoir d'effet néfaste sur les poumons. Un modèle porcin de l'hypertension pulmonaire a étéreprésenté à recréer à partir de la pathologie en continu de petites quantités d'air sur une période de 8 semaines. L'air accrue diminue la quantité de perfusion présent tout en provoquant l'inflammation des tissus environnants à 19.
L'initiation de la perfusion peut se produire une fois que la canule est terminée, mais avant que le tube en provenance de la LA est connecté à la ligne de EVLP. Perfusât doit être exécuté par le biais d'effacer tous les caillots de sang et cela peut perfusat vider dans la paroi thoracique sans aucun problème. Commande de la pompe de perfusion en mode manuel et en augmentant progressivement le taux à ~ 2 ml / min permet une surveillance étroite de la pression PA. Pressions plus de 20 à 30 cmH 2 O peuvent indiquer une obstruction et regarder pour perfusion sortant de la LA est un autre indicateur, mais cela peut être très difficile à voir. Si la pression ne augmente à plus de 20 à 30 cmH 2 O, arrêter la pompe et revérifier les deux canules. Une fois que la pression est constante autour de 10 à 20 cmH 2 O permettra ee perfusat à courir à travers et dans la cavité thoracique pendant 2 min. A ce moment la ligne de la LA peut être connecté au circuit EVLP. La vitesse de la pompe de perfusion peut être augmentée de 5 à 10 ml / min. Comme la tête fluide progresse à travers le circuit, il y aura une augmentation de la pression PA en raison de l'augmentation de la hauteur de la tête de fluide et par conséquent la pression statique. Si le liquide ne peut pas se écouler sur le point culminant de la ligne, il peut être nécessaire d'appliquer soit une force d'aspiration sur l'extrémité opposée de la ligne ou de tenter d'abaisser la partie la plus haute de la ligne. Une fois que cette question est dépassée, la perfusion doit circuler sans aucun problème.
Quelques questions doivent être surveillés par rapport au ventilateur. Tout d'abord, la torsion de bronches / trachée et la position cœur-poumon peut se produire que les poumons deviennent le poids augmente plus et oedémateux. Il est important que les canules de rester dans une position anatomique relativement étroite, par conséquent, de modifier un ou les deux canulee peut être nécessaire. Pression ou ventilateurs de volume contrôlé ainsi que la ventilation positive ou négative peuvent être utilisés avec ce système de EVLP. Pour le modèle de rat, nous avons trouvé en utilisant une pression positive, volume contrôlé ventilation fonctionne bien à des volumes de marée entre 4-10 ml / kg et à des pressions expiratoire positive (PEEP) entre 2-8 cmH 2 O. Cependant, une PEEP de 8 cmH 2 O peut provoquer une rupture possible à la bifurcation de la trachée. Après chaque expérience (ou un ensemble d'expériences si elle est effectuée dos-à-dos), la ligne de ventilation menant à la trachée doit être nettoyé de tout lavage broncho-alvéolaire (LBA) qui peuvent avoir voyagé jusqu'à la trachée. Ce fluide va durcir si laissé intact et peut bloquer complètement la ligne de ventilation.
La composition de perfusion est essentiel à une expérience de EVLP succès. Un mélange dextran 5% permet de perfusion du poumon qui est proche des conditions physiologiques, maintient une pression oncotique stable à conduire b fluideack dans le système vasculaire pour empêcher un oedème et empêche la thrombose dans les vaisseaux pulmonaires. Il est important de noter que certaines espèces de rats peuvent être allergiques à dextran qui peut provoquer un oedème pulmonaire 20. Le contenu de la perfusion a été cohérent dans tous les groupes expérimentaux dans cette étude, donc le contenu dextran ne devrait pas être un facteur de confusion. La pression oncotique est une variable critique qui a le potentiel d'améliorer ou de produire un œdème des tissus. Solutions de perfusion disponibles dans le commerce qui sont optimisés pour le stockage statique à froid ou perfusions normothermiques ont été utilisés dans ce système pour augmenter les temps de viabilité du poumon. Nous notons que certaines de ces solutions contiennent de l'albumine et une préoccupation est la possibilité d'albumine bovine déclencher une réponse inflammatoire dans les poumons des rongeurs. Bien que la composition optimale de perfusion est un sujet en cours d'enquête, la perfusion doit tenir compte de la pression oncotique, la capacité de pression et tampon osmotique. We recommande que la solution soit basée sur une solution ou une culture cellulaire médias Krebs-Henseleit modifiée. La pression oncotique doit être maintenue par du dextrane ou de l'albumine, en fonction de l'application. Le taux de pression de perfusion et la circulation affecte les paramètres de perfusion organes et supra-physiologiques peuvent faire l'organe sujettes à un traumatisme mécanique.
Indicateurs visuels cours de l'expérience:
Il existe de nombreux repères visuels ainsi que des indications à partir des données en temps réel qui peut être utilisé pour déterminer si une expérience de EVLP fonctionne bien. Le poumon restera la même taille et se dégonfle à la même volume après chaque souffle. Il y aura également aucune fuite du poumon lui-même. Le PVR, le poids du poumon, et la conformité demeureront relativement constante. La production d'oxygène restera constante ou augmenter légèrement.
