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Biology

Reinigung der Unreine: Sequencing Metagenomen und Metatranscriptomes von Complex Tierassoziierte Proben

Published: December 22, 2014
doi:
10.3791/52117
, , , , ,
1Department of Biology,San Diego State University, 2DOE Joint Genome Institute, 3Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology,University of Colorado, 4Department of Pediatrics, School of Medicine,University of Colorado

Summary

Mit der Mukoviszidose Atemwege als Beispiel präsentiert das Manuskript eine umfassende Workflow mit einer Kombination aus Metagenom und metatranscriptomic Ansätze, um die mikrobiellen und viralen Gemeinden in Tierassoziierte Proben zu charakterisieren.

Abstract

Die Zugänglichkeit der Hochdurchsatz-Sequenzierung hat viele Bereiche der Biologie revolutioniert. Um Host-assoziierten viralen und mikrobiellen Gemeinschaften besser zu verstehen, wurde ein umfassendes Workflow für die DNA- und RNA-Extraktion entwickelt. Der Workflow gleichzeitig erzeugt viralen und mikrobiellen Metagenomen sowie metatranscriptomes, aus einer einzigen Probe für Next-Generation-Sequencing. Die Kopplung dieser Ansätze bietet einen Überblick über sowohl die taxonomischen Eigenschaften und den Community-Funktionen codiert. Die vorgestellten Methoden Mukoviszidose (CF) Sputum, eine problematische Probentyp, weil es außerordentlich zäh und enthält hohe Menge an Schleimstoffen, frei von Neutrophilen DNA und andere unbekannte Verunreinigungen. Die hier beschriebenen Protokolle zielen diese Probleme und erfolgreich wiederherzustellen viralen und mikrobiellen DNA mit minimaler menschlicher DNA-Kontamination. Um die Metagenomik Studien zu ergänzen, wurde eine metatranscriptomics Protokoll optimiert, um sowohl die mikrobielle erholenund Host-mRNA, die nur relativ wenige ribosomale RNA (rRNA) Sequenzen enthält. Eine Übersicht über die Datenmerkmale wird präsentiert, um als Referenz für die Beurteilung des Erfolgs der Methoden dienen. Zusätzliche CF Sputum-Proben wurden auch auf (i) die Konsistenz der microbiome Profile in sieben aufeinander folgenden Tagen zu bewerten innerhalb eines einzelnen Patienten, und (ii) Vergleichen der Konsistenz von Metagenom-Ansatz zu einer ribosomalen 16S-RNA-Gen-basierte Sequenzierung gesammelt. Die Ergebnisse zeigten, dass eine tägliche Schwankung mikrobiellen Profile ohne Antibiotikum Störung war minimal und die Taxonomie Profile der gemeinsamen CF-assoziierten Bakterien waren sehr ähnlich zwischen den 16S rDNA-Bibliotheken und metagenomes vom hypotonische Lyse (HL) stammenden DNA erzeugt. Jedoch sind die Unterschiede zwischen den 16S rDNA taxonomischen Profile Gesamt-DNA und HL-abgeleiteten DNA erzeugt vorschlagen, dass hypotonische Lyse und die Waschschritte nicht nur das Entfernen des vom Menschen stammenden DNA zu profitieren, sondern auch mikrobielle extracellular DNA, die die tatsächlichen mikrobiellen Profile falsch darstellen kann.

Introduction

Virus- und Bakteriengemeinschaften mit dem menschlichen Körper verbunden sind ausführlich in den letzten zehn Jahren durch den Einsatz von 1,2-Sequenzierungstechnologien untersucht. Die Ergebnisse wurden auf die Anerkennung der Bedeutung Mikroben im menschlichen Gesundheit und Krankheit geführt. Die große Initiative kam von der Normalflora-Projekt, das die Bakterien beschrieben (und einigen Archaeen), die sich auf der menschlichen Haut und in Mundhöhle, Atemwege, des Urogenitaltraktes und Magen-Darm-3. Weitere microbiome Studien von gesunden menschlichen Atemwege durch bronchoalveoläre Lavage (BAL) 4,5 und Nasen-Rachen-Abstrichen 4 haben gezeigt, dass die Lunge als Umweltprobenahmevorrichtung, führt zu transienten mikrobiellen Besiedlung der Atemwege dienen. Allerdings können die Auswirkungen der mikrobiellen Besiedlung in beeinträchtigt Atemwegsoberflächen zu schweren und chronischen Infektionen der Lunge, wie sie bei zystischer Fibrose (CF) Patienten gesehen führen.

t "> CF ist eine tödliche Krankheit, die durch genetische Mutation in Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator (CFTR) -Gen 6 verursacht wird. Diese Mutationen führen zu fehlerhaften CFTR-Proteine, die sich ihrerseits auf den transepithelialen Ionentransport durch die apikale Oberfläche des Epithels. Die Krankheit betrifft mehrere Organsysteme, aber die Mehrheit der Mortalität und Morbidität ist auf CF Lungenerkrankung 7. Der CF Lunge bietet ein einzigartiges Ökosystem für mikrobielle Besiedlung. Der Defekt in Ionentransport verursacht Schleim in den Atemwegen CF aufzubauen, wodurch Mikroumgebungen bestehend aus Aerobic- , mikroaerophilen und anaeroben Abteile durch eine statische nährstoffreichen Schleimhautoberfläche verankert. Diese Umgebung ermöglicht die Ansiedlung und Vermehrung von Mikroben, wie Viren, Bakterien und Pilze. Akute und chronische Lungen mikrobiellen Infektionen führen zu konstant, aber unwirksam Immunantworten, was zu umfangreiche Umbau der Atemwege, Verlust der Lungenkapazität und letztlich Pulmonary Versagen.

Bakteriengemeinschaften mit der CF-Lunge verbunden sind gut beschrieben mit beiden Kultur-abhängigen und kulturunabhängige Ansätze, die mit 16S ribosomale RNA (rRNA) Gensequenzierung 8 und Schrotflinte Metagenomik 9,10 umfassen. Das 16S-rRNA-basierten Ansatz in der Lage, eine breite Palette von Mikrobenarten zu charakterisieren und zu erfassen breiten Verschiebungen Community Vielfalt. Es wird jedoch in seiner Entschließung bei der Festlegung der Gemeinschaften begrenzt (in Claesson et al zusammengefasst. 2010 11) und die Vorhersagen von Stoffwechselpotentiale zu diesen allgemeinen Funktionen für die Taxa identifiziert bekannte begrenzt. Daher sind 16S-rRNA-Gen-Sequenzierungsverfahren nicht ausreichend für die notwendige taxonomische und funktionelle analytische Genauigkeit der verschiedenen Mikroben in CF Lunge vorhanden Gemeinden. Die hier beschriebene Metagenom-Ansatz ergänzt die 16S-rRNA-basierten Ansatz, überwindet seine Grenzen, und ermöglicht eine relativ effektive Artum sowohl die mikrobielle Gemeinschaft Taxonomie und genetische Inhalte in CF Lungen analysieren.

Mikrobielle DNA aus Tierassoziierte Proben isoliert enthält häufig eine große Menge an Wirts-DNA. CF Sputum oder Lungengewebeproben enthalten üblicherweise eine große Menge von Human-DNA durch Neutrophile bei der Immunreaktion freigesetzt wird, häufig mehr als 99% der Gesamt-DNA von 12 bis 14. Obwohl einige intakte humane Zellen vorhanden sein können, die meisten dieser DNA frei in Lösung oder an der Oberfläche der Keime adsorbieren. Darüber hinaus ist die Anwesenheit von außerordentlich viskose Schleimpfropfen, Zelltrümmern und anderen unbekannten Verunreinigungen weiter zu komplizieren Isolierung von mikrobiellen Zellen. Mehrere Verfahren wurden zur Abreicherung diese Proben menschlicher DNA, einschließlich Percoll Gradienten verschiedener menschlicher aus mikrobiellen Zellen 15, die Behandlung mit DNase I, Ethidiumbromid Monoazid um selektiv menschliche DNA 16 und die MolYsis Kit, alle mit begrenztem Erfolg verschlechtern getestet. Um eine möglichst wirkungsvolle mikrobiellen DNA Reinigungsverfahren für CF Sputum Termin wurde eine Modifikation der von Breitenstein et al beschriebenen Verfahren (1995). 17. Dieser Ansatz, der hierin als hypotonische Lyse (HL) Verfahren bekannt ist, verwendet eine Kombination von β-Mercaptoethanol Mucin Disulfidbindungen hypotonische Lyse von eukaryotischen Zellen und DNase I-Behandlung von löslichen DNA 9 reduzieren. Trotz des Mangels an Alternativen der HL Verfahren Anlass zu Bedenken wegen (i) mögliche Verzerrungen von unerwünschten Lyse von Mikroben und (ii) resultierenden, ob die beobachteten Schwankungen der Gemeinschaft Zusammensetzung 9,10 sind ein Artefakt der Varianten mit der Probe assoziiert ist. Zusätzlich zu der Erzeugung von Shotgun metagenomes sprechen wir diese Probleme durch Vergleich der 16S-rRNA-Gen-Profile der gesamten DNA und der HL-Methode unter Verwendung des gleichen Satzes von Sputum-Proben von einem Patienten in sieben aufeinanderfolgenden Tagen gesammelt extrahierte mikrobielle DNA.

ent "> Im Vergleich zu mikrobiellen Gemeinschaften, ist die Charakterisierung von viralen Gemeinden mit Tieren verbunden begrenzte 18,19 Die viralen Gemeinden in CF Atemwege haben nur minimal 20 gekennzeichnet worden -.. 22 Die erste Metagenom-Studie die Charakterisierung der DNA von viralen Gemeinden in CF Atemwege zeigten, dass die meisten Viren mit CF Lunge assoziiert sind Phagen 20. Die metabolische Potential des Phagen in CF und nicht-CF Individuen signifikant verschieden war. Insbesondere die Phage Gemeinschaften in Einzelpersonen CF geführt Gene reflektierende bakterieller Wirts Anpassungen an die Physiologie des CF Atemwege, und bakteriellen Virulenz 20. Im Anschluss Metagenom-Untersuchungen von Viren in CF Lungengewebe zeigten deutliche räumliche Heterogenität der Virus Gemeinden zwischen anatomischen Regionen 22. Darüber hinaus hegte CF Lungengewebe die niedrigste bisher in jedem Ökosystem 22 beobachtet virale Vielfalt. Die meisten Viren identifiziert wurden Phagenmit dem Potential, CF Pathogenen zu infizieren. Jedoch wurden eukaryotischen Viren, wie Herpes-Viren, Adenoviren und menschlichen Papilloma-Viren (HPV) erkannt. In einem Fall, wo Zysten im Lungengewebe wurden bei der Präparation beobachtet wurde, wurde mehr als 99% eines menschlichen Papillomavirus-Genom gewonnen, obwohl der Patient noch nie mit einem Lungen Papillom oder Karzinom diagnostiziert. Dies zeigt, dass die Virus bestehenden Vielfalt spiegelt nicht nur die Schwere der Gewebeschädigung, kann aber auch aussetzen und zu erklären, eine zugrunde liegende nicht charakterisierte Krankheit. Die hier beschriebenen Protokolle bieten eine einfache, aber leistungsfähige Methode, um Virusähnlichen Partikeln (VLPs) von Proben, die von großen Mengen zähen Schleim, Host und mikrobiellen Zellen, freie DNA sowie Zelltrümmer aus isolieren.

