배아의 몸의 다른 크기에 의해 유도 다 능성 줄기에서 망막 색소 상피 세포 (RPE)를 도출 (IPS) 세포
Summary
이 보고서의 목적은 배아 체의 다른 크기를 이용하여 유도 된 다 능성 줄기 (IPS) 세포로부터 망막 색소 상피 (RPE)를 도출하는 프로토콜을 기술한다.
Abstract
Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of techniques to reprogram somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells has generated interest and excitement towards the possibility of customized personal regenerative medicine. However, the efficiency of stem cell differentiation towards a desired lineage remains low. The purpose of this study is to describe a protocol to derive retinal pigment epithelium (RPE) from iPS cells (iPS-RPE) by applying a tissue engineering approach to generate homogenous populations of embryoid bodies (EBs), a common intermediate during in vitro differentiation. The protocol applies the formation of specific size of EBs using microwell plate technology. The methods for identifying protein and gene markers of RPE by immunocytochemistry and reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) are also explained. Finally, the efficiency of differentiation in different sizes of EBs monitored by fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis of RPE markers is described. These techniques will facilitate the differentiation of iPS cells into RPE for future applications.
Introduction
유도 된 다 능성 줄기 (IPS) 세포 외적 요인으로 성인 1 셀 재 프로그래밍에 의해 도출 된 다 능성 줄기 세포의 유형이다. 대조적으로, 배아 줄기 세포 (는 ESC), 다 능성 줄기 세포의 다른 유형은, 2-3 배반포의 내부 세포 덩어리로부터 생성된다. 서로 다른 기원에도 불구하고, 유도 만능 줄기 세포와는 ESC는 체외에서 어떤 세포 유형 4-5로 분화하는 능력에 복제 할 수있는 자신의 무제한 용량의 비교입니다. 유도 만능 줄기 세포의 이러한 특성은 그들에게 개인화 된 재생 의학의 애플리케이션에 이상적 후보를합니다. 최근의 연구 노력은 망막 색소 상피 (RPE) 6-11 포함 전문 성인 세포를 제조하기위한 강력한 분화 프로토콜 개발에 초점을 맞추고있다.
만능 줄기 세포 유래의 잠재적 임상 적용의 경우, 특정 세포 유형에 대한 지시 분화 필수적이다. 여러 가지 방법이 있습니다효율성 6-7, 12-16으로 크게 변화 RPE에 모두는 ESC와 유도 만능 줄기 세포의 직접 분화 발표했다. 우리는 여전히 개발 또는 분화하는 동안 세포 / 조직의 운명을 지배하는 분자 이벤트의 많은 모른다. 최근 몇년 최대한 학적 개발을 모방 할 수 분화 프로토콜을 개발하기위한 노력이 이루어지고있다. 배반포 단계에서 줄기 세포의 커밋되지 않은 인구는 세 가지 차원 미세 환경에서 함께합니다. 따라서, 다양한 전략이 함께 조립 ESC / 만능 줄기 세포를 만들어 입체적으로 그들을 성장에 적용되었다. 이러한 줄기 세포 집합체는 배아 체 (사채)이라고합니다. 연구는 줄기 세포의 분화 EB는 배아 발달의 초기 단계를 모사하고 자발적 외면에 원시 내배엽을 야기 할 수 있음을 보여 주었다. EB 개발이 진행됨에 따라 나중에 세 생식 계통의 분화 된 세포의 표현형은 17 ~ 18이 나타납니다. 목erefore, 사채를 기반으로 차별화 프로토콜은 ESC / 유도 만능 줄기 세포의 체외 분화에 대한 많은 관심을 끌었다 및 다 능성 줄기 세포 (13)에서 RPE 생성을위한 좋은 후보입니다했다.
사채는 ESC / IPS 세포에서 여러 가지 방법을 사용하여 제조 될 수있다. 처음에는 사채가 부착 식민지를 긁어 및 비 부착 서스펜션 문화를 유지함으로써 이루어졌다. 그러나이 방법은 낮은 재현성이 발생 사채의 이기종 인구를 산출한다. 매달려 드롭 세포 배양 및 마이크로 웰 기반 사채 형성은 매우 재현성 정의 크기의 균일 한 사채를 얻을 사채 형성을위한 다른 인기있는 기술이다. 또한, 마이크로 웰 기법은 적은 노력으로 많은 수의 집합체를 얻을 수있다.