Il existe de nombreux indicateurs visuels lorsque le poumon est compromise pendant une expérience. Le poumon devient oedémateuxe se développe rapidement en taille et en poids. La couleur des changements pulmonaires (à partir d'un tan-rose au blanc) et des poches de liquide peut être identifié dans le tissu. Si la trachée ou pulmonaires ruptures de barotraumatisme ou plus de distension, il y aura bouillonner du point de blessures (Figure 12B). La production d'oxygène va diminuer et le PVR et le respect va considérablement augmenter ainsi.
La possibilité d'utiliser un modèle de EVLP de petits animaux comme les rongeurs ouvre la porte à de futures études améliorer le traitement de transplantations pulmonaires. Cependant, le modèle du petit animal nécessite une meilleure compréhension pour imiter vraiment une transplantation pulmonaire. Ce modèle peut être utilisé à l'avenir pour améliorer les traitements médicaux et définir les paramètres de base pour de futures études de transplantation pulmonaire.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier l'aide de Harvard Apparatus, surtout Stephanie Pazniokas, MS (Physiologie Systems & médecine régénérative) pour leur aide dans le circuit assemblage, la modification et le dépannage du circuit de perfusion et XVIVO Perfusion (Daniel Martinelli, CCP, CTP) pour fourniture d'utilisation non clinique plégie pulmonaire.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| IPL-2 Basic Lung Perfusion System | Harvard Apparatus | ||
| Tweezer #5 stainless steel, curved 11cm | Kent Scientific Corporation | IND500232 | |
| Tweezer #5 Dumostar, 11cm | Kent Scientific Corporation | INS500085-A | |
| Tweezer #7 Titanium, 12cm tips curved | Kent Scientific Corporation | INS600187 | |
| McPherson-Vannas Scissors 8cm, Str 5mm | Kent Scientific Corporation | INS14124 | |
| Vannas Scissors 8cm Str 5mm | Kent Scientific Corporation | INS14003 | |
| Instrument Sterilization Tray 5" x 7" | Kent Scientific Corporation | INS800101 | |
| Heparin 30,000 units per 30mL | APP Pharmaceuticals | Supplied from OSU Pharmacy | |
| Ketamine 500mg per 5mL | JHP Pharmaceuticals | Supplied from OSU Pharmacy | |
| Xylazine 100mg per 1mL | Akorn | Supplied from OSU Pharmacy | |
| 10cc insulin syringe 29 Ga x 1/2" needle | B-D | 309301 | |
| Hyflex NBR | Ansell | S-17310M | Bite proof gloves |
| BL1500 | Sartarius | Practum 1102-1S | Scale |
| Large Flat Bottom Restrainer | Braintree Scientific Inc | FB L 3.375 dia x 8.5, 250-500gm rat | Rat tunnel for injection |
| Sterling Nitrile Powder-free Exam Gloves, Large | Kiberly-Clark | 50708 | |
| Rapidpoint 405 | Siemens | blood gas analyzer | |
| Fiberoxygenator D150 | Hugo Sachs Elektronik | PY2 73-3762 | |
| LabChart v7.3.7 | ADInstruments | ||
| Tracheal cannula | Harvard Apparatus | 733557 | |
| Pulmonary Artery cannula | Harvard Apparatus | 730710 | |
| Left Atrium cannula | Harvard Apparatus | 730712 | |
| Peristaltic Pump | Ismatec | ISM 827B | |
| Small Animal Ventilator model 683 | Harvard Apparatus | 55-000 | |
| Ecoline Star Edition 003, E100 | Lauda | LCK 1879 | Water Heater |
| Tubing Cassette | Cole-Parmer | IS 0649 | |
| Connect kit D150 | Cole-Parmer | VK 73-3763 | |
| PowerLab 8/35 | ADInstruments | 730045 | |
| TAM-A transducer amplifier module type 705/1 | Hugo Sachs – Harvard Apparatus | 73-0065 | |
| TAM-D transducer amplifier type 705/2 | Hugo Sachs – Harvard Apparatus | 73-1793 | |
| SCP Servo controller for perfusion type 704 | Hugo Sachs – Harvard Apparatus | 732806 | |
| CFBA carrier frequency bridge amplifier type 672 | Hugo Sachs – Harvard Apparatus | 731747 | |
| VCM ventilator control module type 681 | Hugo Sachs – Harvard Apparatus | 731741 | |
| TCM time control module type 686 | Hugo Sachs – Harvard Apparatus | 731750 | |
| IL2 Tube set for perfusate | Harvard Apparatus | 733842 | |
| Tube set for moist chamber | Harvard Apparatus | 73V83157 | |
| Tygon E-3603 Tubing 2.4mm ID | Harvard Apparatus | 721017 | perfusate line entering lung |
| Tygon E-3603 Tubing 3.2mm ID | Harvard Apparatus | 721019 | perfusate line leaving lung |
| low potassium dextran glucose solution | flushing the lung |
References
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