Метод Изолированные<em> Ex Vivo</em> Легких перфузии в крысиной модели: уроки, извлеченные из Разработка EVLP программы Rat
Summary
Экс-Vivo легких перфузии (EVLP) позволило трансплантация легких у людей, чтобы стать более доступными, позволяя возможность оценить органы и расширению донорской бассейн. Здесь мы опишем развитие программы крыса EVLP и уточнений, которые позволяют воспроизводимым образцом для будущего расширения.
Abstract
Количество допустимых легких донор для трансплантации легких сильно ограничена из-за плохого качества. Экс-Vivo легких перфузии (EVLP) позволило трансплантация легких у людей, чтобы стать более доступными, позволяя возможность оценить органы и расширению донорской бассейн. Поскольку эта технология расширяет и совершенствует, способность к потенциально оценки и повышения качества некачественных легких перед трансплантацией является острая необходимость. Для того, чтобы более строго оценивать эти подходы, воспроизводимая модель животного должно быть установлено, что позволит для тестирования усовершенствованных методов и управления пожертвованных легких, а также адресата легких трансплантации. Кроме того, модели на животных EVLP попутного патологий, например, вентиляция поражении легких (VILI), обеспечит новый метод оценки методов лечения этих патологий. Здесь мы опишем развитие крысиного программы легких EVLP и уточнений к этому меняТПК, которые позволяют воспроизводимым образцом для будущего расширения. Мы также описать применение этого EVLP системы для моделирования Вили в легких крыс. Цель состоит в том, чтобы обеспечить научному сообществу ключевой информации и «жемчужины мудрости» / методов, которые возникли из проб и ошибок, и решающее значение для создания системы EVLP, что является надежной и воспроизводимой.
Introduction
Клиническое значение
Существует в настоящее время нехватка подходящих легких, доступных для трансплантации только 19% легких, находящихся в состоянии быть использованы на национальном приводит к затяжной время ожидания, список или больных, умирающих в ожидании трансплантации 1. Нехватка может быть связано с более старых доноров, травмой, инфекцией, мульти-системы органной недостаточности, а иногда и раненых донорских лёгких на урожай 2. Кроме того, легких хрупкая орган за пределами грудной полости и стандартных методов перевозки и сохранения может привести к ухудшению и нежизнеспособных легких. Таким образом, поддержание и улучшение жизнеспособности легких экс-VIVO в последнее время стал основным направлением в трансплантации легких медицины.
Экс-естественных легких перфузии (EVLP)
Экс-естественных легких перфузии (EVLP) превратилась в постоянно заливать органы проходят оценку для трансплантации и позволяет период оценки, что всепотоки для потенциала реанимации легких или восстановления. EVLP может продлить общей из органов тела ишемии и позволяют донорских органов путешествовать дальше расстояния 3. Как правило, легкие вентилируются в размере 50% общей емкости легких или 20 CMh 2 O пика давления в дыхательных путях с долей кислорода во вдыхаемом воздухе (FiO 2) от 30% до 50% 4. Сохранение раствор перфузии при 40-60 мл / кг (приблизительно 40% от предсказанного сердечного выброса 100 мл / кг) у человека и крупных животных 5,6, но перфузии около 20% от сердечного выброса у крыс 7. Включение решения Стин позволило человека легкие путешествовать в условиях РТ без развития отека легких 9. Эта новаторская работа была уточнена Университета Торонто легких трансплантации Program 10-13 и в настоящее время оценивается в целях совершенствования оценки предельных легких доноров для трансплантации 14,15. Тем не менее, оптимальный ventilatioп и перфузии условия, необходимые для восстановления маргинальных и / или суб-стандартных легкие для трансплантации не известен, и в настоящее время активной областью исследований.