Ergänzend Metagenomik ist metatranscriptomics verwendet, um die Dynamik in der Genexpression in der mikrobiellen Gemeinschaft und dem Host 9,23 überwachen. In diesem Fall werden sowohl mikrobielle und Host mRNA müssen bevorzugt ausgewählt werden. Da bakterielle mRNAs nicht polyadenyliert kann ein Oligo-dT-basierten mRNA-Pulldown-Verfahren nicht genutzt werden. Polyadenylierungs-abhängigen RNA-Amplifikation nicht in Host-assoziierte Proben verwendet werden, wenn die Proben bekannt, große Mengen von eukaryotischen mRNA enthält. Viele Tierassoziierte Proben, einschließlich CF Sputum, enthalten eine hohe Dichte der Zellen zusätzlich zu hohe Mengen von Zelltrümmern und Nukleasen, die RNasen einschließen. Daher ist eine weitere Herausforderung umfangreiche RNA-Abbau während der Verarbeitung zu verhindern metatranscriptome. In den meisten Fällen ist der Gesamt-RNA aus CF Sputum extrahiert teilabgebauten, Begrenzen der nachfolgenden Anwendungen und Nutzen des abgeleiteten RNA. In den letzten Jahren verschiedene Ansätze für rRNA Depletion wurden entwickelt und im Handel erhältlichen Kits geeignet. Die Wirksamkeit dieser Ansätze ist jedoch begrenzt, vor allem bei der Arbeit mit teilweise abgebaut rRNA 9,24. Die hier eingesetzten Verfahren erlaubened für das Abfragen von partiell abgebaute Gesamt-RNA für eine effiziente nachgeschaltete Gesamt rRNA Entfernung. Direkter Vergleich der Effizienz in rRNA Entfernung aus teilabgebauten gesamten RNA Vergleich von zwei verschiedenen Kits wurde von Lim et al veranschaulicht. (2012) 9.

Insgesamt ist es das Ziel dieses Manuskripts zu einem kompletten Satz von Protokollen (Abbildung 1), um virale und mikrobielle shotgun metagenomes erzeugen und eine metatranscriptome bereitzustellen, aus einem einzigen Tier assoziierten Probe unter Verwendung induzierter Sputumprobe als Beispiel. Molekulare Labor-Workflow sollten getrennt vor und nach Verstärkung Bereiche umfassen, um eine Kreuzkontamination zu minimieren. Die Methoden sind einfach an anderen Probentypen wie Gewebe 22, Nasen-Rachen-und Oropharynxabstriche 25, Bronchiallavage (BAL) und Korallen (unveröffentlichte Daten). Jede Probe sollte sofort nach der Entnahme verarbeitet vor allem, wenn mikrobielle Metagenomik und eingehalten werdenatranscriptomics Studien erwünscht. Wenn die Proben eingefroren, schränkt sie die Isolierung der intakten mikrobiellen Zellen auf mikrobielle Metagenomen das Einfrieren möglicherweise zu einer Störung der Zellintegrität. Allerdings bedeutet Gefrieren nicht metatranscriptomics und Virusisolierung, aber die Qualität der RNA und der Menge von Viruspartikeln gewonnen kann durch die Frost-Tau-Prozeß betroffen auszuschließen. Es ist wichtig zu beachten, dass induzierten Sputum hat als primäre Quelle der Proben in vielen Studien mit erwachsenen CF-Patienten und anderen chronischen Lungenerkrankungen 26,27 verbunden als BAL kann zu invasiv werden serviert. In unseren Studien wurden Sputum-Proben mit einer sorgfältigen und konsistenten Methode, dh, nach Mundwasser und Spülen der Mundhöhle mit steriler Kochsalzlösung zur oralen Mikroorganismen Kontamination innerhalb der Sputum-Proben auf ein Minimum gesammelt.

