تنقية انجاس: تسلسل Metagenomes وMetatranscriptomes من مجمع عينات المرتبط الحيوانية
Summary
باستخدام التليف الكيسي الهوائية كمثال على ذلك، تقدم المخطوطة سير عمل شامل يضم مجموعة من النهج ميتاجينومية وmetatranscriptomic لتوصيف الجرثومية والفيروسية المجتمعات في عينات المرتبط الحيوان.
Abstract
إمكانية الوصول إلى الإنتاجية العالية التسلسل قد أحدثت ثورة العديد من مجالات علم الأحياء. من أجل فهم أفضل المجتمعات الفيروسية والميكروبية المصاحبة المضيفة، وقد تم تطوير سير عمل شامل لاستخراج DNA و RNA. سير العمل في وقت واحد يولد metagenomes الفيروسية والجرثومية، وكذلك metatranscriptomes، من عينة واحدة للجيل المقبل من التسلسل. اقتران هذه النهج يوفر لمحة عامة عن كل من الخصائص التصنيفية وظائف المجتمع المشفرة. طرق عرض استخدام التليف الكيسي (CF) البلغم، وهو نوع العينة إشكالية، لأنه لزج بشكل استثنائي ويحتوي على كمية عالية من mucins، DNA العدلات الحرة، وغيرها من الملوثات غير معروفة. بروتوكولات الموصوفة هنا تستهدف هذه المشاكل وبنجاح استعادة الحمض النووي الفيروسي والجرثومي مع الحد الأدنى من التلوث الحمض النووي البشري. لاستكمال الدراسات metagenomics، تم تحسين بروتوكول metatranscriptomics لاسترداد كل من الجراثيمومرنا المضيف الذي يحتوي على عدد قليل نسبيا من RNA الريباسي (الرنا الريباسي) متواليات. ويقدم لمحة عامة عن خصائص البيانات لتكون بمثابة مرجعية لتقييم نجاح الأساليب. تم جمع عينات البلغم CF إضافية أيضا إلى (ط) تقييم اتساق ملامح microbiome عبر سبعة أيام متتالية داخل مريض واحد، و (ثانيا) مقارنة اتساق النهج ميتاجينومية إلى القائم على التسلسل الجيني RNA الريباسي 16S. وأظهرت النتائج أن التذبذب اليومي لمحات الميكروبية دون اضطراب المضادات الحيوية كان في حده الأدنى، وكانت ملامح تصنيف البكتيريا الشائعة المرتبطة CF-مماثل إلى حد كبير بين المكتبات 16S rDNA وmetagenomes المتولدة من تحلل منخفض التوتر (HL) DNA -derived. ومع ذلك، فإن الاختلافات بين 16S rDNA ملامح تصنيفية ولدت من الحمض النووي DNA الكلي وHL المشتقة تشير إلى أن تحلل منخفض التوتر والخطوات غسل تستفيد ليس فقط إزالة DNA المستمدة من الإنسان، ولكن أيضا extracellul الميكروبية المشتقةDNA AR التي قد تحريف لمحات الميكروبية الفعلية.
Introduction
وقد تم التحقيق في المجتمعات الفيروسية والجرثومية المرتبطة جسم الإنسان على نطاق واسع في العقد الماضي من خلال تطبيق تقنيات التسلسل 1،2. وقد أدت النتائج إلى الاعتراف الميكروبات أهمية في صحة الإنسان والمرض. وجاءت مبادرة رئيسية من المشروع الإنساني microbiome التي تصف البكتيريا (وبعض العتيقة) المقيمين على جلد الإنسان، وداخل تجاويف الفم والمجاري التنفسية والجهاز البولي التناسلي، والجهاز الهضمي 3. وقد أظهرت الدراسات microbiome مزيد من الخطوط الجوية البشرية السليمة من خلال غسل القصبات (BAL) 4،5 ومسحات البلعوم 4 أن الرئة يمكن أن تكون بمثابة جهاز أخذ العينات البيئية، والنتائج في الاستعمار الميكروبي عابرة في الشعب الهوائية. ومع ذلك، فإن تأثير الاستعمار الميكروبي في السطوح مجرى الهواء ضعاف يمكن أن يؤدي إلى التهابات الرئة الحادة والمزمنة، مثل تلك التي ظهرت في التليف الكيسي (CF) من المرضى.
