Afleiden van retinale pigment epitheel (RPE) van induced pluripotent stem (iPS) cellen door verschillende maten van embryoiden Bodies
Summary
Het doel van dit rapport is om de protocollen beschrijven aan de netvliespigmentepitheel (RPE) van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen met behulp van verschillende maten van embryoid lichamen af te leiden.
Abstract
Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of techniques to reprogram somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells has generated interest and excitement towards the possibility of customized personal regenerative medicine. However, the efficiency of stem cell differentiation towards a desired lineage remains low. The purpose of this study is to describe a protocol to derive retinal pigment epithelium (RPE) from iPS cells (iPS-RPE) by applying a tissue engineering approach to generate homogenous populations of embryoid bodies (EBs), a common intermediate during in vitro differentiation. The protocol applies the formation of specific size of EBs using microwell plate technology. The methods for identifying protein and gene markers of RPE by immunocytochemistry and reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) are also explained. Finally, the efficiency of differentiation in different sizes of EBs monitored by fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis of RPE markers is described. These techniques will facilitate the differentiation of iPS cells into RPE for future applications.
Introduction
Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen zijn een soort van pluripotente stamcellen afgeleid door het herprogrammeren van volwassen cellen met extrinsieke factoren 1. Daarentegen embryonale stamcellen (SER), een ander soort van pluripotente stamcellen, worden gegenereerd uit de binnenste celmassa van de blastocyst 2-3. Ondanks hun verschillende oorsprong, iPS cellen en SER vergelijkbaar in hun onbeperkte capaciteit tot replicatie in vitro en in hun vermogen om te differentiëren in elk celtype 4-5. Deze kenmerken van iPS-cellen maken ze ideale kandidaten voor toepassingen in gepersonaliseerde regeneratieve geneeskunde. Recent onderzoek inspanningen zijn gericht op het ontwikkelen van robuuste differentiatie protocollen voor het produceren van gespecialiseerde volwassen cellen waaronder netvliespigmentepitheel (RPE) 6-11.
Voor potentiële klinische toepassingen van iPS afgeleide cellen, een gerichte differentiatie die specifiek celtype is essentieel. Er zijn verschillende methodengepubliceerd voor gerichte differentiatie van zowel SER's en iPS-cellen in RPE dat varieert enorm in hun efficiency 6-7, 12-16. We weten nog steeds niet veel van de moleculaire gebeurtenissen die de cel / weefsel lot regeren tijdens de ontwikkeling of differentiatie. De laatste jaren zijn pogingen gedaan om de differentiatie protocol dat de embryologische ontwikkeling zoveel mogelijk kunnen nabootsen ontwikkelen. Tijdens de blastocyst fase vastgelegde populatie van stamcellen bij elkaar in een driedimensionale micro. Zo werden verschillende strategieën toegepast op de ESC / iPS cellen geassembleerd samen te groeien en ze in drie dimensies. Deze stamcellen aggregaten worden embryoid instanties (EBS) genoemd. Studies hebben aangetoond dat EB differentiatie van stamcellen nabootsen vroeg stadium van embryo-ontwikkeling en kan spontaan ontstaan primitieve endoderm op het buitenoppervlak geven. Later, zoals EB ontwikkeling vordert, gedifferentieerde cel fenotypes van drie kiem lijnen weergegeven 17-18. Therefore, EBS gebaseerd differentiatie protocollen hebben veel aandacht voor in vitro differentiatie van ESC / iPS-cellen aangetrokken en zijn een goede kandidaat voor RPE generatie van pluripotente stamcellen 13.
EVSA's kunnen worden gemaakt met behulp van verschillende methoden van ESC / iPS-cellen. Aanvankelijk, EBS werden gemaakt door het afschrapen van aanhangend koloniën en het handhaven ervan in niet-klevende schorsing cultuur. Echter, deze aanpak levert heterogene populatie van EBS die lage reproduceerbaarheid veroorzaakt. Opknoping druppel celcultuur en microwell gebaseerd EVSA vorming zijn andere populaire technieken voor EVSA formatie die homogeen EVSA van gedefinieerde maten die zijn zeer reproduceerbaar opleveren. Bovendien kan de microwell techniek groot aantal aggregaten opleveren met minder inspanning.