Protocol

HINWEIS: induzierte Sputum-Proben wurden in Übereinstimmung mit der University of California Institutional Review Board (HRPP 081.500) und San Diego State University Institutional Review Board (IRB SDSU # 2121) von der Forschungskoordinator der University of California, San Diego (UCSD gesammelt, ) erwachsenen CF-Klinik. 1. Probennahme und Vorbehandlung (Pre-Treat-Proben innerhalb von 30 Minuten nach der Sammlung) Vor der Probenentnahme, Etikett vier 15-ml-Röhrchen als: (i) virale Metagenom, (ii) die mikrobielle Metagenom, (iii) metatranscriptome, und (iv) zusätzliche Sputum. Wiederholen Sie für jede Probe. 2 ml von 0,1-mm-Silicakügelchen in das Röhrchen mit der Aufschrift "Metatranscriptome", gefolgt von 6 ml Guanidinisothiocyanat-basierten RNA Lysepuffer (GITC-Lysepuffer). Während der Probensammlung, sterile Kochsalzlösung (60 ml) als Mundspülung, um eine Kontamination durch orale Bakterien zu minimieren. Sammeln Sputum-Proben über einen 30 Minuten Zeit, nachdem dieInhalation von 4 ml 7% hypertone Salz über einen Vernebler. Prozessproben unmittelbar, wie nachstehend beschrieben. Verdünne die Probe in einem Gesamtvolumen von 8 ml. Schätzen Probenvolumen durch Wiegen leer Sputum Tasse vor und nach der Probenahme. Wenn das Volumen der Probe ist weniger als 8 ml, fügen geeignete Menge von 0,02 um filtrierten 1x PBS, um eine Gesamtprobenvolumen von mindestens 8 ml zu erzeugen. Sofort die Probe zu homogenisieren mit einer 3 ml Spritze, bis keine sichtbaren Klumpen bleiben im Sputum Mit der gleichen Spritze, erarbeiten 2 ml Sputum und fahren Sie sofort mit Schritt 1.4. Konservierungs Gesamt-RNA aus Sputumprobe Spritzen Sie 2 ml Sputumprobe von Schritt 1.3.4 in das "metatranscriptome" Röhrchen mit Kieselsäurekügelchen und GITC-Lyse-Puffer. Schließen Sie den Deckel und verschließen Sie das Röhrchen fest mit Parafilm, um ein Auslaufen zu vermeiden. Homogenisieren Sputum sofort bei mittlerer Geschwindigkeit für 10 kmn. In Abhängigkeit von der verfügbaren Vortexer wird das Reagenzglas horizontal und mit Klebeband, wenn nötig. Halten der Röhre bei 4 ° C oder in einer Eisbox und Transport in das Labor, wenn nötig. Mit der gleichen Spritze aliquoten 2 ml Sputum jeweils in die Rohre "virale Metagenom" und "mikrobielle Metagenom" und leitet die verbleibenden Auswurf von Sputum Tasse in die Röhre "extra Sputum" markiert ist. Speichern Sie alle Röhrchen bei 4 ° C oder Eisbox und Transport ins Labor, wenn nötig. 2. Erstellen von Viral Metagenom Vorbereitung der Puffer und Lösungen Bereiten Sie 50 mM Dithiothreitol (DTT) im Voraus und bei 4 ° C. Dies ist für 2 Wochen stabil. Bereiten Saline Magnesium (SM) Puffer (250 ml): 1 M NaCl, 10 mM MgSO 4, 50 mM Tris-HCl; pH-Wert auf 7,4. Filter zu sterilisieren (0,02 um Porengröße) und bei Raumtemperatur lagern. </li> Bereiten DNase I-Enzym bis 100 U / & mgr; l (in Wasser Molekular grade) von lyophilisiertem Rinderpankreas-DNase I nach der von Dornase Einheiten / mg Trockengewicht definierten Aktivität. Bereiten 10x DNase I Puffer (50 ml): 100 mM MgCl 2, 20 mM CaCl 2; pH-Wert auf 6,5. Filter zu sterilisieren (0,02 um Porengröße) und bei Raumtemperatur lagern. Bereiten Sie 4% Paraformaldehyd. Bereiten 200x TE-Puffer: 2 M Tris-HCl (pH 8,5), 0,2 M EDTA. Filter zu sterilisieren (0,02 um Porengröße) und bei Raumtemperatur lagern. Bereiten Sie 10 ml 10% Natriumdodecylsulfat (SDS) mit Wasser molekularen Klasse. Bereiten Sie 50 ml CTAB / NaCl (10% CTAB. 700 mM NaCl) mit Wasser molekularen Klasse. Lösen Sie CTAB Nacht. Wenn Ausscheidungen bestehen, heizen die Lösung bei 65 ° C. Lösung ist hochviskos in Raumtemperatur. HINWEIS: Die Filtration von Puffern unter Verwendung von 0,02 um Filter ermöglicht die Entfernung von viralen ähnlichen Partikeln in der Lösung, aber nichtkostenlos Nukleinsäurekontamination. Probenvorbehandlung Bereiten Sie entsprechende Menge an frischem 6,5 mM Dithiothreitol (DTT). Verdünne das Homogenat durch Hinzufügen von 0,02 & mgr; m-filtriert SM Puffer auf ein Gesamtvolumen von 6 ml zu erzeugen. In Schleim Auflösung zu unterstützen, fügen gleichen Volumen (6 ml) von 6,5 mM Dithiothreitol (DTT) zu der Probe, Vortex kräftig zu mischen und zu inkubieren, für 1 h bei 37 ° C. Vortex die behandelte Probe kräftig und Schleudern bei 10 ° C, 3.056 g für 15-20 min. Sammeln Sie den Überstand in ein neues 15-ml-Tube. Wiederholen Sie Schritt 2.2.3 und 2.2.5 für die nächste Probe. Transfer und Filtern der Überstand mit einem 0,45 um Filter auf eine Spritze montiert in eine neue 15-ml-Tube. Hinweis: Wenn der Filter verstopft, rufen Sie die Proben aus der Spritze und lassen Sie den Filtrationsschritt. Nehmen Sie eine 100 ul Teilstichprobe der 0,45 um-filtrierte Probe, führen Chloroform und DNase I Behandlung (siehe section 2.3.12-2.3.15) und fügen gleichen Volumen 4% Paraformaldehyd, um die Probe für Epifluoreszenzmikroskopie (2A zu befestigen). Für eine "catch-all" Viruspartikel Bereicherung Ansatz (siehe Diskussion), fahren Sie mit Schritt 2.3.12 um Viruspartikel Auswahl basierend auf Cäsiumchlorid-Ultrazentrifugation weglassen. Jedoch kann dies in Chloroform-resistenten bakteriellen Kontamination und höhere Menge an Wirt-DNA in das virale Lysat führen. Virusähnliche Partikel (VLPs) Anreicherung und Reinigung Planen einzelner Cäsiumchlorid (CsCl) Lösungen durch Auflösen der entsprechenden Menge CsCl mit ungefiltertem SM-Puffer auf die gewünschte Dichte (1,7 g / ml, 1,5 g / ml, 1,35 g / ml und 1.2 g / ml). Filter jede Lösung durch ein 0,02-um-Filter vor der Verwendung. Einrichten CsCl-Gradienten, wie in 2B gezeigt. Last 1 ml von 1,7 g / ml in jedes Röhrchen, Last 1 ml von 1,5 g / ml in jedes Röhrchen, Last 1 ml von 1,35 g/ Ml in jedes Röhrchen, Last 1,2 g / ml in jedes Röhrchen (optional) und schließlich 6-8 ml Probe geladen, in der jeweiligen Röhre. Mark einzelnen Schichten um den Ort jeder Fraktion zu bezeichnen. Die Waage gegenüberliegenden Paar von Rohren auf 1 mg. Jedes Rohr vorsichtig in die Spin Eimer zu laden. Drehen Sie alle Eimer selbst wenn sie leer sind. Laden Sie den Spin Eimer auf den Rotor. Zentrifugieren bei 82.844 × g bei 4 ° C für 2 Std. Nach der Zentrifugation werden die Röhrchen aus dem Halter sorgfältig ohne Störung des Dichtegradienten zu entfernen. Mit einem 3-ml-Spritze mit einer 18 G-Nadel, durchbohren das Rohr direkt unter dem 1,5 g / ml Dichte Schicht (Abbildung 2, roter Pfeil) und ziehen ~ 1,5 ml in die Spritze. Sammeln Sie die obere Fraktion durch langsames Entfernen der Nadel und damit die verbleibende Fraktion in der Röhre, in eine neue 15-ml-Röhrchen durch die Punktions tropfen. Kennzeichnen Sie diese als "obere Bruch Abfall". Sammeln Sie die 1,5 g / ml fraction (enthaltend VLPs) von der Spritze durch ein Ausstoßen des Inhalts in zwei neue Mikrozentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie Schritt 2.3.8-2.3.10 für alle Proben. In 0,2 Volumen Chloroform in das Viruskonzentrat, kräftig schütteln, Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min, Schleuder bei Höchstgeschwindigkeit für 5 Minuten, und sammeln Sie die wässrige Phase. Hinzufügen 10x DNase-Puffer und DNase I (Endkonzentration = 2,5 U / ul) in die Chloroform behandelten Viruskonzentrat, und bei 37 ° C für 1,5-2 Stunden. Inaktivierung der DNase-Aktivität bei 65 ° C für 15 min. Entfernen Sie 15 ul der Chloroform-und DNase I behandelte virale Fraktion in ein neues Röhrchen und fügen Sie 15 ul 4% Paraformaldehyd, um die Probe für Epifluoreszenzmikroskopie beheben. DNA-Extraktion Pool Viruskonzentrate aus jeder Probe in ein gereinigtes und autoklaviert 50 ml Oak Ridge Hochgeschwindigkeitszentrifugenröhrchen. Fügen Sie den folgenden: 0.1 Volumen 200x TE-Puffer, 10 ul 0,5 M EDTA pro ml sweise 1 Volumen Formamid und 10 ul Glykogen. Gut mischen und bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Mit den neuen Bänden, fügen Sie 2 Volumen Raumtemperatur 100% Ethanol. Gut mischen und inkubieren Sie bei 4 ° C für mindestens 30 min. Pellet DNA durch Spinnen der Röhrchen bei 17.226 xg für 20 min bei 4 ° C unter Verwendung eines SS-34 Rotors. Überstand vorsichtig verwerfen, indem Sie eine serologische Pipette. Zweimal Waschen des Pellets mit eiskaltem 70% Ethanol. Entfernen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich und lassen Sie das Pellet an der Luft trocknen bei Raumtemperatur für 15 min. Resuspendiere das DNA-Pellet in 567 ul 1x TE-Puffer (pH 8,0). HINWEIS: Warten Sie mindestens 15 Minuten wieder völlig zu suspendieren bei Raumtemperatur. Bewahren Sie die resuspendierten DNA über Nacht bei 4 ° C bis zur Weiterverarbeitung. Übertragen Sie die gesamte 567 ul der resuspendierten DNA-Lösung in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Zugabe von 30 & mgr; l vorgewärmtem 10% SDS und 3 ul Proteinase K (20 _6; g / ml), gut mischen und Inkubation für 1 h bei 56 ° C. Vorwärmen CTAB / NaCl bei 65 ° C. 100 l 5 M NaCl und gründlich mischen. Werden 80 & mgr; l vorgewärmtes CTAB / NaCl-Lösung, Vortex und inkubiere für 10 min bei 65 ° C. Hinzufügen gleichen Volumen Chloroform, Wirbel zu mischen, und Schleudern bei 16.100 xg