사채 내에서 세포의 분화는 세포와 세포 내 미세 환경에서 형태 형성 큐의 멀티 플렉스에 의해 조절된다. 월의 차별화는 대조적으로olayer 형식, 교환 사채는 세포의 복잡한 어셈블리 (17)를 발생하는 세포 간 신호 전달을위한 플랫폼을 제공합니다. 흥미롭게도, 개별 EB를 만드는 데 사용 능성 줄기 세포의 수는 세포의 운명에 영향을 관찰 하였다. 1000 셀 EB는 적혈구 계보 (20)을 향해 밀어 반면 예를 들어, 인간는 ESC의 조혈 분화 연구에서, 그것은 500 셀 EB는 골수 계통으로 분화를 촉진하는 것이 관찰되었다. 또 다른 연구에서, 작은 사채는 신경 외배엽 분화 (11), (17)으로 승진 큰 사채 반면 내배엽 분화를 선호.
이러한 과거의 연구는 개개의 EB를 강하게 만드는 데 사용 ESC / IPS 세포의 수는 임의의 유형의 세포로 분화를 기반에 영향을 사채 제안. 그러나, 우리의 지식, RPE으로 차별화하기 위해 성향에 사채 크기의 영향을 규명 한 전류 연구는 없다. 본 연구의 목표의 영향을 특성화하는 것이다망막 색소 상피 세포 (IPS-RPE) 분화 및 망막 색소 상피 혈통을 지향 차별화 사채을 할 수있는 최적의 세포 수를 확인하는 – 유도 만능 줄기 (IPS) 세포에 EB 크기입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
세포 치료 용 다 능성 줄기 세포의 전체 약속을 실현하기 위해서는, 일관되고 재생 가능한 방법으로 분화를 조절하는 것이 필요하다. 이 보고서는, 마이크로 웰 플레이트 기술을 사용하여 크기 조절 사채를 형성 RPE으로 분화를 시작하고 RPE의 단백질과 유전자 마커를 식별하기 위해 프로토콜을 설명합니다. 체외 분화를 동기화하려면, 사채의 균일 한 크기는 강제로 집계하여 마이크로 웰 플…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The opinions or assertions contained herein are the private views of the authors and are not to be construed as official or as reflecting the views of the Department of the Army or the Department of Defense. This research was performed while the authors Alberto Muñiz, Ramesh R Kaini, Whitney A Greene and Jae-Hyek Choi held a National Research Council Postdoctoral Research Associateship at the USAISR. This work was supported by U.S. Army Clinical Rehabilitative Medicine Research Program (CRMRP) and Military Operational Medicine Research Program (MOMRP).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| mTeSR1 media + 5X supplement | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | Stem Cell Technologies | 72304 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
| Non essential amino acids | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 supplement | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
| Fetal bovine serum | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Triiodo-l-thyronine sodium salt | Sigma | T6397 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
| Aggrewell 400 plate | Stem Cell Technologies | 27940 | |
| AggreWell medium | Stem Cell Technologies | 5893 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | |
| Mouse Anti-PAX6 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Rabbit Anti- RX antibody | Abcam | Ab23340 | |
| Mouse Anti-MITF antibody | Thermo Scientific | MS-772-P | |
| Rabbit Anti-ZO-1 antibody | Invitrogen | 40-2200 | |
| RNeasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | |
| PCR master mix | promega | M7502 | |
| High capacity RNA to c DNA kit | Life Technologies | 4387406 | |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).
- Reubinoff, B. E., et al. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Buchholz, D. E., et al. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (10), 2427-2434 (2009).
- Ukrohne, T. U., et al. Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4 reprogrammed human induced pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 1 (2), 96-109 (2012).
- Subba, R. M., Sasikala, M., Nageshwar, R. D. Thinking outside the liver: induced pluripotent stem cells for hepatic applications. World J Gastroenterol. 19 (22), 3385-3396 (2013).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
- Mak, S. K., et al. Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage. Stem Cells Int. 2012, 140427 (2012).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Cour la, M., Tezel, T. The Retinal Pigment Epithelium. Advances in Organ Biology. 10, 253-273 (2006).
- Vaajassari, V., et al. Toward the defined and xeno-free differentiation of functional human pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelial cells. Mol Vis. 17, 558-575 (2011).
- Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4 (12), e8152 (2009).
- Muniz, A., et al. Retinoid uptake, processing, and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (1), 198-209 (2014).
- Meyer, J. S., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (39), 16698-16703 (2009).
- Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnol Prog. 25 (1), 43-51 (2009).
- Kurosawa, H. Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells. J Biosci Bioeng. 103 (5), 389-398 (2007).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
- Ng, E. S., et al. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood. 106 (5), 1601-1603 (2005).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