Изолированные системы легких перфузии были использованы в небольших животных, чтобы вызвать повреждение легких, заново создать респираторных заболеваний, и заливать легкие с различными решениями для предотвращения ишемического повреждения. Следователи создали небольшой животной модели трансплантации легких с помощью изолированную систему легких, перфузии, чтобы имитировать протоколы EVLP, которые могут быть использованы в организме человека и крупных животных 16-18. Тем не менее, это экспериментальная модель имеет много проблем в отношении различных методов и параметров, используемых для имитации физиологии человека. В частности, есть много тонкостей в поддержании жизнеспособности легких во время EVLP. Эти тонкости могут возникнуть из-за различий в лесозаготовительной техники, положительных значениях вентиляции давления, Перфузат состава и расхода условиях и катетеризации легких. Therefore, цель здесь заключается в обеспечении научно-исследовательского сообщества с рядом неисправностей и реализации советов, которые мы нашли в счете до надежный метод для реализации EVLP в модели грызунов.
Protocol
Representative Results
Discussion
СИСТЕМА МОНИТОРИНГА
Какие вещи выглядеть, когда эксперимент работает хорошо:
После того, как канюли были помещены в цепи и легкие вентиляции, есть несколько способов гарантировать, что система работает нормально. Там не должно быть никаких утечек перфузата всей линии. Легочное сосудистое сопротивление (PVR) должны оставаться относительно постоянной (при условии постоянного потока). Кислородный обмен должен увеличиться сразу вентилятор работает должным образом и расширения легких набрать больше альвеол для газообмена. 12А показывает надлежащую вентиляцию и перфузию легких, связанные с цепью EVLP внутри искусственного грудной клетки.
Какие вещи выглядеть, когда эксперимент не работает хорошо:
Есть несколько общих вопросов, которые имели самый высокий уровень наступления в начальной стадии эксперимента EVLP. Первый и самый простой тО средством является утечка в соответствии выходящего из легких. Это заметно по луже перфузата объединения в соответствии с частью схемы и уровень жидкости в бачке постоянно уменьшается. Проверьте и подтяните все разъемы трубы в районе разлива и осмотрите саму трубку для утечки. Если это происходит утечка до легких, оно также может ввести пузырьков в легких. Это должно быть исправлено как можно быстрее, как пузырьки воздуха в перфузат может привести к повреждению ткани и вызвать значительное увеличение PVR. Там также может быть утечка идет из легких или одного из канюли. Это может быть вызвано либо проскальзывание канюли или обструкции в выходящей линии вызывая повышение давления. Проверьте положение для обеих канюли, чтобы гарантировать ни поскользнулся или витой. Давление Па также должны быть проверены в ходе этого процесса, потому что мгновенно увеличение Звуковая давления явный признак, что обструкция какой-то недавно произошло. Рисунок 12BВыставки разрывом легкого, разрушившие из-за высоких давлениях. Утечка из самого легкого может также быть вызвано разрывом в ткани. Эта проблема может быть или не быть устранен, но репозиционирование и затяжки канюли является лучшим вариантом в этом сценарии.
Основные учебные Точки / возможности:
Судебная и развитие погрешность экс-естественных системе легких перфузии позволило нам определить несколько ключевых вопросов, которые мы приводим здесь, чтобы способствовать эффективной реализации системы EVLP. Во-первых, по отношению к закупок, важно, что стандартные методики анестезирующие следуют правильно анестезии животных (достаточно анестезии, инъекции в брюшину) и соблюдение всех стратегий IACUC требуется. Канюли (показано на рисунке 13 A, B, и C) должна быть повторно промыть, чтобы удалить какой-либо сгусток и / или мусор внутри легких vasculatЮр. Что касается выбора животного, мы рекомендуем использовать Sprague Dawley или крыс Льюиса весом 250-350 г. Особое внимание должно быть принято, когда cannulating крыс весом около 250 г, так как сосуды будут меньше и, следовательно, гораздо труднее вводить иглу без повреждения сосудов. Если мелкие крысы, или модель мыши, должен быть использован, меньше канюли возможно, должны быть использованы.
