תאים (iPS) נובע רשתית פיגמנט האפיתל (RPE) מגזע המושרה pluripotent על ידי בגדלים שונים של גופי Embryoid
Summary
מטרת דו"ח זה היא לתאר את הפרוטוקולים לגזור את האפיתל רשתית פיגמנט (RPE) מתאי גזע pluripotent מושרה (iPS) באמצעות גדלים שונים של גופי embryoid.
Abstract
Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of techniques to reprogram somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells has generated interest and excitement towards the possibility of customized personal regenerative medicine. However, the efficiency of stem cell differentiation towards a desired lineage remains low. The purpose of this study is to describe a protocol to derive retinal pigment epithelium (RPE) from iPS cells (iPS-RPE) by applying a tissue engineering approach to generate homogenous populations of embryoid bodies (EBs), a common intermediate during in vitro differentiation. The protocol applies the formation of specific size of EBs using microwell plate technology. The methods for identifying protein and gene markers of RPE by immunocytochemistry and reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) are also explained. Finally, the efficiency of differentiation in different sizes of EBs monitored by fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis of RPE markers is described. These techniques will facilitate the differentiation of iPS cells into RPE for future applications.
Introduction
גזע pluripotent תאים (iPS) מושרה הם סוג של תאי גזע pluripotent נגזר על ידי תכנות מחדש של תאים בוגרים עם גורמים חיצוניים 1. בניגוד לכך, תאי גזע עובריים (ESCs), סוג אחר של תאי גזע pluripotent, נוצרים ממסת התאים הפנימית של הבלסטוציסט 2-3. למרות מקורותיהם השונים, תאי iPS וESCs הם דומים בקיבולת בלתי מוגבלת שלהם לשכפל במבחנה וביכולתם להתמיין לכל סוג תא 4-5. מאפיינים אלו של תאי iPS להפוך אותם למועמדים אידיאליים עבור יישומים ברפואת רגנרטיבית אישית. מאמצי המחקר אחרונים מתמקדים בפיתוח פרוטוקולי בידול חזקים להפקת תאים בוגרים מיוחדים כוללים אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) 6-11.
עבור יישומים קליניים פוטנציאליים של תאי iPS נגזרים, בידול מכוון עבור אותו סוג תא מסוים הוא חיוני. ישנן שיטות שונותפורסם לבידול מכוון של שני תאי iPS ESCs ולרשתית שמשתנית מאוד ביעילות שלהם 6-7, 12-16. אנחנו עדיין לא יודעים שרבים מן האירועים המולקולריים הקובעים את גורל תא / רקמה במהלך פיתוח או בידול. בשנים האחרונות, נעשו מאמצים לפתח פרוטוקול הבידול שיכול לחקות ההתפתחות העוברית ככל האפשר. בשלב הבלסטוציסט, אוכלוסייה לא מחויבת של תאי גזע נמצא יחד במייקרו-סביבה תלת ממדים. אז, אסטרטגיות שונות יושמו על מנת להפוך את תאי ESC / iPS התאספו יחד ולגדל אותם בשלושה ממדים. אגרגטים של תאי גזע אלה נקראים גופי embryoid (EBS). מחקרים הראו כי ההבחנה EB של תאי גזע לחקות שלב המוקדם של התפתחות עובר ואופן ספונטני יכולה להצמיח האנדודרם פרימיטיווי על פני השטח החיצוניים שלה. מאוחר יותר, כפיתוח EB מתקדם, פנוטיפים תאים מובחנים של כל שלוש השושלות נבט מופיעים 17-18. הerefore, פרוטוקולי בידול המבוסס EBS משכו הרבה תשומת לב לבידול במבחנה של תאי ESC / iPS ומועמד טוב לדור הרשתית מתאי גזע pluripotent 13.
EBS יכול להתבצע באמצעות מספר שיטות מESC תאים / iPS. בתחילה, EBS נעשה על ידי גירוד את מושבות חסיד ושמירתם בתרבות השעיה שאינה חסיד. עם זאת, גישה זו מניבה אוכלוסייה הטרוגנית של EBS שגורם לשחזור נמוך. תרבות תליית ירידת תא וmicrowell היווצרות EBS מבוססת טכניקות פופולריות אחרות להיווצרות EBS שיניבו EBS הומוגנית בגדלים מוגדרים, כי הם מאוד לשחזור. יתר על כן, טכניקת microwell יכולה להניב מספר רב של אגרגטים בפחות מאמץ.