für 5 min. Den Überstand in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie ein gleiches Volumen Phenol / Chloroform, Vortex mischen und Spin bei 16.100 xg für 5 min. Den Überstand in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Hinzufügen eines gleichen Volumens an Chloroform, Wirbel zu mischen und Spin bei 16.100 xg für 5 min. Den Überstand in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Hinzufügen gleiches Volumen Isopropanol zu dem Überstand-Fraktion, zu mischen, und Inkubation bei -20 ° C für mindestens 30 min. Pelletierung der DNA, Schleudern bei 16.100 xg für 15 min bei 4 ° C. Pipettieren Sie den Überstand vorsichtig und waschen zweimal das Pellet mit eiskaltem 70% Ethanol. </li> Führen Sie einen kurzen Schleuder und entfernen Sie das restliche Ethanol aus der Tube. Luft trocknen das Pellet für 15 min. Resuspendiere das DNA-Pellet mit 50 & mgr; l Elutionspuffer (5 mM Tris, pH 8,5). Die Tablette für mindestens 5 min bei Raumtemperatur zu rehydrieren. Quantifizierung der DNA unter Verwendung eines hochempfindlichen Fluoreszenz basierenden Assay. Amplifikation mit Phi29 Polymerase (Optional) Bereiten 2x Anelierungspuffer: 80 mM Tris-HCl (pH 8,0), 20 mM MgCl 2. Verdünne Phi29 DNA-Polymerase an 5 U / & mgr; l. Pre-Mix-Probenpuffer, der 50 & mgr; Zufalls-Hexamer-Primer (100 uM), 125 ul 2x Anlassen Puffer und 25 ul Wasser besteht. Aliquotieren und bei -20 ° C. Vormischung Reaktionspuffer, der 100 ul Phi29 10x Puffer, 40 ul 10 mM dNTPs, und 560 & mgr; l Wasser. Aliquotieren und bei -20 ° C. 1 ul Template-DNA in 4 ul Probenpuffer. Inkubieren the-Gemisch bei 95 ° C für 3 min und kühl auf Eis. In 14 ul Reaktionspuffer in die Mischung aus 2.4.4, mischen durch Auf-und Abpipettieren. Fügen Sie 1 ul Phi29 DNA-Polymerase, mischen durch Auf-und Abpipettieren und inkubieren bei 30 ° C für 18 Stunden, gefolgt von 65 ° C für 10 min. Bereinigen Sie die Reaktionen unter Verwendung von genomischer DNA Spalten oder Phenol / Chloroform und Ethanolfällungen. Epifluoreszenzmikroskopie (Siehe Haas et al. 2014 28 für die Filtration System-Setup) HINWEIS: Nach der Isolierung und Reinigung, Epifluoreszenzmikroskopie mit Nukleinsäure-Farbstoffe verwendet werden, um das Vorhandensein und die Reinheit des Viruspartikeln in Proben (Figuren 2A und 2C) zu überprüfen. Freie DNA in der Probe kann zu hohen Hintergrundfluoreszenz zu ergeben. Daher sollte die Probe DNase I-behandelten vor der Fixierung und Färbung für Mikrographien. Bereiten Mount-Lösung (0,1% Ascorbinsäure, 50% Glycerol). 100 l 10% Ascorbinsäure auf 4,9 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), gut mischen. 5 ml 100% Glycerin auf die Mischung, gut mischen und beschriften Sie die Röhre als "mount". Filtergewinde mit einem 0,02 um Aluminiumoxid-Matrix Einwegspritzenfilter, aliquoten in Mikrozentrifugenröhrchen, und bei -20 ° C. Aliquot 100 ul der Probe in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen eingewogen und gleichen Volumen von 4% Paraformaldehyd, die VLPs fixieren. Inkubieren des Gemisches bei Raumtemperatur für mindestens 10 min. Stellen Sie die Lautstärke auf 1 ml durch Zugabe von 800 ul von 0,02 um-gefiltertes Wasser. 1 ul SYBR Gold-Färbung in die Röhre und Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min. Einrichten des Filtersystems durch Einschalten der Vakuumpumpe zwischen -9 und -10 psi (-62,1 und -68,9 kPa). Waschen Sie den Sockel mit Wasser und einen 0,02 um Aluminiumoxid-Matrix-Filter mit Ring Polypropylen Stützring in der Filtersockel. Legen Sie eine Filter-Turm oben auf dem Filtersockel mit dem Filter und sicher mit einer Klammer. Pipettieren Sie den Inhalt aus dem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen in die Filterturm, und lassen Sie ein paar Minuten Zeit für die Probe, um durch zu filtern. Label und Pipette 10 ul der Halterung Reagenz in einen Objektträger. Lassen Sie das Vakuum auf, während das Entfernen des Filterturm und Klemme. Den Filter aus dem Filtersockel vorsichtig entfernen und trocknen Sie die Unterseite des Filters mit einem Kimwipe, dann legen Sie den Filter direkt auf die Halterung auf dem Objektträger. Pipettieren weitere 10 ul des Berges Reagenz auf den Filter und setzen Sie ein Deckglas über dem Filter. 3. Generieren Mikrobielle Metagenom Herstellung von Puffern und Lösungen Vorbereitung 50 ml 1x DNase-Puffer: 50 mM NaAc, 10 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2; pH-Wert auf 6,5. Filter zu sterilisieren (0,22 um) und zu speichernbei Raumtemperatur. Bereiten DNase I-Enzym zu 1000 U / & mgr; l (in Wasser Molekular grade) von lyophilisiertem Rinderpankreas-DNase I nach der von Dornase Einheiten / mg Trockengewicht definierten Aktivität. Bereiten 100 ml SE Puffer: 75 mM NaCl, 25 mM EDTA; pH-Wert auf 7,5. Filter zu sterilisieren (0,22 um) und bei Raumtemperatur lagern. Probenvorbehandlung Vor der DNA-Extraktion Verdünne das Homogenat durch Zugabe von 5 Volumina 0,22 um filtrierten 1x PBS. Fügen Sie beispielsweise 10 ml 1x PBS in 2 ml Probe. Hinzufügen β-Mercaptoethanol auf 2% (v / v) Endkonzentration. Rock the-Mischung (in der chemischen Abzugshaube) bei Raumtemperatur für 2 Std. Drehen Sie die Probe bei 10 ° C und 3056 xg für 15 min und Überstand verwerfen. Das Pellet in 10 ml Wasser molekularen Grad (oder 0,22 um gefiltertes Wasser), und bei Raumtemperatur für 15 min. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.3 und 3.2.4 einmal. Spin bei 10 ° C und 3056 xg für 15 min und Überstand verwerfen. Das Pellet in 5 ml 1x DNase-Puffer verdünnen und 15 & mgr; l DNase I (1,000 U / & mgr; l) pro ml Probe. Bei 37 ° C mit wiederholten Mischen für 2 Stunden. Inaktivierung der DNase-Aktivität bei 65 ° C für 15 min. Spin bei 10 ° C und 3056 xg für 15 min und Überstand verwerfen. Das Pellet in 10 ml Puffer SE. Wiederholen Sie Schritt 3.2.10. Spin bei 10 ° C und 3056 xg für 15 min und Überstand verwerfen. Das Pellet in 2 ml SE Puffer und übertragen, um zwei Mikrozentrifugenröhrchen. Pelletierung der Zellen in den Mikrozentrifugenröhrchen. Dreh die Röhrchen bei 16.100 × g bei Raumtemperatur für 15 min. Entfernen Sie den Überstand und extrahieren DNA aus den pelletierten Zellen unter Verwendung einer genomischen DNA-Extraktions-Kits, Gram-positive Variation Protokoll. 4. Generieren Metatranscriptome Beispiel Pre-Behandlung Führen mechanische Lyse von Zellen von Wulst zu schlagen in GITC-Lyse-Puffer sofort nach der Probenahme und Homogenisierung. Siehe Schritt 1.4. Drehe das Gemisch bei 4ºC und 600 · g für 5 min pelletiert, die Silika-Kügelchen. Den Überstand in ein neues Röhrchen. Fügen Sie 200 ul Chloroform für jeweils 750 ul GITC-Lyse-Puffer verwendet, Hand heftig geschüttelt, 15 Sek, Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min und Spin bei 4 ° C und 3056 g für 15 min. Während dieser 15 Minuten Spin, die Vorbereitungen für Schritt 4.2. Nach 15 Minuten Spin (eine klare Trennung der wässrigen Phase-Interphase-organische Phase bildet), die wässrige Phase (ohne Störung des Interphase) in neue RNase-freies Rohr (e). HINWEIS: Die wässrige Phase der RNA enthält. Halten Sie das Röhrchen auf Eis, bis zum nächsten Schritt. Führen Sie die Gesamt-RNA Extraktion und Reinigung mit handelsüblichen spaltenbasierte RNA Aufreinigungskits oder conventional Isopropanol-basierte RNA-Niederschlag. Silica Column-basierte RNA-Reinigung Messen des Gesamtvolumens des erhaltenen wässrigen Fraktion. In geeigneten Volumen RNA-Bindungspuffer zu probieren und gut mischen. Stellen Sie Mischung, verbindliche Zustand nach Herstellerprotokoll anzueignen. Gut mischen und machen einen kurzen Schleuder. Laden die Mischung in die RNA-Spalte. Für ein großes Volumen Probe, verwenden Sie mehrere Be- und laden Sie jede Spalte bis zu 4x. Andernfalls sollten Sie mehrere Spalten für jede Probe. Die Säule wird in geeigneter Weise entsprechend dem Protokoll des Herstellers. Eluieren der RNA mit mindestens 30 & mgr; l RNase-freies Wasser. Doppelklicken Elution leicht erhöhen die Ausbeute an RNA. Dies wird jedoch die RNA-Konzentration zu verdünnen. Messen Sie die RNA-Konzentration und direkt zum DNase I-Behandlung. Verwenden Sie die Bioanalyzer, um die Qualität der RNA zu überprüfen (empfohlen). </ol> RNA-Niederschlag Hinzufügen eines gleichen Volumens an Isopropanol (beispielsweise 500 & mgr; l Isopropanol in 500 & mgr; l wässrige Fraktion) und 2 ul 10 ug / ul RNase-freiem Glykogen zur Probe. Inkubieren des Gemisches bei Raumtemperatur für 10 min. Schleudern bei 12.000 xg und 4 ° C für 15 min. Den Überstand vorsichtig entfernen, 1 ml RNase-freies 75% Ethanol. Drehen Sie das Gemisch bei 7500 xg und 4 ° C für 5 Minuten, um sicherzustellen, das Pellet intakt ist. Das Ethanol vorsichtig entfernen. Wiederholen Sie die Schritte 4.2.2.4 und 4.2.2.5 einmal. Luft trocknen das Pellet für 10 min. Rehydrieren des Pellets in 50 & mgr; l RNase-freies Wasser, Inkubation bei 55 ° C für 5 min und direkt zum DNase-Behandlung. Verwenden Sie die Bioanalyzer, um die Qualität der RNA zu überprüfen (empfohlen). Speicher RNA bei -20 ° C oder -80 ° C für die langfristige Lagerung. </ol>