Трахеи катетеризации обычно не сложные тех пор, пока шовный материал прикреплен должным образом, первый прохождения шелковой нитью кзади от трахеи после рассечения окружающих панель и до катетеризации. Следуйте этому с передней разрез 1-2 кольца трахеи выше шва пройти канюли. Tie квадратных узлов в период между кольцами трахеи, чтобы обеспечить его в паз для большей безопасности (фиг.4С). Катетеризации легочной артерии (ПА) является более сложным по сравнению с трахеи канюли. Следующие шаги были использованы в этом исследованииДля этой процедуры. Во-первых, понять верхушки сердца с парой щипцов. Передайте еще пару щипцов в поперечный синус и продеть нить, чтобы закрепить канюлю в проксимальных ПА. Сразу Надрезать правый желудочек до правого желудочка путей оттока (RVOT) (рис 14а). После разрез в RVOT, канюли будет руководствоваться в сторону легких оттока артерии тракта. Наличие шва в положении позади легочной артерии / аорты перед правой ventriculotomy повышает эффективность (5С). Канюли должен быть закреплен в месте с шва, чтобы предотвратить смещение. Основным осложнением может произойти, если канюли ПА не находится в правильном анатомическом положении. Канюля может быть вставлен слишком далеко, и только заливать один филиал или стать неправильное позиционируется закручивания образца сердце-легкие после удаления из грудной полости. Это может быть легко ориентированных обратно в исходное положение, чтобы сохранить надлежащее угол anatomiкал положение. Наконец, в левом предсердии (ЛП) катетеризация является наиболее сложной частью процедуры. LA канюли должен быть помещен в левом предсердии. С тканями будучи чрезвычайно рыхлая, иметь в виду, чтобы не использовать значительную силу или скручивание, чтобы предотвратить разрыв в легочной вены и левое предсердие, которое позволило бы сделать эксперимент невозможно спасти. PA канюли лучше всего поместить перед канюли LA. Левый ventriculotomy с удалением вершины было показано, нарушить cordae tendinae и позволяют более легкий доступ через митральный листовок. Кроме того, ventriculotomy облегчает расширяются и визуализировать митрального клапана и кормить канюли через митрального клапана. Расширение митрального клапана кольца с парой небольших тупыми концами пикапов может быть сделано для того, чтобы визуализировать тракта в Лос-Анджелесе (рис 14В). Шов должен быть помещен позади сердца, прежде чем катетеризации. Это может быть сделано просто путем подъема сердце с использованием пара Smalл затупляли пикапы и размещение шва снизу и через сердце. LA теперь готов к канюлируют. Поток канюли LA через пикапов для того, чтобы должным образом визуализировать размещение канюли в левое предсердие. Соблюдайте особую осторожность, чтобы не сместить канюли обратно в левый желудочек. Затем шов должен быть надежно закреплен вдоль миокарда левого желудочка. Закрепление нити в левое предсердие может закрывать всю или часть канюли.
Во время процедуры, очень важно, чтобы воздух не останется в разделе притока аппарата. Любое значительное воздух может производить воздушная эмболия увеличить PVR (эффективно "воздух-Lock"), которая приведет к гораздо более низкой перфузата потока для данного давления. Различные точки могут быть использованы для удаления воздуха в системе. Воздух в разделе выпускной ожидается и не должны иметь каких-либо вредное воздействие на легкие. Свиной модель для легочной гипертензии былПоказано, чтобы воссоздать патологию от непрерывных небольших количеств воздуха в течение 8-недельного периода. Увеличилась воздуха уменьшается количество перфузии настоящее время вызывая воспаление окружающих тканей 19.
Инициирование перфузии может возникнуть после того, как будет завершена катетеризации, но до того, как трубка идет от LA подключен к линии EVLP. Перфузат должны проходить через очистить сгустков крови, и это Перфузат может выбрасывать в стенке грудной клетки без каких-либо проблем. Переключение Перфузат насос в ручной режим и медленно увеличивая расход до ~ 2 мл / мин позволяет внимательно следить за давлением PA. Давление в течение 20-30 CMh 2 O может указывать на обструкцию и наблюдая за перфузат, выходящего из LA также индикатором, но это может быть очень трудно увидеть. Если давление не увеличивается до более чем 20-30 CMh 2 O, остановите насос и проверьте оба cannulations. После того, как давление постоянно вокруг 10-20 CMH 2 O позволяют йе Перфузат запустить через и в грудной полости в течение 2 мин. В это время линия из Лос-Анджелеса может быть подключен к цепи EVLP. Перфузат скорость насоса может быть увеличена до 5-10 мл / мин. Как глава жидкости проходит через цепи, будет увеличение давления PA-за увеличения высоты головки жидкости и, следовательно, статического давления. Если жидкость не может протекать через самую высокую точку на линии, это может быть необходимо, чтобы либо применить всасывающее усилие на противоположном конце линии или попытка снизить высокий часть линии. После того, как этот вопрос будет преодолен, Перфузат должны циркулировать без каких-либо проблем.
