Ableiten Retinapigmentepithel (RPE) von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) von verschiedenen Größen von Embryoidkörpern
Summary
Das Ziel dieses Berichts ist es, die Protokolle zu beschreiben, um die retinale Pigmentepithel (RPE) von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) mit unterschiedlichen Größen Embryoidkörpern abzuleiten.
Abstract
Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of techniques to reprogram somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells has generated interest and excitement towards the possibility of customized personal regenerative medicine. However, the efficiency of stem cell differentiation towards a desired lineage remains low. The purpose of this study is to describe a protocol to derive retinal pigment epithelium (RPE) from iPS cells (iPS-RPE) by applying a tissue engineering approach to generate homogenous populations of embryoid bodies (EBs), a common intermediate during in vitro differentiation. The protocol applies the formation of specific size of EBs using microwell plate technology. The methods for identifying protein and gene markers of RPE by immunocytochemistry and reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) are also explained. Finally, the efficiency of differentiation in different sizes of EBs monitored by fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis of RPE markers is described. These techniques will facilitate the differentiation of iPS cells into RPE for future applications.
Introduction
Pluripotenten Stammzellen (iPS) -Zellen sind eine Art von pluripotenten Stammzellen durch Umprogrammieren erwachsenen Zellen mit extrinsische Faktoren 1 abgeleitet. Demgegenüber embryonale Stammzellen (WSR), eine andere Art von pluripotenten Stammzelle, aus der inneren Zellmasse des Blastozysten 2-3 erzeugt. Trotz ihrer unterschiedlichen Herkunft iPS-Zellen und WSR in ihrer unbegrenzte Fähigkeit, in vitro und in ihrer Fähigkeit, sich in jeden Zelltyp differenzieren 4-5 replizieren vergleichbar. Diese Eigenschaften der iPS-Zellen machen sie zu idealen Kandidaten für Anwendungen in der personalisierten regenerativen Medizin. Neueste Forschungsanstrengungen auf die Entwicklung von robusten Differenzierungsprotokolle zur Herstellung spezialisierten adulten Zellen einschließlich retinalen Pigmentepithel (RPE) 6-11 konzentriert.
Für mögliche klinische Anwendungen von iPS-abgeleiteten Zellen, ist eine gerichtete Differenzierung für den spezifischen Zelltyp wesentlich. Es gibt verschiedene Methodenzur gerichteten Differenzierung beider WSR und iPS-Zellen in RPE, die sich stark in ihrer Effizienz 6-7, 12-16 variiert veröffentlicht. Wir wissen noch nicht, viele der molekularen Ereignisse, die die Zell- / Gewebe Schicksal während der Entwicklung oder Differenzierung zu regieren. In den letzten Jahren wurden Anstrengungen unternommen, um das Protokoll, das die Differenzierung der Embryonalentwicklung so viel wie möglich nachahmen kann entwickeln. Während der Blastocysten Phase nicht gebundenen Population von Stammzellen sind zusammen in einer dreidimensionalen Mikroumgebung. So wurden verschiedene Strategien angewandt, um die ESC / iPS-Zellen zusammengebaut machen und wachsen sie in drei Dimensionen. Diese Stammzellaggregate Embryoidkörpern (EVG) genannt. Studien haben gezeigt, dass EB Differenzierung von Stammzellen zu imitieren frühen Stadium der Embryoentwicklung und können spontan entstehen primitive Endoderm auf seiner Außenfläche. Später, als EB Entwicklung fortschreitet, differenziert Zellphänotypen aller drei Keimlinien erscheinen 17-18. Therefore haben EVG basiert Differenzierungsprotokolle viel Aufmerksamkeit für die in vitro Differenzierung von ESC / iPS-Zellen angezogen und sind ein guter Kandidat für RPE-Generation von pluripotenten Stammzellen 13.