Representative Results

Viral Metagenomen CF Sputum ist außergewöhnlich zäh und enthält einen hohen Anteil von Mucin und freie DNA (2A); die Dichte-Ultrazentrifugation erleichtert die Beseitigung von Wirts abgeleiteten DNA (2B). Die Ergebnisse einer früheren Studie 9 zeigt acht viromes vom dargestellt Ablaufs erzeugt werden hier zusammengefasst (Tabelle 1). Sieben Proben (CF1-D, CF1-E, CF1-F, CF 4-B, CF 4-C, CF5-A und CF5-B, Tabelle 1) wurden wie in Abschnitt 2. Die erzeugten viromes enthielt wenig beschrieben verarbeitet (0,02 % -3,7%) human-abgeleiteten Sequenzen mit einer Ausnahme (70%). CF4-A wurde aus der Dichte-Ultrazentrifugation Schritt (CF4-A) und der von diesem spezifischen Probe erzeugt enthielten> 97% vom Menschen abgeleiteten Sequenzen (Tabelle 1), Fig. 2 weggelassen virome zeigt ein Beispiel für die Epifluoreszenzmikroskopie Bild einer typischen CF sputum Probe vor (2A) und nach (Abbildung 2C) Dichtegradientenzentrifugation. Klare Virusähnlichen Partikeln (VLPs) in den Mikroaufnahmen ohne großen Teilchen nach dem Dichtegradienten Trennung beobachtet. Nach VLPs DNA Extraktion wird oft unter Verwendung von bakterieller Kontamination 16S rDNA Amplifikation vor der Sequenzierung von DNA-VLPs getestet. Mikrobielle Metagenomen Sieben Sputumproben hier präsentierten Objekte wurden aus einer CF Patienten in sieben aufeinander folgenden Tagen gesammelt. Der Patient wurde am orale Antibiotika (Ciprofloxacin und Doxycyclin) an Tag 3, nachdem das Sputum wurde gesammelt. Das Volumen jeder Sputumprobe von diesem Patienten gesammelt wurden, betrug 15 ml in den 7 Tage; daher wurde PBS nicht zu der Probe gegeben. Das Ziel dieser Veranstaltung war es, Probenahme die Protokolle in diesem Workflow durch (i) präsentiert die Beurteilung der täglichen Schwankungen der mikrobiellen Gemeinschaftsstruktur zu bewerten, und (ii) zu vergleichender mikrobiellen Gemeinschaft Struktur und Auflösung zwischen Metagenomik und 16S rDNA-Sequenzierung. Daher wurden die gesamten DNA und HL-DNA aus jeder Probe extrahiert. Die HL-DNA-Konzentration jeder Sputumprobe folgenden DNA Extraktion wird in Tabelle 2 dargestellt. Die Gesamtausbeute an HL-DNA lag im Bereich von 210 ng bis> 5 ug. Illumina Sequenzierung Bibliotheken wurden mit einer Gesamtausgangsmaterial von 1 ng jeder Probe (3) erzeugt. Die Eigenschaften der Metagenomik Daten sind in Tabelle 2. Alle vorgestellten aber eine Bibliothek ergab mehr als 1 Million Sequenzen und mehr als 85% hochwertigen Sequenzen wurden auf Datenvorverarbeitung mit dem PRINSEQ 29 Software erhalten. Alle Datensätze wurden zunächst vorverarbeitet, um Duplikate und Sequenzen von geringer Qualität (Qualitätsmindestpunktzahl von 25), gefolgt von einem weiteren Screening und Entfernung von Menschen stammenden Sequenzen mit DeconSeq 30 zu entfernen. Die Menge an human-deabgeleiteten Sequenz Kontamination hängt stark von den Probeneigenschaften. Hier wird die Gesamtmenge des vom Menschen stammenden Sequenzen reichten von 14 bis 46% (Tabelle 2). Die vorverarbeiteten Sequenzen wurden anschließend mit der Metaphlan 31 Pipeline sowie MG-RAST 32 Server kommentiert. Neben metagenomes wurden 16S rDNA Amplikon Bibliotheken sowohl der Gesamt-DNA und HL-DNA mittels Primer zu ca. 300 bp des V1-V2 variable Region in der 16S-rRNA-Gen 33,34 erzeugt. PCR-Produkte von einzelnen Proben wurden normalisiert und gebündelt für die Sequenzierung mit Hilfe des Illumina 500 Zyklus Paired-End-Sequenzierung an der MiSeq Plattform durchgeführt. Gepaart-End-16S rDNA Amplikon-Sequenzen wurden durch Proben über Barcodes mit einem Python-Skript, sortiert und der gepaarten liest wurden mit phrap 35,36 montiert. Montiert Folge Enden wurden, bis die durchschnittliche Qualität der Gäste wurde ≥20 mit einem 5 nt Fenster getrimmt. Potenzielle Chimären waren dien mit Uchime 37 gegen eine Chimäre freien Teilmenge der SILVA 38 Referenzsequenzen entfernt. Taxanomy wurde beauftragt, die hohe Qualität liest mit SINA 39 (Version 1.2.11) mit den 418.497 bakterielle Sequenzen aus dem SILVA 38 Datenbank. Sequenzen mit identischen taxonomischen Zuordnungen wurden gebündelt, um Operational taxonomische Einheiten (OTUs) zu produzieren. Dieser Prozess erzeugt 1.655.278 Sequenzen für 16 Proben (durchschnittliche Größe: 103.455 Sequenzen / Probe; min: 72.603; max: 127.113). Die mediane Waren Deckung Score, ein Maß für die Vollständigkeit der Sequenzierung, war ≥ 99,9%. Das Software-Paket Explicet 40 (v2.9.4, www.explicet.org) wurde zur Analyse und Abbildung genutzt wird. Alpha-Diversität (intra-Probe) und beta-Diversität (inter-Probe) wurden in Explicet am Verdünnung Punkt 72.603 Sequenzen mit 100 Bootstrap erneute Probenahmen berechnet werden. Die erste Frage dieser Studie war, ob gezielte hypotonische Lyse preferentiVerbündeter selektiert (dh bevorzugt behält oder Lyse) bestimmte Gruppen von Mikroben. Nach der ersten hypotonischen Lyse wurden resuspendiert pelletierten Zellen aus den ersten beiden Proben (CF1-1A * und CF1-2A *) unterabgetastet, um mit den gleichen Proben nach dem zweiten hypotonische Lyse (CF1-1and CF1-2) zu vergleichen. Alle Proben wurden gleich behandelt, dh mit DNase I vor der DNA-Extraktion behandelt, gefolgt von DNA-Extraktion und Sequenzierung Pipeline. Wie in 4 gezeigt, sind die mikrobiellen Profile der Teilmengen sehr ähnlich zu den Proben nach zwei hypotonische Lyse Behandlungen. Darüber hinaus erhöht der zweite hypotonische Lyse der Anteil an nicht-menschliche Sequenzen von 6-17% innerhalb der metagenomes (Tabelle 2). Um Unterschiede in der mikrobiellen Zusammensetzung zwischen metagenomic- und 16S rDNA-basierten Profiling zu testen und für Änderungen vor und nach hypotonische Lyse, die die Unterschiede erklären könnten vorher zwischen unserem Gestüt gesehenies und andere wurden bakterielle 16S rDNA Bibliotheken sowohl der Gesamt-DNA und HL-abgeleiteten DNA (4B) erzeugt. Auf Gattungsebene waren die Taxonomie Profile der gemeinsamen CF-assoziierten Bakterien wie Pseudomonas, Stenotrophomonas, Prevotella, Veillonella und Streptococcus hochgradig ähnlich zwischen den 16S rDNA Bibliotheken und Metagenomen vom HL-abgeleiteten DNA erzeugt. , Rothia Erkennung in den 16S rDNA Bibliotheken war jedoch nicht so reichlich wie die Metagenom-Bibliotheken. Beim Vergleich der 16S rDNA taxonomische Profile Gesamt-DNA und HL-abgeleiteten DNA erzeugt, Pseudomonas wurde differentiell in der Gesamt-DNA im Vergleich zum HL-abgeleiteten DNA ausgehend von Tag 3 vertreten. Metatranscriptomes Typischerweise ist der Gesamt-RNA aus CF Sputum extrahiert teilweise abgebaut und die Größe reicht von 25-4,000 bps (5A und <strong> 5C). Hier wurde die vorgestellten repräsentative Ergebnisse zuvor in Lim et al. 2012 9 veröffentlicht. Der Anteil der rRNA in den nicht-verarmten metatranscriptomes reicht von 27 bis 83%, und die relative Häufigkeit von rRNA variiert in Proben (Tabelle 3; Daten von Lim et al 9 extrahiert.). Depletion mit Ribo-Zero Kit verringert jedoch den rRNAs relativen Häufigkeit von rRNA zu 1-5%, mit Ausnahme von Probe CF1-F. Die Veränderung in der Wirksamkeit der rRNA Entfernung könnte die Qualität der extrahierten RNA oder Unterschiede in der mikrobiellen Gemeinschaft und damit die Erreichbarkeit von rRNAs für Sonden-Hybridisierung 9 Rechnung zu tragen. Die Elektropherogramme einer erfolgreichen (5B) und erfolglosen (5D) rRNA Entfernungsverfahren unter Verwendung des Ribo-Zero rRNA Entfernungskit unterscheiden, bei denen rRNA Peaks in dem erfolglosen Entfernung sichtbar sind. Der Größenbereich von cDNA-Bibliotheken generated spiegelt oft den Größenbereich des Ausgangs RNA-Probe. Die cDNA-Bibliotheken hier präsentierten Objekte wurden mit einer ganzen Transkriptom Amplification Kit (WTA2) auf rRNA Depletion gefolgt von Roche-454-Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung 9 erzeugt. Die cDNA-Fragmente erzeugt, enthalten die von 50-4,000 bps (5E und 5F) und ist sehr konsistent Proben (Lim et al. 2012) 9. Die Verfügbarkeit der anderen plattformspezifischen RNA-Seq Bibliothek Vorbereitung Kits bieten derzeit mehr Alternativen für ein bis cDNA-Synthese und Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung unter optimalen Bedingungen zu kombinieren. Eine empfohlene Option ist bis heute die ScriptSeq komplette Gold-Kit kombiniert rRNA Entfernung Reagenzien oben empfohlen und RNA-Seq Bibliothek Vorbereitung Kit. Abbildung 1: Workflow für die Vorbereitungreitung der Host-assoziierte Proben, wie Sputum Probe, virome, microbiome und metatranscriptome Sequenzierung. Abbildung 2: Cäsiumchlorid-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation Erleichterung der Beseitigung der extrazellulären DNA und großen Teilchen (A), und ermöglichen eine optimale Isolierung viraler artigen Partikeln aus CF Sputum. Ein Milliliter jeder Gradient wird auf der jeweils anderen vor dem Laden der vorbehandelten Probe (B) überlagert. Folgende Partikel der Isolierung und Reinigung, Epifluoreszenzmikroskopie mit Nukleinsäure-Farbstoffe, wie SYBR Gold werden verwendet, um das Vorhandensein und die Reinheit des Viruspartikeln in Proben zu verifizieren. Klare Virusähnliche Partikel (C, weißer Pfeil) wurden nach der Dichtegradiententrennung CF Sputumprobe beobachtet. <p class="jove_content" fo:Keep-together.within-page = "always"> Fig. 3: Beispiel für die Größenverteilung der Nextera XT Bibliotheken von 1 ng der HL-DNA, die in der CF-Sputum microbiomes Folge erzeugten Bibliothek Normalisierung, die Bündelung und Ladungsmenge wurde nach dem Hersteller-Protokoll, ohne jegliche Abweichung beschrieben durchgeführt. Abbildung 4: Taxonomische Analyse der mikrobiellen Gemeinschaften in neun Proben in Längsrichtung von einer CF-Patienten gesammelt (A) Mikrobielle Profile basierend auf den Metagenombanken von hypotonischen Lyse-Verfahren basierende DNA erzeugt.. Die Art Zuordnung wurde auf der Pipeline Metaphlan folgenden Datenvorverarbeitung, die Duplikate und Sequenzen mit geringer Qualität und menschliche Sequenzhomologie zu entfernen basieren. Um sicherzustellen, dass zwei-st zeigeneps hypotonische Lyse nicht bevorzugt wählt für bestimmte Gruppen von Mikroben, Teilproben (*) nach dem ersten hypotonische Lyse wurden eingeschlossen. (B) Mikrobielle Profile basierend auf der V1V2 Region 16S-rRNA-Gen-Sequenzierung von Gesamt-DNA (T) und hypotonischen Lyse-Verfahren -basierten DNA (HL). Diese Daten sind bisher nicht veröffentlicht worden. Abbildung 5: Beispiele für Agilent 2100 Bioanalyzer Elektropherogramme von RNA (AD) und cDNA (EF), die für den metatranscriptomic Bibliotheken unter Verwendung von RNA pico und hoher Empfindlichkeit dsDNA-Chips sind. (A) und (C) zeigen die Beispiele der Elektropherogramme vor rRNA Entfernung Verfahren. Die Elektropherogramme einer erfolgreichen (B) und erfolglose (D) rRNA Entfernung Verfahren mit insgesamt rRNA Removal Kit unterscheiden sich geringfügig, eint, die Spitzen-rRNA in der erfolglosen Entfernung sichtbar. Der Größenbereich von cDNA (EF) mit dem gesamten Transkriptom-Amplification Kit (Sigma-Aldrich) ähnelt dem Größenbereich des Ausgangs rRNA angereicherte RNA und sehr konsistent über die beiden verschiedenen Proben erzeugt. Bitte klicken Sie hier, um einen Blick Größere Version der Abbildung. CF1-D CF1-E CF1-F CF4-A CF4-B CF4-C CF5-A CF5-B Gesamtzahl von Lesevorgängen 224.859 87.891 106.189 93.301 140.020 1558 272.552 217.438 Vorverarbeiteten liest ein 109.389 73.624 67.070 82.011 68.617 1137 215.808 158.432 49% 84% 63% 88% 49% 73% 79% 73% Anzahl der Basen 47.239.573 33.351.525 28.922.479 27.667.695 29.386.841 243.986 95.205.805 69.581.811 Mittlere Leselänge 432 453 431 337 428 215 441 439 Host-Sequenzen b 240 526 28 79.774 13 797 585 5859 0,21% 0,71% 0,04% 97,27% 0,02% 70,10% 0,27% 3,70% Viral Hits c 7214 23.550 4070 737 4642 22 6466 5981 6,59% 31.99% 6,07% 0,90% 6,77% 1,93% 3,00% 3,78% Nicht zugewiesen Liest d 103.888 60.490 32.780 1935 68.440 311 105.612 119.551 94,97% 82,16% 48,87% 2,36% 99,74% 27.35% 48,94% 75,46% Liest ein, nachdem die Daten vorge processing von PRINSEQ 29. b Mensch liest von DeconSeq 30 identifiziert und liest mit besten BLASTn Hit (NCBI Nukleotid-Datenbank) zum Stamm Chordata. c tBLASTx trifft gegen Inhouse-Virusgenom-Datenbank. Der Prozentsatz wurde mit der Gesamtzahl der vorverarbeiteten liest berechnet. d Liest ohne BLASTn gegen die NCBI Nukleotid-Datenbank getroffen. Der Prozentsatz wurde mit der Gesamtzahl der vorverarbeiteten liest berechnet. Einige liest ohne BLASTn gegen die NCBI Nukleotid-Datenbank getroffen wurden als Virus auf Proteinebene im tBLASTx Analyse identifiziert. Tabelle 1:. Bibliothek Merkmale der acht viromes von Sputum-Proben, die unter Verwendung vorge Workflow Diese Tabelle wird von Lim <extrahiertem> et al. (2012) 9. Sieben Proben (CF1-D, CF1-E, CF1-F, CF 4-B, CF 4-C, CF5-A und CF5-B) verarbeitet wurden, wie in Abschnitt 2 beschrieben und erzeugt viromes, die wenig (0,02% enthalten ist – 3.7 %) human-abgeleiteten Sequenzen mit einer Ausnahme (70%). CF4-A wurde aus der Dichte-Ultrazentrifugation Schritt (CF4-A) und erzeugt virome, die> 97% vom Menschen abgeleiteten Sequenzen enthielten weggelassen. Beispiel Konzentration Gesamtertrag Gesamtzahl Reads Gesamtanzahl: Liest (Processed b) Nicht-menschliche Sequenzen (Ng / ul) (Ng) (Raw a) (%) CF1-1A * 2.3 <td rowspan = "2"> 230 1.098.454 937.688 691.541 74% CF1-1 13 1300 2.212.756 1.958.910 1.574.520 80% CF1-2A * 2.1 210 672.878 588.106 407.530 69% CF1-2 5.2 520 1.944.012 1.697.010 1.455.174 86% CF1-3 28,8 2880 1.048.304 896.756 560.852 63% CF1-4 24,1 2410 1.154.922 984.702 621.098 63% CF1-5 33,6 3360 1.029.622 888.630 481.548 54% CF1-6 43,2 4320 1.434.016 1.256.504 725.858 58% CF1-7 57,8 5780 1.000.174 872.036 565.376 65% * 1 ml Probe wurde aus CF1 unterabgetastet -1 Und CF1-2 nach der ersten hypotonische Lyse Schritt (Schritt 3.1.5), bevor die zweite hypotonische Lyse Verfahren. Die Zellen wurden wie in 3.1.7 ohne Änderungen beschrieben und durch die verbleibenden Protokoll gehen gesponnen. ein Unverarbeitete Illumina liest aus einer 2 x 300 bp MiSeq Sequenzierungslauf. b Liest wurden bewertet, getrimmt, und entfernt auf Basis von Qualität und Länge wie in der Diskussion beschrieben. Tabelle 2:. Merkmale microbiomes von Sputumproben mit präsentiert Ablaufs erzeugt Die DNA-Konzentration jeder Probe in 100 & mgr; l Elutionspuffer (5 mM Tris / HCl, pH 8,5) und der Eigenschaften der Folgedaten dargestellt. Insgesamt wurden 1 ng wurde verwendet, um einzelne Bibliothek mit dem Nextera XT Bibliothek Vorbereitung Kit erstellen. 0 "fo: keep-together.within-page =" always "> Beispiel CF1-D CF1-F CF4-B CF4-C Behandlung Keiner Ribo-Zero Keiner Ribo-Zero Keiner Ribo-Zero Keiner Ribo-Zero Vorverarbeiteten liest 2088 1991 40.876 25.238 19.728 32.737 31.791 36.172 Mittlere Leselänge 275 245 262 270 233 259 240 267 Insgesamt rRNA liest 1737 91 29.499 17.267 5285 291 16.371 1761 83,20% 4,60% 72,20% 68,40% 26.80% 0,90% 51.50% 4,90% Mikrobielle rRNA 1414 32 19.978 12.035 23 227 6916 1076 67,70% 1,60% 48.90% 47,70% 0,10% 0,70% 21,80% 3,00% Eukaryota rRNA 323 59 9520 5232 5262 64 9455 683 15,50% 3,00% 23,30% 20,70% 26,70% 0,20% 29.70% 1,90% % RRNA entfernt * 0% 95% 0% 5% 0% 97% 0% 91% Non-rRNA liest 351 (16,8%) 1900 (95,4%) 11.377 (27,8%) 7971 (31,6%) 14.443 (73,2%) 32.446 (99,1%) 15.420 (48,5%) 34.411 (95,1%) Insgesamt NR Hits 102 (4,9%) 691 (34,7%) 3327 (8,1%) 2,857 (11,3%) 4938 (25,0%) 10.751 (32,8%) 5905 (18,6%) 15.766 (43,6%) Eukaryotische 74 407 2790 2524 4614 10.227 4553 8274 Bakterien- 26 283 520 312 287 471 1326 7442 Nicht zugewiesen liest 249 (11,9%) 1209 (60,7%) 8.050 (19.7%) 5114 (20,3%) 9505 (48,2%) 21.695 (66,3%) 9515 (29,9%) 18.645 (51,5%) * Die Menge an rRNA entfernt als Prozentsatz des in der nicht-verarmten Aliquot vorliegenden Menge ausgedrückt. Tabelle 3:. Bibliothek Merkmale der metatranscriptomes mit und ohne rRNA Verarmungs Die Daten werden von Lim et al extrahiert (2012) 9, der zusätzliche Vergleich anderer rRNA Entfernen Kits und die Wirkung der cDNA Vernebelung vor der Sequenzierung Bibliothek Zubereitung..

