Summary

ОТВЕТСТВЕННОСТЬ пигментного эпителия сетчатки (НПП) и из индуцированных плюрипотентных стволовых (IPS) клетки по-разному размеры эмбриональных телец

Published: February 04, 2015
doi:

Summary

Цель настоящего доклада состоит в описании протоколов для получения пигментного эпителия сетчатки (НПП) и из индуцированных плюрипотентных стволовых (плюрипотентных) клеток, используя различные размеры эмбриональных органов.

Abstract

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of techniques to reprogram somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells has generated interest and excitement towards the possibility of customized personal regenerative medicine. However, the efficiency of stem cell differentiation towards a desired lineage remains low. The purpose of this study is to describe a protocol to derive retinal pigment epithelium (RPE) from iPS cells (iPS-RPE) by applying a tissue engineering approach to generate homogenous populations of embryoid bodies (EBs), a common intermediate during in vitro differentiation. The protocol applies the formation of specific size of EBs using microwell plate technology. The methods for identifying protein and gene markers of RPE by immunocytochemistry and reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) are also explained. Finally, the efficiency of differentiation in different sizes of EBs monitored by fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis of RPE markers is described. These techniques will facilitate the differentiation of iPS cells into RPE for future applications.

Introduction

Индуцированные плюрипотентные стволовые (IPS) клетки типа плюрипотентных стволовых клеток, полученных путем перепрограммирования взрослых клеток с внешними факторами 1. В отличие от этого, эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), другой тип плюрипотентных стволовых клеток, которые генерируются из внутренней клеточной массы бластоцисты 2-3. Несмотря на их различное происхождение, плюрипотентных клеток и ЭСК сравнимы по их неограниченной мощности, чтобы воспроизвести в пробирке и в их способности дифференцироваться в любой тип клеток 4-5. Эти характеристики плюрипотентных клеток делает их идеальными кандидатами для применения в персональной регенеративной медицины. Последние научно-исследовательские работы сосредоточены на разработке надежных протоколов дифференциации по производству специализированных взрослых клеток, включая пигментный эпителий сетчатки (ПЭС) 6-11.

Для потенциальных клинических применений плюрипотентных клеток, полученных, направленной дифференцировки для этого конкретного типа клеток является существенным. Есть различные методыопубликованы направленной дифференцировки обоих ЭСК и плюрипотентных клеток в ПЭС, что сильно варьируется в их эффективности 6-7, 12-16. Мы до сих пор не знаю, что многие из молекулярных событий, которые регулируют судьбу клеток / ткани в процессе развития или дифференциации. В последние годы, были предприняты усилия для разработки протокола дифференцировки, которые могут имитировать эмбрионального развития, как это возможно. В бластоцисты фазе, неизрасходованный население стволовых клеток вместе в трехмерной микросреде. Таким образом, различные стратегии были применены, чтобы сделать клетки ESC / IPS собраны вместе и расти их в трех измерениях. Эти стволовых клеток агрегаты называются эмбриональные органы (EBS). Исследования показали, что EB дифференцировки стволовых клеток имитировать ранней стадии развития эмбриона и могут самопроизвольно привести к примитивной энтодермы на его внешней поверхности. Позже, по мере развития развития Е.Б., дифференцированная клетка фенотипы всех трех зародышевых линий появляются 17-18. Therefore, EBS на основе дифференциации протоколы привлекли много внимания к дифференцировке в пробирке ESC / IPS клетки и хорошим кандидатом для производства НПП из плюрипотентных стволовых клеток 13.

ЭТ можно сделать, используя несколько методов от регулятора / IPS клеток. Первоначально ЭТ были сделаны соскабливания прилипшие колоний и поддержания их в неадгезированных суспензионной культуре. Тем не менее, этот подход дает гетерогенную популяцию ЭТ, что вызывает низкую воспроизводимость. Висячие культуры клеток падение и микролуночный формирование ЭТ основе Другие популярные методы для формирования ЭТ, которые дают однородные ЭТ определенных размеров, которые легко воспроизводимым. Кроме того, этот метод может дать микролуночный большое количество агрегатов с меньшим усилием.

Дифференцирование клеток в ЭТ регулируется мультиплексированием морфогенетических сигналов от внеклеточной и внутриклеточной микросреды. В отличие от дифференциации в Пнolayer формат ЭТ обеспечить платформу для комплексной сборки клеток и межклеточного сигналов, чтобы произойти 17. Интересно, что наблюдалось количество плюрипотентных стволовых клеток, используемых для отдельных ЭТ влиять на судьбу клеток. Например, в кроветворной исследования дифференциации эмбриональных клеток, было отмечено, что 500-клеточной EB стимулирует дифференциацию к миелоидной то время как 1000-клетки EB толкают к эритроидного линии 20. В другом исследовании, меньше ЭТ выступает энтодермы дифференциацию в то время как более крупные ЭТ способствовало к нервно-ктодерму дифференциации 11, 17.