Несколько вопросов должны быть проверены по отношению к искусственной вентиляции легких. Во-первых, крутящий бронхов / трахеи и положение сердца и легких может возникнуть в легкие становятся более отечной и увеличение веса. Это важно для канюли оставаться в относительно тесной анатомическом положении, поэтому изменение одной или обеих канюлие может быть необходимым. Давление или объем контролируется вентиляторы, а также положительная или отрицательная вентиляция может быть использован с этой EVLP системы. Для модели крыс, мы нашли с помощью положительного давления, объема вытяжной вентиляции работает хорошо на приливных объемов между 4-10 мл / кг и при положительном давлении в конце выдоха (PEEP) между 2-8 CMh 2 O. Тем не менее, писк 8 CMh 2 O может привести к возможным разрыв в области бифуркации трахеи. После каждого эксперимента (или набор экспериментов, если выполняется спиной к спине), вентиляция линия, ведущая к трахее должен быть очищен от любой бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ), которые могут путешествовали вплоть трахеи. Эта жидкость затвердеет, если остались нетронутыми, и может полностью блокировать вентиляционные линии.
Перфузат состав имеет решающее значение для успешного эксперимента EVLP. 5% декстран смесь позволяет легких перфузии, которая близка к физиологическим условиям, сохраняет стабильную онкотическое давление, чтобы управлять жидкости ВПодтверждено в сосудистую чтобы предотвратить отек и препятствует тромбообразованию в легочных сосудах. Важно отметить, что некоторые виды крыс может быть аллергия на декстран, которые могут вызвать отек легких 20. Содержание перфузат было одинаковым во всех экспериментальных группах в данном исследовании, поэтому декстран содержание не должно быть confounder. Онкотическое давление из важнейших факторов, который имеет потенциал для улучшения или производить отек тканей. Коммерчески доступные растворы перфузии, которые оптимизированы для холодной статического хранения или нормотермических перфузии были использованы в этой системе, чтобы увеличить время жизнеспособности легких. Заметим, что некоторые из этих решений содержит альбумин и один проблемой является возможность бычьего альбумина вызывая воспалительную реакцию в легких грызунов. Хотя оптимальным перфузат состав является постоянным предметом исследований, перфузат необходимо учитывать онкотического давления, осмотическое давление и буферную емкость. Wе рекомендуется раствор быть основана на модифицированной Кребса-раствора или клеточной культуральной среде. Онкотического давления должна поддерживаться декстрана или альбумина, в зависимости от применения. Скорость перфузионное давление и расход влияет органа и наднациональные физиологический параметры перфузии может сделать орган склонны к механической травмы.
Визуальные индикаторы В ходе эксперимента:
Есть много визуальные подсказки, а также указания по данным в режиме реального времени, которые могут быть использованы для определения, если эксперимент EVLP работает хорошо. Легких останется такой же размер и будет сдуваться в том же объеме после каждого вздоха. Там также не будет протекать от самого легкого. PVR, вес легких, и соблюдение будет оставаться относительно постоянной. Производство кислорода будет оставаться постоянным или незначительно увеличиться.
Есть много визуальные индикаторы, когда легких становится нарушена во время эксперимента. Легких становится отечной Ай быстро увеличивается в размере и весе. Цвет изменениями в легких (от тан-розового до белого) и карманы жидкости может быть идентифицирована в ткани. Если трахеи или легких разрывов от баротравмы или более живота, будут барботирования с точки травмы (фиг.12В). Производство кислорода будет уменьшаться, а PVR и соблюдение позволит значительно увеличить, а также.