Discussion

Viral Metagenomics

Viruspartikel konzentriert werden unter Verwendung von Polyethylenglykol (PEG) Fällung oder kleinvolumigen Konzentratoren. In einigen Fällen kann die Konzentration nicht benötigt werden, aber pre-Filtration oder langsame Zentrifugation Schritte werden verwendet, um eukaryontische mikrobielle Zellen zu entfernen. Viral Lysate weiter angereichert und mit Dichtegradientenzentrifugation 9,41 oder kleiner Größe Filter (zB 0,45 um) zu eukaryotischen und großen mikrobiellen Zellen 25 zu entfernen. Gereinigt werden Dichtegradientenzentrifugation wird typischerweise mit dichten aber inerten Lösungen, wie Saccharose oder Cäsiumchlorid zur Isolierung und Konzentration viraler Partikel 41 durchgeführt. Physikalische Trennung wird von der Größe und Auftriebsdichte von viralen Partikel. Daher richtige Wahl der Filterfeinheit und der strengen Vorbereitung der Gradienten sind unerlässlich, um spezifische virale Isolation der Gemeinden, wie der Erfolg der physischen WiederherstellungVLPs bestimmt die Gemeinschaft isoliert 41 (dh Viruspartikel, die nicht durch den Filter oder fallen in den Entnahmedichte bestehen, werden nicht in der Metagenom erkannt werden). Nach virale Isolation und Konzentration kann es sein kontaminierenden in der Probe sowohl in Form von freien Nukleinsäuren und mikrobielle und eukaryotischen Zellen nicht-viralen vorliegenden genomischen Materials. Daher ist es wichtig, die Reinheit des Viruspartikeln in Proben (1A und 1B) zu verifizieren. Eine Chloroform-Behandlung wird üblicherweise verwendet, um die verbleibenden Zellen, gefolgt von Nukleasebehandlung um freie Nucleinsäuren vor der Extraktion von Nukleinsäuren abbauen lysieren.

Eine Einschränkung auf die dargestellte Arbeitsablauf war der Einsatz von Dichtegradiententrennung, um virale Partikel zu isolieren, wie es umhüllten Viruspartikeln, die zu Auftriebs die CsCl Gradienten betreten können, auszuschließen. Eine Alternative "Catch-all" Verfahren ist es, den Dichtegradienten getr weglassenation und zu isolieren, die Community-DNA aus den 0,45 um – Filtrate mit Chloroform und DNase I. Dieser Ansatz behandelt wird, ist es angezeigt, einen kleinen Probenvolumina, wie sie aus Abstrichen oder Blutplasma unterzubringen. Jedoch kann dies in Chloroform-resistenten bakteriellen Kontamination und höhere Menge an DNase I beständigen extrazelluläre DNA führen.

Aktuelle Sequenzierungsprotokolle erfordern 1 ng bis 1 ug von Nukleinsäuren zur Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung wodurch höhere DNA-Ausbeuten eine größere Auswahl an Optionen Sequenzierung. Die DNA-Konzentration der erzeugten viromes oft im Bereich von unterhalb der Nachweisgrenze von mehr als 200 ng / & mgr; l. Die Höhe der viralen Nukleinsäuren erholt reicht möglicherweise nicht zur direkten Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung sein. In solchen Fällen ist die Nukleinsäure-Amplifikation von wesentlicher Bedeutung. Linker Verstärkung Schrotflinte-Bibliotheken (LASLs) 2,42,43 und Amplifikation des gesamten Genoms auf der Basis mehrerer Displacement Amplification (MDA) sind die beidenVerfahren am häufigsten verwendet werden, um ausreichende DNA für die Sequenzierung zu erzeugen. MDA Verfahren, wie sie anhand von Phi29 DNA-Polymerase ist bekannt, dass aus der Amplifikation spannt leiden und können bevorzugt amplifizieren ssDNA und kreisförmige DNA, was zu einer nicht quantitativen taxonomischen und funktionelle Charakterisierung 44,45. Eine optimierte Version des LASLs Ansatz hat sich gezeigt, dass nur minimale Verzerrungen einführen, fördert die höhere Empfindlichkeit (für kleine Mengen an Ausgangsmaterial), und ist leicht für verschiedene Sequenzierplattformen 43 angepasst. Jedoch weist der Ansatz viele Schritte, erfordert spezielle Ausrüstung, um DNA Verlust zu minimieren, und ist auf dsDNA Vorlagen. In unserem Labor wurde dieser Ansatz erfolgreich eingerichtet ist, nachweisbar und nicht nachweisbaren Menge von bronchoalveolären lavage-, Korallen-und seewasser abgeleitete VLPs (unveröffentlicht und Hurwitz et al. 46) extrahierte DNA zu amplifizieren.

Entwicklung von Datenanalyse-Pipelines hat classically einer der schwierigsten Aspekte der Virus Metagenom-Analyse aufgrund der sehr unterschiedlichen und weitgehend unbekannten Natur der viralen Gemeinden. Zwar gibt es schätzungsweise 10 8 viralen Genotypen in der Biosphäre bis heute aktuellen Virendatenbanken enthalten ~ 4.000 viralen Genomen, die etwa 1 / 100.000 dieser ungefähren Gesamt virale Vielfalt ist. Daher Ähnlichkeit basierte Suchen (wie BLAST 47) für taxonomische und funktionelle Zuordnung der Virus Metagenomen besitzen inhärente Herausforderungen. Viele Sequenzen nicht zu signifikanten Ähnlichkeiten mit Genomen in der Datenbank haben, und deshalb werden als unbekannt eingestuft. Obwohl Homologie-basierte Suchanfragen sind die wichtigsten Anwendungen für die Zuordnung von Taxonomie und funktionieren, um Daten zu sequenzieren, wurden alternative Ansätze, die auf datenbankunabhängige Analyse entwickelt 48- 50. Fancello et al. 51 eine vollständige Überprüfung des Rechentools und Algorithmen in Vira verwendetl Metagenomik.