Эти последние исследования убедительно показывают, что число ESC / IPS клеток, используемых для отдельных ЭТ влияют на ЭТ, основанные дифференциацию любых типов клеток. Однако, по нашим сведениям, не существует каких-либо текущих исследований, которые вскрыли влияние размера EBS в своей склонности к дифференциации к ПЭС. Целью данного исследования является описание влиянияEB размер по наведению стебля плюрипотентных (IPS) клеток – пигментный эпителий сетчатки (IPS-РПЭ) дифференциация и определить оптимальное количество клеток, чтобы сделать ЭТ для направленной дифференцировки в сторону НПП линии.

Protocol

1. Подготовка культуры Реагенты и культуральные планшеты Подготовьте подачи свободной стволовых клеток культуральной среды путем добавления 100 мл 5х бессывороточной дополнение к 400 мл стволовых клеток базальной среде. Носитель является стабильным при 4 ° С в течение до 2-х недель, …

Representative Results

В этом эксперименте, плюрипотентных клетки культивировали и дифференцировались в ПЭС линии от EB. ЭТ контролируемых размеров были сформированы с использованием Планшетный. Как видно на рисунке 1 формирования EB была гомогенной в Планшетный. Эти ЭТ затем собирали и высевали на 6-…

Discussion

Для полной реализации обещание плюрипотентных стволовых клеток для клеточной терапии, необходимо регулировать их дифференцировку в последовательной и воспроизводимой образом. Этот отчет описывает протоколы для формирования контролировали по размеру ЭТ с использованием микролуноч…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The opinions or assertions contained herein are the private views of the authors and are not to be construed as official or as reflecting the views of the Department of the Army or the Department of Defense. This research was performed while the authors Alberto Muñiz, Ramesh R Kaini, Whitney A Greene and Jae-Hyek Choi held a National Research Council Postdoctoral Research Associateship at the USAISR. This work was supported by U.S. Army Clinical Rehabilitative Medicine Research Program (CRMRP) and Military Operational Medicine Research Program (MOMRP).

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
mTeSR1 media + 5X supplement Stem Cell Technologies 5850
Y-27632 (Rock Inhibitor) Stem Cell Technologies 72304
DMEM/F12 Life Technologies 11330-032
2-Mercaptoethanol Sigma M-7154
Non essential amino acids Hyclone(Fisher) SH30853.01
Knockout serum replacement Life Technologies 10828-028
Gentamicin  Life Technologies 15750-060
L-Glutamine Life Technologies 25030-081
MEM media Life Technologies 10370-021
N1 supplement Sigma N-6530-5ML
Taurine Sigma T-8691-25G
Hydrocortisone Sigma H0888-1G
Fetal bovine serum Hyclone(Fisher) SH3008803HI
Triiodo-l-thyronine sodium  salt Sigma T6397
Sodium hydroxide Sigma S5881
Dispase Life Technologies 17105-041
Matrigel BD Biosciences 354277
Phosphate buffered saline Hyclone(Fisher) 10010-023
Aggrewell 400 plate Stem Cell Technologies 27940
AggreWell medium Stem Cell Technologies 5893
Accutase Stem Cell Technologies 7920
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit BD Biosciences 554714
Mouse Anti-PAX6 antibody Developmental Studies Hybridoma Bank
Rabbit Anti- RX antibody Abcam Ab23340
Mouse  Anti-MITF antibody Thermo Scientific MS-772-P
Rabbit Anti-ZO-1 antibody Invitrogen 40-2200
RNeasy plus mini kit Qiagen 74134
PCR master mix promega M7502
High capacity RNA to c DNA kit Life Technologies 4387406

References

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).
  2. Reubinoff, B. E., et al. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  4. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  5. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  6. Buchholz, D. E., et al. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (10), 2427-2434 (2009).
  7. Ukrohne, T. U., et al. Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4 reprogrammed human induced pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 1 (2), 96-109 (2012).
  8. Subba, R. M., Sasikala, M., Nageshwar, R. D. Thinking outside the liver: induced pluripotent stem cells for hepatic applications. World J Gastroenterol. 19 (22), 3385-3396 (2013).
  9. Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
  10. Mak, S. K., et al. Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage. Stem Cells Int. 2012, 140427 (2012).
  11. Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
  12. Cour la, M., Tezel, T. The Retinal Pigment Epithelium. Advances in Organ Biology. 10, 253-273 (2006).
  13. Vaajassari, V., et al. Toward the defined and xeno-free differentiation of functional human pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelial cells. Mol Vis. 17, 558-575 (2011).
  14. Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4 (12), e8152 (2009).
  15. Muniz, A., et al. Retinoid uptake, processing, and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (1), 198-209 (2014).
  16. Meyer, J. S., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (39), 16698-16703 (2009).
  17. Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnol Prog. 25 (1), 43-51 (2009).
  18. Kurosawa, H. Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells. J Biosci Bioeng. 103 (5), 389-398 (2007).
  19. Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
  20. Ng, E. S., et al. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood. 106 (5), 1601-1603 (2005).
  21. Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).

Play Video

Cite This Article
Muñiz, A., Ramesh, K. R., Greene, W. A., Choi, J., Wang, H. Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies. J. Vis. Exp. (96), e52262, doi:10.3791/52262 (2015).

View Video