WERKWIJZE Geïsoleerde<em> Ex Vivo</em> Longperfusie in een Rat Model: Lessen uit het ontwikkelen van een Rat EVLP Program

Systeem monitoring

Welke dingen eruit zien als experiment goed loopt:

Zodra de canules zijn in het circuit is geplaatst en de longen ventilatie- er meerdere manieren om te waarborgen het systeem goed werkt. Er mag geen lekkage van perfusaat de hele lijn. De pulmonale vasculaire weerstand (PVR) betrekkelijk constant blijft (uitgaande van een constante stroom). De zuurstof uitwisseling moeten toenemen zodra de ventilator goed werkt en het uitbreiden van de longen om meer longblaasjes te werven voor de gasuitwisseling. Figuur 12A correct toont geventileerd en doorbloed longen aangesloten op de EVLP circuit binnenin de kunstmatige thorax.

Welke dingen eruit zien als experiment is niet goed draait:

Er zijn een aantal veel voorkomende problemen die de hoogste mate van het optreden tijdens de beginfase van een EVLP experiment hebben gehad. De eerste en eenvoudigste to remedie is een lek in de lijn verlaten van de long. Dit is merkbaar door een pool van perfusaat pooling onder deel van het circuit en het niveau in het reservoir voortdurend afneemt. Controleer en haal buisconnectoren rond het gebied waar gemorst is en inspecteer de buis zelf voor een lek. Als dit lek plaatsvindt vóór de longen, kan het ook bellen introduceren in de longen. Dit moet zo snel mogelijk worden verholpen als luchtbellen in de perfusievloeistof zal resulteren in weefselschade en veroorzaken een significante toename van de PVR. Er kan ook een lek vanuit de long of een van de canules zijn. Dit kan worden veroorzaakt door een slippen van een canule of een obstructie in de uittredende lijn waardoor een drukopbouw. Controleer de positie voor beide canules om ervoor te zorgen noch is uitgegleden of gedraaid. De PA druk moet ook worden gecontroleerd tijdens dit proces, omdat een onmiddellijke stijging in de PA druk is een duidelijk teken dat een obstructie van een soort onlangs heeft plaatsgevonden. Figuur 12Btoont een gescheurde long die verbroken als gevolg van hoge druk. Een lek in de longen zelf kan ook worden veroorzaakt door een scheur in het weefsel. Dit probleem kan wel of niet herstelbaar maar herpositionering en het natrekken van de canules is de beste optie in dit scenario.

Key Learning Points / kansen:

Trial and error ontwikkeling van de ex-vivo longperfusie systeem heeft ons toegelaten om een aantal belangrijke kwesties die we hier schetsen voor een efficiënte uitvoering van de EVLP systeem vergemakkelijken. Ten eerste, met betrekking tot verkrijgen, is het belangrijk dat standaard anesthesietechnieken gevolgd goed verdoven dieren (genoeg verdoving, injectie in het peritoneum) en naleving van alle IACUC beleid vereist. De canules (figuur 13 A, B en C) moeten herhaaldelijk worden gespoeld om eventuele stollen en / of vuil in de pulmonaire vasculat verwijderenure. Met betrekking tot de selectie van dieren, raden we het gebruik van Sprague Dawley of Lewis-ratten met een gewicht van 250-350 g. Speciale aandacht moet worden genomen bij het cannulating ratten met een gewicht dicht tot 250 g, omdat de schepen kleiner en dus veel moeilijker zal zijn om canule zonder verwonden van het vaatstelsel. Indien kleinere ratten, of een muismodel, wordt gebruikt, moet kleiner canule worden gebruikt.