EVG kann mit verschiedenen Methoden von ESC / iPS-Zellen hergestellt werden. Zunächst wurden EBs durch Abschaben adhärenten Kolonien und ihre Beibehaltung in nicht-haftenden Suspensionskultur gemacht. Dagegen ergibt die dieser Ansatz heterogene Population von EVG, die geringe Reproduzierbarkeit führt. Hängenden Tropfen der Zellkultur und Mikrowell basierend EVG Bildung sind weitere beliebte Techniken zur EVG Formation, die homogene EVG definierter Größen, die in hohem Maße reproduzierbar sind zu erhalten. Weiterhin kann die Mikrowelltechnik Vielzahl von Aggregaten mit weniger Aufwand zu erhalten.
Differenzierung von Zellen im EVG durch einen Multiplex von morphogenen Hinweise aus der extra- und intrazellulären Mikro geregelt. Im Gegensatz zur Differenzierung in einem monolayer Format EVG bieten eine Plattform für komplexe Montage von Zellen und interzellulären Signalübertragung auftreten 17. Interessanterweise ist die Anzahl der pluripotenten Stammzellen verwendet, um einzelne EBs machen wurde beobachtet, um das Schicksal von Zellen beeinflussen. Zum Beispiel wird in einer hämatopoetischen Differenzierung Studium menschlicher WSR, wurde beobachtet, daß 500-Zellen EB gefördert Differenzierung gegen myeloider Abstammung wohin 1.000-Zell EB geschoben Richtung Erythroidlinie 20. In einer anderen Studie kleineren EBs begünstigt Endoderm Differenzierung während größere EBs Richtung Neuro Ektoderm Differentiation 11, 17 gefördert.
Diese früheren Studien legen nahe, dass die Zahl der verwendet, um einzelne EVG machen ESC / iPS-Zellen beeinflussen die EVG basierte Differenzierung zu allen Zelltypen. Jedoch nach unserer Kenntnis gibt es keine aktuellen Studien, die die Wirkung der EBs Größe in seiner Neigung aufgeklärt haben, auf RPE unterscheiden. Das Ziel dieser Studie ist es, den Einfluss der kennEB Größe für induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) – retinalen Pigmentepithel (iPS-RPE) Differenzierung und um die optimale Anzahl von Zellen, die EVG für gerichtete Differenzierung gegen RPE-Linie machen, zu identifizieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um die volle Versprechen der pluripotenten Stammzellen für die Zelltherapie zu realisieren, ist es notwendig, ihre Differenzierung konsistent und reproduzierbar zu regeln. Dieser Bericht beschreibt Protokolle Größe gesteuerte EVGs mit Mikrotiterplatte Technologie bilden, initiieren die Differenzierung in Richtung RPE und identifizieren Protein und Gen-Marker der RPE. Um die in vitro Differenzierung synchronisiert wurden homogene Größen EVG durch eine bekannte Anzahl von iPS-Zellen in Mikrotiterplatten durc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The opinions or assertions contained herein are the private views of the authors and are not to be construed as official or as reflecting the views of the Department of the Army or the Department of Defense. This research was performed while the authors Alberto Muñiz, Ramesh R Kaini, Whitney A Greene and Jae-Hyek Choi held a National Research Council Postdoctoral Research Associateship at the USAISR. This work was supported by U.S. Army Clinical Rehabilitative Medicine Research Program (CRMRP) and Military Operational Medicine Research Program (MOMRP).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| mTeSR1 media + 5X supplement | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | Stem Cell Technologies | 72304 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
| Non essential amino acids | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 supplement | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
| Fetal bovine serum | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Triiodo-l-thyronine sodium salt | Sigma | T6397 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
| Aggrewell 400 plate | Stem Cell Technologies | 27940 | |
| AggreWell medium | Stem Cell Technologies | 5893 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | |
| Mouse Anti-PAX6 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Rabbit Anti- RX antibody | Abcam | Ab23340 | |
| Mouse Anti-MITF antibody | Thermo Scientific | MS-772-P | |
| Rabbit Anti-ZO-1 antibody | Invitrogen | 40-2200 | |
| RNeasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | |
| PCR master mix | promega | M7502 | |
| High capacity RNA to c DNA kit | Life Technologies | 4387406 | |
References
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