התמיינות של תאים בתוך EBS מוסדרת על ידי זמנית רמזי morphogenic ממייקרו-הסביבה התאית ו תאי. בניגוד לבידול ביום שניפורמט olayer, EBS לתת במה להרכבה מורכבת של תאים ואיתות בין תאית להתרחש 17. מעניין לציין, כי מספר תאי גזע pluripotent המשמשים לייצור EBS הבודד נצפה להשפיע על גורלם של תאים. לדוגמא, במחקר בידול hematopoietic של ESCs אדם, זה היה ציין כי 500 התאים EB קידמה בידול כלפי שושלת מיאלואידית ואילו 1,000 התאים EB דחפה כלפי שושלת erythroid 20. במחקר אחר, EBS הקטן העדיף בידול האנדודרם אילו EBS הגדול קידם לבידול נוירו-האאקטודרם 11, 17.
המחקרים האחרונים ממליצים כי מספר תאי ESC / iPS המשמשים לייצור EBS הפרט להשפיע על EBS בידול המבוסס על כל סוגי תאים. עם זאת, למיטב ידיעתנו, אין מחקרים הנוכחיים שהובהרו ההשפעה של גודל EBS בנטייה שלה כדי לבדל את כיוון הרשתית. מטרתו של מחקר זה היא לאפיין את ההשפעה שלגודל EB על גזע pluripotent מושרה תאים (iPS) – אפיתל הפיגמנט ברשתית בידול (iPS-RPE) ולזהות את המספר הסלולרי האופטימלי על מנת להפוך את EBS לבידול מכוון לשושלת הרשתית.
Protocol
Representative Results
Discussion
על מנת לממש את ההבטחה המלאה של תאי גזע pluripotent לטיפול בתאים, יש צורך להסדיר הבידול שלהם באופן עקבי לשחזור. דו"ח זה מתאר פרוטוקולים כדי ליצור EBS-נשלט באמצעות טכנולוגיית גודל צלחת microwell, ליזום בידול כלפי הרשתית ולזהות סמני חלבון וגן של הרשתית. כדי לסנכרן את הבידול במב?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The opinions or assertions contained herein are the private views of the authors and are not to be construed as official or as reflecting the views of the Department of the Army or the Department of Defense. This research was performed while the authors Alberto Muñiz, Ramesh R Kaini, Whitney A Greene and Jae-Hyek Choi held a National Research Council Postdoctoral Research Associateship at the USAISR. This work was supported by U.S. Army Clinical Rehabilitative Medicine Research Program (CRMRP) and Military Operational Medicine Research Program (MOMRP).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| mTeSR1 media + 5X supplement | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | Stem Cell Technologies | 72304 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
| Non essential amino acids | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 supplement | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
| Fetal bovine serum | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Triiodo-l-thyronine sodium salt | Sigma | T6397 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
| Aggrewell 400 plate | Stem Cell Technologies | 27940 | |
| AggreWell medium | Stem Cell Technologies | 5893 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | |
| Mouse Anti-PAX6 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Rabbit Anti- RX antibody | Abcam | Ab23340 | |
| Mouse Anti-MITF antibody | Thermo Scientific | MS-772-P | |
| Rabbit Anti-ZO-1 antibody | Invitrogen | 40-2200 | |
| RNeasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | |
| PCR master mix | promega | M7502 | |
| High capacity RNA to c DNA kit | Life Technologies | 4387406 | |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).
- Reubinoff, B. E., et al. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Buchholz, D. E., et al. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (10), 2427-2434 (2009).
- Ukrohne, T. U., et al. Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4 reprogrammed human induced pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 1 (2), 96-109 (2012).
- Subba, R. M., Sasikala, M., Nageshwar, R. D. Thinking outside the liver: induced pluripotent stem cells for hepatic applications. World J Gastroenterol. 19 (22), 3385-3396 (2013).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
- Mak, S. K., et al. Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage. Stem Cells Int. 2012, 140427 (2012).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Cour la, M., Tezel, T. The Retinal Pigment Epithelium. Advances in Organ Biology. 10, 253-273 (2006).
- Vaajassari, V., et al. Toward the defined and xeno-free differentiation of functional human pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelial cells. Mol Vis. 17, 558-575 (2011).
- Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4 (12), e8152 (2009).
- Muniz, A., et al. Retinoid uptake, processing, and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (1), 198-209 (2014).
- Meyer, J. S., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (39), 16698-16703 (2009).
- Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnol Prog. 25 (1), 43-51 (2009).
- Kurosawa, H. Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells. J Biosci Bioeng. 103 (5), 389-398 (2007).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
- Ng, E. S., et al. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood. 106 (5), 1601-1603 (2005).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