Trachea canule is niet typisch uitdagend zolang de hechting goed is bevestigd dat vooraf een zijden hechtdraad posterieur van de luchtpijp na het ontleden van de omringende fascia en voorafgaand aan cannulatie. Volg deze met een anterieure incisie 1-2 tracheale ringen boven de hechting aan de canule passeren. Tie vierkante knopen tussen de tracheale ringen om te verzekeren binnen een groef voor een betere beveiliging (Figuur 4C). Canulatie van de longslagader (PA) is een grotere uitdaging in vergelijking met de tracheacanule. De volgende stappen werden bij dit onderzoekvoor deze procedure. Ten eerste, pakt het hart apex met een pincet. Pass een pincet in de dwarsrichting sinus en draad een hechting aan de canule in de proximale PA beveiligen. Incise de rechterkamer direct voor de rechter ventrikel outflow tract (RVOT) (Figuur 14A). Na de incisie in de RVOT, wordt de canule worden geleid naar de longslagader uitstroom. Het hebben van de hechtdraad in positie achter de longslagader / aorta voordat het recht ventriculotomy verhoogt de efficiency (figuur 5C). De canule moet worden vastgezet op hun plaats met de hechtdraad om losraken te voorkomen. Een belangrijke complicatie kan optreden als de PA canule niet in de juiste anatomische oriëntatie. De canule kan te ver worden geplaatst en slechts perfuse één tak of mal gepositioneerd met het verdraaien van de hart-long monster na verwijdering uit de borstholte worden. Dit kan gemakkelijk worden georiënteerd naar de oorspronkelijke positie om de juiste hoek van anatomi bewarencal positie. Tenslotte linkeratrium (LA) canule is het meest uitdagende gedeelte van de procedure. De LA canule moet binnen het linkeratrium worden geplaatst. Met de weefsels uiterst bros, rekening te houden met belangrijke kracht of draaien niet gebruiken om een ​​scheur in de longader en linkerboezem die dan zou het experiment unsalvageable voorkomen. De PA canule wordt het best geplaatst voor de LA canule. Een linker ventriculotomy verwijdering van de apex is aangetoond dat de cordae tendinae verstoren en vergemakkelijken de toegang via de mitrale folders. Ook de ventriculotomy gemakkelijker verwijden en visualiseren de mitralisklep en de canule voeren door de mitralisklep. Dilatatie van de mitrale klep annulus met een paar kleine stompe uiteinde pick-ups kunnen worden gedaan om de luchtwegen in de LA (figuur 14B) te visualiseren. Hechtdraad moet achter het hart worden geplaatst voordat infusen. Dit kan eenvoudig worden gedaan door het opheffen van de kern met behulp van een paar small stompe uiteinden pick-ups en het plaatsen van de hechting onder en aan de overkant van het hart. De LA is nu klaar om te worden voorzien van een canule. Voer de LA canule door de opnemers om goed zichtbaar de plaatsing van de canule in het linker atrium. Wees extra voorzichtig niet aan de canule terug in de linker ventrikel te verjagen. De hechting moet dan stevig worden vastgezet aan het myocard van het linker ventrikel. Bevestiging van de hechting aan het linker atrium kunnen afsluiten het gehele of een deel van de canule.

Tijdens de procedure, is het cruciaal dat geen lucht blijven de instroom gedeelte van de inrichting. Significante lucht kan produceren een luchtembolie verhogen PVR (effectief een "air-lock"), die zal resulteren in een veel lagere perfusaat stroom bij een bepaalde druk. Verschillende punten kunnen worden gebruikt om lucht in het systeem te verwijderen. Lucht in het gedeelte uitstroom wordt verwacht en mag geen nadelig effect hebben op de longen. Een varkensmodel voor pulmonaire hypertensie isgetoond aan de pathologie van continue kleine hoeveelheden lucht over een periode van 8 weken opnieuw. De verhoogde lucht vermindert de hoeveelheid perfusie onderhavige terwijl die ontsteking van de omliggende weefsels ^19.

De inleiding van perfusie kan optreden wanneer de canule is voltooid maar voordat de buis uit de LA is verbonden met de EVLP lijn. Perfusaatmonsters moeten worden doorlopen om duidelijk uit elke bloedstolsels en dit perfusaat kan legen in de borstwand zonder problemen. Omschakelen van de perfusaat pomp naar de handmatige modus en langzaam verhogen van de doorstroming naar ~ 2 ml / min zorgt voor een nauwkeurige controle van de PA druk. Druk gedurende 20-30 cmH ₂ O kan een obstructie aangeven en kijken voor perfusaat verlaten van de LA is ook een indicator, maar dit kan heel moeilijk te zien zijn. Als de druk doet toenemen tot meer dan 20-30 cmH ₂ O, stop de pomp en controleer beide canuleringen. Zodra de druk is constant rond de 10-20 cmH ₂ O toestaan ​​the perfusaat om door en in de borstholte draaien gedurende 2 minuten. Op dit moment de lijn van de LA kan worden aangesloten op de EVLP circuit. Het perfusaat pompsnelheid kan worden verhoogd tot 5-10 ml / min. Aangezien het fluïdum kop doorloopt het circuit, zal een verhoging van de PA-druk als gevolg van de toename in hoogte van de vloeistof kop en derhalve de statische druk. Indien de vloeistof niet op het hoogste punt kan stromen in de lijn, kan het nodig zijn hetzij toepassen van een zuigkracht op het tegenoverliggende uiteinde van de lijn of trachten het hoogste gedeelte van de lijn te verlagen. Zodra dit probleem is te overwinnen, moet het perfusaat circuleren zonder problemen.