Потенциал, используя EVLP модель на мелких животных, таких как грызуны открывает двери для будущих исследований, улучшающих лечение трансплантации легких. Тем не менее, маленькая модель животного требует лучшего понимания по-настоящему подражать трансплантацию легких. Эта модель может быть использована в будущем для улучшения медицинского лечения и определить базовые параметры для будущих исследований трансплантации легких.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить за помощь Гарвардского аппарата, особенно Стефани Pazniokas, MS (Физиология системы и регенеративной медицины) за их помощь в цепи сборки, модификации и поиска неисправностей в цепи перфузии и XVIVO перфузии (Daniel Мартинелли, КПК, CTP) для обеспечивая не-клиническое применение легких плегией.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| IPL-2 Basic Lung Perfusion System | Harvard Apparatus | ||
| Tweezer #5 stainless steel, curved 11cm | Kent Scientific Corporation | IND500232 | |
| Tweezer #5 Dumostar, 11cm | Kent Scientific Corporation | INS500085-A | |
| Tweezer #7 Titanium, 12cm tips curved | Kent Scientific Corporation | INS600187 | |
| McPherson-Vannas Scissors 8cm, Str 5mm | Kent Scientific Corporation | INS14124 | |
| Vannas Scissors 8cm Str 5mm | Kent Scientific Corporation | INS14003 | |
| Instrument Sterilization Tray 5" x 7" | Kent Scientific Corporation | INS800101 | |
| Heparin 30,000 units per 30mL | APP Pharmaceuticals | Supplied from OSU Pharmacy | |
| Ketamine 500mg per 5mL | JHP Pharmaceuticals | Supplied from OSU Pharmacy | |
| Xylazine 100mg per 1mL | Akorn | Supplied from OSU Pharmacy | |
| 10cc insulin syringe 29 Ga x 1/2" needle | B-D | 309301 | |
| Hyflex NBR | Ansell | S-17310M | Bite proof gloves |
| BL1500 | Sartarius | Practum 1102-1S | Scale |
| Large Flat Bottom Restrainer | Braintree Scientific Inc | FB L 3.375 dia x 8.5, 250-500gm rat | Rat tunnel for injection |
| Sterling Nitrile Powder-free Exam Gloves, Large | Kiberly-Clark | 50708 | |
| Rapidpoint 405 | Siemens | blood gas analyzer | |
| Fiberoxygenator D150 | Hugo Sachs Elektronik | PY2 73-3762 | |
| LabChart v7.3.7 | ADInstruments | ||
| Tracheal cannula | Harvard Apparatus | 733557 | |
| Pulmonary Artery cannula | Harvard Apparatus | 730710 | |
| Left Atrium cannula | Harvard Apparatus | 730712 | |
| Peristaltic Pump | Ismatec | ISM 827B | |
| Small Animal Ventilator model 683 | Harvard Apparatus | 55-000 | |
| Ecoline Star Edition 003, E100 | Lauda | LCK 1879 | Water Heater |
| Tubing Cassette | Cole-Parmer | IS 0649 | |
| Connect kit D150 | Cole-Parmer | VK 73-3763 | |
| PowerLab 8/35 | ADInstruments | 730045 | |
| TAM-A transducer amplifier module type 705/1 | Hugo Sachs – Harvard Apparatus | 73-0065 | |
| TAM-D transducer amplifier type 705/2 | Hugo Sachs – Harvard Apparatus | 73-1793 | |
| SCP Servo controller for perfusion type 704 | Hugo Sachs – Harvard Apparatus | 732806 | |
| CFBA carrier frequency bridge amplifier type 672 | Hugo Sachs – Harvard Apparatus | 731747 | |
| VCM ventilator control module type 681 | Hugo Sachs – Harvard Apparatus | 731741 | |
| TCM time control module type 686 | Hugo Sachs – Harvard Apparatus | 731750 | |
| IL2 Tube set for perfusate | Harvard Apparatus | 733842 | |
| Tube set for moist chamber | Harvard Apparatus | 73V83157 | |
| Tygon E-3603 Tubing 2.4mm ID | Harvard Apparatus | 721017 | perfusate line entering lung |
| Tygon E-3603 Tubing 3.2mm ID | Harvard Apparatus | 721019 | perfusate line leaving lung |
| low potassium dextran glucose solution | flushing the lung |
References
- . . United States Organ Transplantation, Organ Procurement and Transplantation Network & Scientific Registry for Transplant Recipients Annual Report 2011. , (2011).