Mikrobielle Metagenomics

Typischerweise liegt die Gesamtmenge an DNA aus hypotonische Lyse behandelt Mikroorganismengemeinschaften (HL-DNA) extrahiert im Bereich von 20 ng bis 5 ug. Die Ausbeute ist stark abhängig von den Gesundheitszustand und die Menge der Sputumprobe gesammelt, welche die Variationen in der Gesamtausbeute in dieser Studie (Tabelle 2) extrahiert HL-DNA gesehen erklärt des Patienten. Die entscheidenden Schritte zur Erzeugung guter Qualität Sequenzdaten verlassen sich auf die Qualität der Sequenzierungsbibliotheken generiert. Abbildung 2 zeigt eine typische Größenbereich für die Sequenzierungsbibliotheken von CF Sputum abgeleitete mikrobielle DNA, die unter Verwendung eines enzymatischen-basierte DNA-Fragmentierung Verfahren. Die optimale Größe der Bibliothek ist abhängig von der Wahl des Sequenzierungsplattform und der Anwendung, und daher kann das Fragmentierungsverfahren optimiert werden, falls erforderlich, durch alternative Methoden wie Ultraschallbehandlung und Vernebelung. Zusätzlich zudie dargestellten repräsentativen Ergebnissen, der Erfolg des vorgestellten Verfahrens auf CF Sputum von mehreren Patienten über mehrere Zeitpunkte erfasst werden auch in Lim et al (2012). 9 dargestellt, und Lim et al. (2014) 10.

Frühere Studien deuten darauf hin, 9,10, dass jeder Patient birgt eine einzigartige Reihe von mikrobiellen Gemeinschaft, die im Laufe der Zeit verschiebt, wodurch das Fortbestehen der Hauptakteure in der Gemeinschaft widerspiegelt, während Schwankungen dürften wegen Störungen wie Antibiotika. Ob diese Schwankungen auftreten, täglich auch ohne äußere Störungen oder aufgrund von Stichprobenverfahren und Probenverarbeitung, ist immer noch in Frage. Basierend auf der HL-DNA metagenomic und 16S rDNA Amplikon Analyse zeigt die 7-Tage-Längs Abtastung, dass die tägliche Schwankung des mikrobiellen Profile ohne Antibiotikum Perturbation (Tag 1, 2 und 3) war minimal (3A und 3B). Nach IntroHerstellung von oralen Antibiotika unmittelbar nach dem 3. Tag Probenahme wurde Änderungen in der Community-Profil offensichtlich an Tag 4. Während das Antibiotikum Ciprofloxacin zielt auf ein breites Spektrum an bekannten bakteriellen Erreger wie P. aeruginosa, Staphylococcus aureus und Streptococcus pneumoniae, erhöhte die Behandlung der relativen Häufigkeit von P. aeruginosa während die Verringerung der Streptococcus spp. und P. melaninogenica. Mit dem 6. Tag, die Gemeinschaft wieder langsam in die Anfangsstartgemeinschaftsstruktur. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Schwankungen der mikrobiellen Profile innerhalb eines einzelnen Patienten mit größerer Wahrscheinlichkeit aufgrund Community Störungen in den Atemwegen.

Angesichts der Kohärenz zwischen den mikrobiellen Profile der 16S rDNA Bibliotheken und Metagenomen von HL-abgeleitete DNA, auszuschließen wir die Vorurteile von den in dieser Studie verwendeten 16S-rRNA-Primer Ursprung. Eine mögliche Erklärung für die Unterschiede zwischen den 16S rDNA taxonomische gesehenal Profile Gesamt-DNA und HL-abgeleiteten DNA (3B) erzeugt wird, kann die Anwesenheit von hohen Mengen von Pseudomonas spp. extrazelluläre DNA nach der Behandlung mit Antibiotika. Dies wird durch die Ergebnisse gestützt, dass diese Unterschiede wurden am Tag 7 am deutlichsten, drei Tage nach der Behandlung mit Antibiotika, die Pseudomonas spp abzielt. neben anderen. Ciprofloxacin ist allgemein als First-Line-Behandlung bei Patienten mit CF und chronischer P. verwendet aeruginosa-Infektion, obwohl seine Wirkungsspektrum umfasst die meisten CF-assoziierter Krankheitserreger. Wir nahmen an, dass die Behandlung mit Antibiotika rottet anfälliger Gemeinschaften einschließlich Streptococcus spp. und damit die Schaffung einer Nische durch resistente P. gefüllt aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa kann Widerstand durch Erhöhung der Biofilmgemeinschaften zu gewinnen und die extrazelluläre DNA wurde gezeigt, daß die wichtigsten strukturellen Unterstützung seiner Biofilmarchitektur 52 sein. Schon als ter Gemeinschaftsstruktur wiederhergestellt, extrazelluläre DNA kann auf der CF-Sputum geblieben. Deshalb lassen diese Daten vermuten, dass hypotonische Lyse und die Waschschritte in diesem Arbeitsablauf dargestellt potentiell nicht nur das Entfernen des vom Menschen stammenden DNA zu profitieren, sondern auch auf Basis mikrobieller extrazellulären DNA, die die tatsächliche mikrobielle Profile verdrehen kann.

Metatranscriptomics

Eine hochwertige metatranscriptome sollte relativ wenige ribosomale RNA (rRNA) Sequenzen enthalten und stellen eine unvoreingenommene Probenahme der Gemeinschaft Transkripte (mRNA). Aufgrund der kurzen Halbwertszeit und begrenzte Menge an mRNA, ist es entscheidend, dass das Protokoll, wie es hier dargestellt, minimiert Probenhandhabung, die Anzahl von Transkripten gewonnen maximieren.

In den letzten Jahren verschiedene Ansätze für rRNA Depletion wurden entwickelt und im Handel erhältlichen Kits geeignet. Dazu gehören Microb Enrich, Ribo-Zero und probenspezifische subtraktiven hybridizations 53, die auf Oligonukleotid-Hybridisierung und der mRNA-ONLY-Kit, das auf Exonuklease enzymatische Aktivität Ziel RNA eine 5'-Monophosphat enthält, basiert beruhen. Außerdem sind auch verschiedene Ansätze zur mRNA Anreicherungen wie MessageAmp II-Bakterien Kit, das vorzugsweise polyadenylates und verstärkt linearen RNA vorhanden. Einige dieser Verfahren (beispielsweise mRNA-ONLY, Microb E Xpress und MessageAmp) gleichzeitig für eine optimale Effizienz verwendet. Allerdings ist die Wirksamkeit aller dieser Ansätze begrenzt sind, besonders beim Arbeiten mit teilabgebauten rRNA, wie oft in Gesamt-RNA aus CF Proben extrahiert beobachtet. Polyadenylierungs-abhängigen RNA-Amplifikation kann nicht zur metatranscriptomes bestehend sowohl eukaryontische als auch prokaryontische mRNA zu erzeugen. Darüber hinaus ist die Poly (A) -Schwanz hinzugefügt, um die Sequenzen kann die Menge an nützlichen Sequenzdaten reduziert. Regionen mit Homo Strecken tendenziell niedrigere Qualität Partituren haben, cAStarten eine bedeutende Anzahl von Lesevorgängen, die von Sequenzierung und Post-Sequenzer-Software, und die durchschnittliche Nutzungsleselänge nach dem Schneiden aus Poly gefiltert werden (A) Schwanz deutlich 54 reduziert werden.

Der Umgang mit komplexen CF mikrobieller Gemeinschaften und teilweise abgebauten RNA (4A und 4C), unsere frühere Studie zeigte, dass die Hybridisierungs-Capture-Methode durch die Ribo-Zero Gold-Kits war wirksamer bei der Entfernung von Mensch und Mikroben rRNA im Vergleich zu den zu kombinieren Behandlungen mit anderen Kits 9 (Tabelle 3). Die sich ergebenden Daten ermöglicht die gleichzeitige Analyse von sowohl menschlichen Wirt und mikrobielle Transkripte. In Abhängigkeit von der Ausbeute und Qualität der RNA sowie ultimative Wahl für Sequenzierungsplattform, können viele dieser Prozesse einschließlich der cDNA-Synthese mit Schritt Sequenzierung Bibliothek Generation gestrafft werden. Beispielsweise kann Ribo-Zero behandelten RNA verwendet werden, um metatranscriptome Sequenzierung Waage machenries mit ScriptSeq RNA-Seq Bibliothek Vorbereitung Kit.

Metagenom-Analyse von Tier-assoziierten Gemeinden bietet eine umfassende Darstellung des Gesamtfunktionseinheit, die den Host und die zugehörigen Gemeinden umfasst. Die hier vorgestellte Arbeitsablauf ist an eine Vielzahl von komplexen Tierassoziierten Proben, insbesondere solche, zähen Schleim, große Mengen von Zelltrümmern, extrazellulären DNA, Protein und Glycoprotein-Komplexe, sowie Wirtszellen neben dem gewünschten viralen und mikrobiellen enthalten Partikel. Obwohl virale und mikrobielle Partikel können bei jedem Schritt verloren werden Partikel der Isolierung und Reinigung sind für die Menge der Wirts-DNA zu minimieren. Während die Metagenomik Daten bietet metabolische Potentiale der untersuchten Gemeinden metatranscriptomics diese ergänzen durch die Enthüllung der differentiellen Expression von codierten Funktionen 9. Eine umfassende Beurteilung der Genomik und Transkripte Daten neu ins ergabüge auf die Dynamik der Gemeinschaft Interaktionen und erleichtert die Entwicklung von Therapien verbessern 9,10,55.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der National Institute of Health (1 R01 GM095384-01) Forest Rohwer ausgezeichnet unterstützt. Wir danken Epicentre, ein Illumina Unternehmen für die Bereitstellung frühzeitigen Zugang zu Ribo-Zero Epidemiologie Kits. Wir danken Mark Hatay für das Design und die Herstellung der Ultrazentrifuge Rohrhalter. Wir danken Andreas Haas und Benjamin Knowles für kritische Lesungen und Diskussionen des Manuskripts und Paul Lauren zur Unterstützung der Dreharbeiten.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Guanidine isothiocyanate-based RNA lysis buffer Life Technologies 10296-028 TRIzol LS Reagent was used in this study
Silica beads; 0.1 to 0.15 mm Cole-Parmer YO-36270-62 Zirconia-Silicate Beads were used in this study
Dithiothreitol Molecular Grade (Dry Powder) Promega V3155 Can be purchased from any other company
Sterile syringe filter; 0.45 µm pore size hydrophilic PVDF membrane Millipore SLHV033RS
DNase I enzyme  Calbiochem 260913
Sterile syringe filter; 0.02 µm pore size FisherScientific 09-926-13 Diameter: 25mm
Ultra-Clear Centrifuge Tubes Beckman 344059 9/16 X 3 ½ in. (14X90mm), suitable for SW41 Ti Rotor and VLPs density gradient ultracentrifugation
SW41 Ti Rotor Beckman 333790
SS-34 Fixed Angle Rotor Thermo Scientific 28020
Phi29 DNA polymerase Monserate Biotech 4001 10 U/µl
Phi29 Random Hexamer Thermo Scientific S0181 Previously bought from Fidelity Systems
Alumina matrix filter with annular polypropylene support ring; 0.02 µm pore size FisherScientific 09-926-34 Whatman Anodisc Filter Membranes were used in this study; Diameter 25mm
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain Life Technologies S-11494
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-100ML
RNase-free DNase I  NEB M0303S Can be purchased from any other company
Glycogen, RNA grade FisherScientific FERR0551 Can be purchased from any other company
Oak Ridge high-speed centrifuge tubes FisherScientific 05-562-16B For large volume DNA extraction procedure, suitable for SS-34 fixed-angle rotor
Total rRNA removal kit Epicentre MRZE724 ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiology) can be used to couple rRNA removal with sequencing library preparation
Cesium chloride  FisherScientific BP1595-500
Hexadecytrimethyl-ammonium bromide (CTAB) Sigma-Aldrich H5882-100G
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References