Een aantal zaken moet worden gecontroleerd met betrekking tot de ventilator. Ten eerste kan het verdraaien van bronchiën / luchtpijp en hart-long positie ontstaan ​​als de longen worden meer oedemateus en het gewicht toeneemt. Het is belangrijk dat de canules te blijven in een relatief nauwe anatomische positie, dus veranderen of beide canulee noodzakelijk zijn. Druk of volume gecontroleerde ventilatoren als positief of negatief ventilatie kan worden gebruikt met deze EVLP systeem. Voor de rat model, hebben we gevonden met behulp van positieve druk, volume gecontroleerde ventilatie werkt goed bij teugvolumes tussen 4-10 ml / kg en bij positieve eind-expiratoire druk (PEEP) tussen 2-8 cmH ₂ O. Echter, een PEEP van 8 cmH ₂ O een mogelijke breuk veroorzaken bij de splitsing van de luchtpijp. Na elk experiment (of aantal experimenten als back-to-back uitgevoerde), de ontluchtingsleiding die naar de luchtpijp te worden gereinigd van bronchoalveolaire lavage (BAL) vloeistof die kan zijn gereisd de luchtpijp. Deze vloeistof zal verharden als links onaangeroerd en kan de ventilatie-lijn volledig te blokkeren.

Het perfusaat samenstelling essentieel voor een succesvolle EVLP experiment. Een 5% dextraan mengsel laat longperfusie dat dicht bij fysiologische omstandigheden handhaaft een stabiele oncotische druk fluïdum b rijdenack in het vaatstelsel om oedeem te voorkomen en voorkomt trombose in de longvaten. Het is belangrijk op te merken dat sommige soorten ratten allergisch dextran waarvan longoedeem ²⁰ kan leiden kan. De inhoud van het perfusaat was consistent in alle experimentele groepen in deze studie ook de dextraangehalte niet confounder zijn. De oncotische druk een kritieke variabele die het potentieel verbeteren of produceren weefsel oedeem. Commercieel verkrijgbare perfusie-oplossingen die zijn geoptimaliseerd voor koude statische opslag of normotherme longperfusies zijn gebruikt bij dit systeem long levensvatbaarheid malen te verhogen. We merken dat sommige van deze oplossingen bevatten albumine en een zorg is de mogelijkheid runderalbumine welke leidt tot een ontstekingsreactie in de knaagdierlong. Hoewel een optimale perfusaat samenstelling een lopend onderwerp van onderzoek, de perfusievloeistof dient rekening te houden met de oncotische druk, de osmotische druk en buffercapaciteit. Wbevelen e de oplossing gebaseerd op een gemodificeerde Krebs-Henseleit oplossing of celkweekmedium. De oncotische druk moet worden gehandhaafd door dextran of albumine, afhankelijk van de toepassing. De perfusie druk en debiet van invloed op het orgel en supra-fysiologische perfusieparameters kan het orgel gevoelig voor mechanische trauma te maken.

Visuele indicatoren tijdens Experiment:

Er zijn vele visuele aanwijzingen en aanduidingen uit real-time data die kunnen worden gebruikt om te bepalen of een EVLP experiment goed functioneert. De long is even groot blijven en leeglopen om hetzelfde volume na elke ademhaling. Er zal ook geen lekken uit de longen zelf. De PVR, longgewicht, en de naleving zal relatief constant blijven. Productie van zuurstof zal constant blijven of licht stijgen.

Er zijn vele visuele indicatoren als de longen gecompromitteerd tijdens een experiment. De long wordt oedemateus eennd groeit snel in omvang en gewicht. De kleur van de longen verandert (van een beige-roze tot wit) en zakken van vloeistof kan worden geïdentificeerd in het weefsel. Indien de trachea of longen breuken van barotrauma of meer distensie, zal er borrelen van het punt van verwonding (figuur 12B). Productie van zuurstof zal afnemen en de PVR en de naleving zal drastisch toenemen als goed.

De mogelijkheden voor het gebruik van een EVLP model op kleine dieren zoals knaagdieren opent de deur voor toekomstige studies betere behandeling van long transplantaties. De kleine diermodel vereist een beter begrip van een longtransplantatie werkelijk nabootsen. Dit model kan worden gebruikt in de toekomst medische behandelingen te verbeteren en vast basislijn parameters voor toekomstig longtransplantatie studies.