- Maathuis, M. H., Leuvenink, H. G., Ploeg, R. J. Perspectives in organ preservation. Transplantation. 83, 1289-1298 (2007).
- Cardoso, P. F. New perspectives in lung transplantation: from conventional preservation to ex vivo lung perfusion and lung reconditioning. Jornal brasileiro de pneumologia : publicacao oficial da Sociedade Brasileira de Pneumologia e Tisilogia. 35, 1057-1059 (2009).
- DeCampos, K. N., Keshavjee, S., Liu, M., Slutsky, A. S. Optimal inflation volume for hypothermic preservation of rat lungs. The Journal of heart and lung transplantation : the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 17, 599-607 (1998).
- Perrot, M., et al. Report of the ISHLT Working Group on Primary Lung Graft Dysfunction part III: donor-related risk factors and markers. The Journal of heart and lung transplantation : the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 24, 1460-1467 (2005).
- Mulloy, D. P., et al. Ex vivo rehabilitation of non-heart-beating donor lungs in preclinical porcine model: delayed perfusion results in superior lung function. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 144, 1208-1215 (2012).
- Noda, K., et al. Successful prolonged ex vivo lung perfusion for graft preservation in rats. European journal of cardio-thoracic surgery : official journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 45, e54-e60 (2014).
- Perrot, M., Liu, M., Waddell, T. K., Keshavjee, S. Ischemia-reperfusion-induced lung injury. American journal of respiratory and critical care medicine. 167, 490-511 (2003).
- Steen, S., et al. Transplantation of lungs from a non-heart-beating donor. The Lancet. 357, 825-829 (2001).
- Perrot, M., et al. Strategies to optimize the use of currently available lung donors. The Journal of heart and lung transplantation : the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 23, 1127-1134 (2004).
- Cypel, M., et al. Technique for prolonged normothermic ex vivo lung perfusion. The Journal of heart and lung transplantation : the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 27, 1319-1325 (2008).
- Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo perfusion prevents lung injury compared to extended cold preservation for transplantation. American journal of transplantation : official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 9, 2262-2269 (2009).
- Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo lung perfusion in clinical lung transplantation. The New England journal of medicine. 364, 1431-1440 (2011).
- Cypel, M., et al. Normothermic Human Ex Vivo Lung Perfusion (EVLP) for Improved Assessment of Extended Criteria Donor Lungs for Transplantation. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 28, S126-S126 (2009).
- Sanchez, P. G., et al. Normothermic Ex Vivo Lung Perfusion as an Assessment of. Marginal Donor Lungs – The NOVEL Lung Trial. J Heart Lung Transpl. 32, S16-S17 (2013).
- Pego-Fernandes, P. M., et al. Experimental model of isolated lung perfusion in rats: first Brazilian experience using the IL-2 isolated perfused rat or guinea pig lung system. Transplantation proceedings. 42, 444-447 (2010).
- Pego-Fernandes, P. M., et al. Experimental model of isolated lung perfusion in rats: technique and application in lung preservation studies. Jornal brasileiro de pneumologia : publicacao oficial da Sociedade Brasileira de Pneumologia e Tisilogia. 36, 490-493 (2010).
- Niemeier, R. W. The isolated perfused lung. Environmental health perspectives. 56, 35-41 (1984).
- Zhou, X., et al. A pulmonary hypertension model induced by continuous pulmonary air embolization. The Journal of surgical research. 170, e11-e16 (2011).
- Harris, J. M. Differences in responses between rat strains and colonies. Food and cosmetics toxicology. 3, 199-202 (1965).