Differentiatie van cellen binnen EBS wordt geregeld door een multiplex van morfogenische signalen uit de extracellulaire en intracellulaire micro-omgeving. In tegenstelling tot differentiatie in een maolayer formaat, EBS een platform voor complexe samenstel van cellen en intercellulaire signalering optreden 17. Interessant is het aantal pluripotente stamcellen gebruikt om individuele EBS maken werd waargenomen dat het lot van cellen beïnvloeden. Bijvoorbeeld, in een hematopoietische differentiatie studie van de menselijke SER, werd waargenomen dat 500-cel EB bevorderde differentiatie naar myeloïde lijn terwijl 1000-cel EB geduwd richting erythroid lineage 20. In een andere studie, kleinere EBS begunstigd endoderm differentiatie terwijl grotere EVSA gepromoveerd naar neuro-ectoderm differentiatie 11, 17.
Deze eerdere studies suggereren sterk dat het aantal ESC / iPS-cellen gebruikt om individuele EBS maken van invloed op de EBS gebaseerde differentiatie naar elke celtypen. Echter, voor zover wij weten, zijn momenteel geen studies die de effecten van EBS grootte zijn toegelicht in de neiging om te differentiëren naar RPE. Het doel van deze studie is om de invloed van de kenmerkenEB grootte op geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS-cellen) – netvliespigmentepitheel (iPS-RPE) differentiatie en om de optimale mobiele nummer aan de EBS te maken voor gerichte differentiatie naar RPE lineage identificeren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Om de volledige belofte van pluripotente stamcellen voor celtherapie realiseren, is het noodzakelijk om hun differentiatie reguleren op consistente en reproduceerbare wijze. Dit rapport beschrijft protocollen op maat bediend EBS behulp microwell plate-technologie te vormen, initiëren differentiatie in de richting van RPE en identificeren van eiwit en gen markers van RPE. Om de in vitro differentiatie synchroniseren, werden homogene groottes van EBS gevormd door bekende aantallen iPS cellen gecentrifugeerd micr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The opinions or assertions contained herein are the private views of the authors and are not to be construed as official or as reflecting the views of the Department of the Army or the Department of Defense. This research was performed while the authors Alberto Muñiz, Ramesh R Kaini, Whitney A Greene and Jae-Hyek Choi held a National Research Council Postdoctoral Research Associateship at the USAISR. This work was supported by U.S. Army Clinical Rehabilitative Medicine Research Program (CRMRP) and Military Operational Medicine Research Program (MOMRP).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| mTeSR1 media + 5X supplement | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | Stem Cell Technologies | 72304 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
| Non essential amino acids | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 supplement | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
| Fetal bovine serum | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Triiodo-l-thyronine sodium salt | Sigma | T6397 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
| Aggrewell 400 plate | Stem Cell Technologies | 27940 | |
| AggreWell medium | Stem Cell Technologies | 5893 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | |
| Mouse Anti-PAX6 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Rabbit Anti- RX antibody | Abcam | Ab23340 | |
| Mouse Anti-MITF antibody | Thermo Scientific | MS-772-P | |
| Rabbit Anti-ZO-1 antibody | Invitrogen | 40-2200 | |
| RNeasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | |
| PCR master mix | promega | M7502 | |
| High capacity RNA to c DNA kit | Life Technologies | 4387406 | |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).
- Reubinoff, B. E., et al. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Buchholz, D. E., et al. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (10), 2427-2434 (2009).
- Ukrohne, T. U., et al. Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4 reprogrammed human induced pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 1 (2), 96-109 (2012).
- Subba, R. M., Sasikala, M., Nageshwar, R. D. Thinking outside the liver: induced pluripotent stem cells for hepatic applications. World J Gastroenterol. 19 (22), 3385-3396 (2013).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
- Mak, S. K., et al. Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage. Stem Cells Int. 2012, 140427 (2012).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Cour la, M., Tezel, T. The Retinal Pigment Epithelium. Advances in Organ Biology. 10, 253-273 (2006).
- Vaajassari, V., et al. Toward the defined and xeno-free differentiation of functional human pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelial cells. Mol Vis. 17, 558-575 (2011).
- Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4 (12), e8152 (2009).
- Muniz, A., et al. Retinoid uptake, processing, and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (1), 198-209 (2014).
- Meyer, J. S., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (39), 16698-16703 (2009).
- Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnol Prog. 25 (1), 43-51 (2009).
- Kurosawa, H. Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells. J Biosci Bioeng. 103 (5), 389-398 (2007).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
- Ng, E. S., et al. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood. 106 (5), 1601-1603 (2005).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