  1. Suau, A., et al. Direct analysis of genes encoding 16S rRNA from complex communities reveals many novel molecular species within the human gut. Applied and Environmental Microbiology. 65 (11), 4799-4807 (1999).
  2. Breitbart, M., et al. Genomic analysis of uncultured marine viral communities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (22), 14250-14255 (2002).
  3. Proctor, L. M. The human microbiome project in 2011 and beyond. Cell Hos., & Microbe. 10 (4), 287-291 (2011).
  4. Charlson, E. S., et al. Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 184 (8), 957-963 (2011).
  5. Pragman, A. A., Kim, H. B., Reilly, C. S., Wendt, C., Isaacson, R. E. The lung microbiome in moderate and severe chronic obstructive pulmonary disease. PLoS ONE. 7 (10), e47305 (2012).
  6. Kerem, B., et al. Identification of the Cystic Fibrosis gene: Genetic analysis. Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).
  7. Kleven, D., McCudden, C., Willis, M. Cystic Fibrosis: Newborn screening in America. Medical Laboratory Observer. 40 (7), 16-27 (2008).
  8. Fodor, A. A., et al. The adult cystic fibrosis airway microbiota is stable over time and infection type, and highly resilient to antibiotic treatment of exacerbations. PLoS ONE. 7 (9), e45001 (2012).
  9. Lim, Y. W., et al. Metagenomics and metatranscriptomics: Windows on CF-associated viral and microbial communities. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 12 (2), 154-164 (2012).
  10. Lim, Y. W., et al. Clinical insights from metagenomic analysis of sputum samples from patients with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 52 (2), 425-437 (2014).
  11. Claesson, M. J., et al. Comparison of two next-generation sequencing technologies for resolving highly complex microbiota composition using tandem variable 16S rRNA gene regions. Nucleic Acids Research. 38 (22), e200 (2010).
  12. Breitenstein, S., Tümmler, B., Römling, U. Pulsed field gel electrophoresis of bacterial DNA isolated directly from patients’ sputa. Nucleic Acids Research. 23 (4), 722-723 (1995).
  13. Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. Recombinant human DNase I reduces the viscosity of Cystic Fibrosis sputum. Proceedings of the National Academy of Sciences. 87 (23), 9188-9192 (1990).
  14. Lethem, M., James, S., Marriott, C., Burke, J. The origin of DNA associated with mucus glycoproteins in Cystic Fibrosis sputum. European Respiratory Journal. 3 (1), 19-23 (1990).
  15. Childs, W. C., Gibbons, R. J. Use of percoll density gradients for studying the attachment of bacteria to oral epithelial cells. Journal of Dental Research. 67 (5), 826-830 (1988).
  16. Lee, J. -. L., Levin, R. E. Use of ethidium bromide monoazide for quantification of viable and dead mixed bacterial flora from fish fillets by polymerase chain reaction. Journal of Microbiological Methods. 67 (3), 456-462 (2006).
  17. Breitenstein, S., Tümmler, B., Römling, U. Pulsed field gel electrophoresis of bacterial DNA isolated directly from patients’ sputa. Nucleic Acids Research. 23 (4), 722-723 (1995).
  18. Mokili, J. L., Rohwer, F., Dutilh, B. E. Metagenomics and future perspectives in virus discovery. Current Opinion in Virology. 2 (1), 63-77 (2012).
  19. Bibby, K. Improved bacteriophage genome data is necessary for integrating viral and bacterial ecology. Microbial Ecology. 67 (2), 242-244 (2014).
  20. Willner, D., et al. Metagenomic analysis of respiratory tract DNA viral communities in Cystic Fibrosis and non-Cystic Fibrosis individuals. PloS One. 4 (10), e7370 (2009).
  21. Willner, D., Furlan, M. Deciphering the role of phage in the cystic fibrosis airway. Virulence. 1 (4), 309-313 (2010).
  22. Willner, D., et al. Case studies of the spatial heterogeneity of DNA viruses in the cystic fibrosis lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46 (2), 127-131 (2012).
  23. Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics. mBio. 2 (2), e00012-e00011 (2011).
  24. He, S., et al. Metatranscriptomic array analysis of “Candidatus Accumulibacter phosphatis”-enriched enhanced biological phosphorus removal sludge. Environmental Microbiology. 12 (5), 1205-1217 (2010).
  25. Mokili, J. L., et al. Identification of a novel Human Papillomavirus by metagenomic analysis of samples from patients with febrile respiratory illness. PLOS ONE. 8 (3), e58404 (2013).
  26. Henig, N. R., Tonelli, M. R., Pier, M. V., Burns, J. L., Aitken, M. L. Sputum induction as a research tool for sampling the airways of subjects with Cystic Fibrosis. Thorax. 56 (4), 306-311 (2001).
  27. Rogers, G. B., et al. Use of 16S rRNA gene profiling by terminal restriction fragment length polymorphism analysis to compare bacterial communities in sputum and mouthwash samples from patients with Cystic Fibrosis. J. Clin. Microbiol. 44 (7), 2601-2604 (2006).
  28. Haas, A., et al. Unraveling the unseen players in the ocean – a field guide to water chemistry and marine microbiology. Journal of Visualized Experiments. In press, .
  29. Schmieder, R., Edwards, R. Quality control and preprocessing of metagenomic datasets. Bioinformatics. 27 (6), 863-864 (2011).
  30. Schmieder, R., Edwards, R. Fast identification and removal of sequence contamination from genomic and metagenomic datasets. PLOS ONE. 6 (3), e17288 (2011).
  31. Segata, N., et al. Metagenomic microbial community profiling using unique clade-specific marker genes. Nature Methods. 9 (8), 811-814 (2012).
  32. Meyer, F., et al. The metagenomics RAST server – a public resource for the automatic phylogenetic and functional analysis of metagenomes. BMC Bioinformatics. 9 (1), 386 (2008).
  33. Hara, N., et al. Prevention of virus-induced type 1 diabetes with antibiotic therapy. Journal of Immunology (Baltimore, Md.: 1950). 189 (8), 3805-3814 (2012).
  34. Markle, J. G. M., et al. Sex differences in the gut microbiome drive hormone-dependent regulation of autoimmunity. Science (New York, N.Y.). 339 (6123), 1084-1088 (2013).
  35. Ewing, B., Green, P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Research. 8 (3), 186-194 (1998).
  36. Ewing, B., Hillier, L., Wendl, M. C., Green, P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. I. Accuracy assessment. Genome Research. 8 (3), 175-185 (1998).
  37. Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics (Oxford, England). 27 (16), 2194-2200 (2011).
  38. Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).
  39. Pruesse, E., Peplies, J., Glöckner, F. O. SINA: accurate high-throughput multiple sequence alignment of ribosomal RNA genes. Bioinformatics (Oxford, England). 28 (14), 1823-1829 (2012).
  40. Robertson, C. E., et al. Explicet: graphical user interface software for metadata-driven management, analysis and visualization of microbiome data. Bioinformatics (Oxford, England). 29 (23), 3100-3101 (2013).
  41. Thurber, R. V., Haynes, M., Breitbart, M., Wegley, L., Rohwer, F. Laboratory procedures to generate viral metagenomes. Nat. Protocols. 4 (4), 470-483 (2009).
  42. Henn, M. R., et al. Analysis of high-throughput sequencing and annotation strategies for phage genomes. PLoS ONE. 5 (2), e9083 (2010).
  43. Duhaime, M. B., Deng, L., Poulos, B. T., Sullivan, M. B. Towards quantitative metagenomics of wild viruses and other ultra-low concentration DNA samples: a rigorous assessment and optimization of the linker amplification method. Environmental Microbiology. 14 (9), 2526-2537 (2012).
  44. Yilmaz, S., Allgaier, M., Hugenholtz, P. Multiple displacement amplification compromises quantitative analysis of metagenomes. Nat Meth. 7 (12), 943-944 (2010).
  45. Kim, K. -. H., Bae, J. -. W. Amplification methods bias metagenomic libraries of uncultured single-stranded and double-stranded DNA viruses. Applied and Environmental Microbiology. 77 (21), 7663-7668 (2011).
  46. Hurwitz, B. L., Deng, L., Poulos, B. T., Sullivan, M. B. Evaluation of methods to concentrate and purify ocean virus communities through comparative, replicated metagenomics. Environmental Microbiology. 15 (5), 1428-1440 (2013).
  47. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology. 215, 403-410 (1990).
  48. Angly, F., et al. PHACCS, an online tool for estimating the structure and diversity of uncultured viral communities using metagenomic information. BMC Bioinformatics. 6 (1), 41 (2005).
  49. Angly, F. E., et al. The GAAS Metagenomic Tool and Its Estimations of Viral and Microbial Average Genome Size in Four Major Biomes. PLoS Comput Biol. 5 (12), (2009).
  50. Dutilh, B. E., et al. Reference-independent comparative metagenomics using cross-assembly: crAss. Bioinformatics (Oxford, England). 28 (24), 3225-3231 (2012).
  51. Fancello, L., Raoult, D., Desnues, C. Computational tools for viral metagenomics and their application in clinical research. Virology. 434 (2), 162-174 (2012).
  52. Allesen-Holm, M., et al. A characterization of DNA release in Pseudomonas aeruginosa cultures and biofilms. Molecular Microbiology. 59 (4), 1114-1128 (2006).
  53. Stewart, F. J., Ottesen, E. A., DeLong, E. F. Development and quantitative analyses of a universal rRNA-subtraction protocol for microbial metatranscriptomics. ISME J. 4 (7), 896-907 (2010).
  54. Frias-Lopez, J., et al. Microbial community gene expression in ocean surface waters. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (10), 3805-3810 (2008).
  55. Lim, Y. W., et al. Mechanistic model of Rothia mucilaginosa adaptation toward persistence in the CF lung, based on a genome reconstructed from metagenomic data. PLOS ONE. 8 (5), e64285 (2013).

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Lim, Y. W., Haynes, M., Furlan, M., Robertson, C. E., Harris, J. K., Rohwer, F. Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples. J. Vis. Exp. (94), e52117, doi:10.3791/52117 (2014).
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