ر "> CF هو مرض وراثي مميت الناجمة عن طفرة في التليف الكيسي عبر الغشاء منظم (CFTR) الجينات 6. هذه الطفرات تؤدي إلى البروتينات CFTR المعيبة التي تؤثر بدورها على نقل أيون بطريق الظهارة عبر سطح قمية من ظهارة. ويؤثر هذا المرض نظم الجهاز متعددة، ولكن الغالبية العظمى من الوفيات والمراضة تعزى إلى أمراض الرئة CF 7. ويوفر CF الرئة نظام بيئي فريد من نوعه للاستعمار الميكروبي. وخلل في نقل أيون يسبب المخاط لبناء في الشعب الهوائية CF، وخلق microenvironments تتكون من الهوائية ، microaerophilic، ومقصورات اللاهوائية الراسية التي كتبها ثابت الغنية بالمغذيات سطح الغشاء المخاطي. تسهل هذه البيئة الاستعمار وانتشار الميكروبات، بما في ذلك الفيروسية والبكتيريا والفطريات. الحادة والالتهابات الرئوية المزمنة الميكروبية يؤدي إلى استجابات مناعية مستمرة ولكن غير فعالة، مما أدى إلى إعادة عرض واسعة مجرى الهواء، وفقدان القدرة الرئوية، وpulmo في نهاية المطاففشل نارى.المجتمعات البكتيرية المرتبطة CF الرئة وقد وصفت جيدا باستخدام كل الأساليب التي تعتمد على ثقافة والثقافة المستقلة، والتي تشمل استخدام 16S RNA الريباسي (الرنا الريباسي) التسلسل الجيني 8 و metagenomics بندقية 9،10. النهج القائم على الرنا الريباسي-16S قادر على تميز مجموعة واسعة من الأنواع الميكروبية والتقاط تحولات واسعة في تنوع المجتمع. ومع ذلك، فإنه يقتصر في قرارها في تحديد المجتمعات (تلخيصها في كلايسون وآخرون. 2010 11 و) والتنبؤات من إمكانات التمثيل الغذائي تقتصر على تلك الوظائف العامة المعروفة لالأصناف التي تم تحديدها. ولذلك، 16S الرنا الريباسي طرق التسلسل الجيني غير كافية لالضرورية التصنيفية والوظيفية دقة تحليلية من المجتمعات الميكروبية المتنوعة الموجودة في CF الرئتين. النهج ميتاجينومية الموصوفة هنا يكمل النهج القائم على الرنا الريباسي-16S، يتغلب على حدودها، وتمكن وسيلة فعالة نسبيالتحليل كل من التصنيف المجتمع الميكروبي ومحتويات الوراثية في CF الرئتين.
DNA الميكروبات المعزولة من عينات المرتبطة الحيوان غالبا ما يحتوي على كمية كبيرة من الحمض النووي المضيف. تحتوي البلغم أو أنسجة الرئة عينات CF عادة كمية كبيرة من الحمض النووي البشري الصادرة عن العدلات في الاستجابة المناعية، في كثير من الأحيان أكثر من 99٪ من إجمالي DNA 12-14. ورغم أن بعض الخلايا البشرية سليمة قد تكون موجودة، ومعظم هذه DNA هو حر في حل أو كثف على سطح الميكروبات. وبالإضافة إلى ذلك، فإن وجود شمعات لزجة استثنائي المخاط، والحطام الخلوي، وغيرها من الملوثات غير معروفة تزيد من تعقيد عزل الخلايا الميكروبية. تم اختبار عدة طرق لالمستنفدة هذه عينات من الحمض النووي البشري، بما في ذلك التدرجات Percoll إلى الإنسان منفصل عن الخلايا الميكروبية 15، والمعاملة مع الدناز I، إيثيديوم بروميد monoazide أن تتحلل بشكل انتقائي DNA البشري 16، وعدة MolYsis، مع كل نجاح محدود. حتى الآن إجراء تنقية الحمض النووي الميكروبي الأكثر فعالية لCF البلغم وكان التعديل من عملية وصفها بريتنستاين وآخرون (1995) 17. هذا النهج، والمعروف هنا كما منخفض التوتر طريقة تحلل (HL)، يستخدم مزيجا من β المركابتويثانول للحد من الميوسين السندات ثاني كبريتيد، تحلل منخفض التوتر من الخلايا حقيقية النواة، والدناز I علاج DNA للذوبان 9. وعلى الرغم من عدم وجود بدائل أثارت طريقة HL بعض المخاوف نظرا ل(ط) التحيزات المحتملة الناتجة عن تحلل غير المرغوب فيها من الميكروبات و (ب) ما إذا كانت التقلبات الملحوظة في تكوين المجتمع 9،10 هي قطعة أثرية من الاختلافات المرتبطة تجهيز العينات. بالإضافة إلى توليد metagenomes بندقية، نعالج هذه القضايا من خلال مقارنة ملامح الجينات 16S الرنا الريباسي من الحمض النووي DNA الكلي والجراثيم المستخرجة من طريقة HL باستخدام نفس مجموعة من عينات البلغم التي تم جمعها من مريض واحد في سبعة أيام متتالية.
والأنف والحنجرة "> وبالمقارنة مع المجتمعات الميكروبية، وتوصيف المجتمعات الفيروسية المرتبطة مع الحيوانات محدود 18،19 اتسمت المجتمعات الفيروسية في CF الهوائية فقط الحد الأدنى 20 – 22 أول دراسة ميتاجينومية تميز DNA المجتمعات الفيروسية في CF الهوائية أظهرت أن معظم الفيروسات المرتبطة CF الرئتين هي فاجات 20، وكانت إمكانات التمثيل الغذائي من فج في CF والأفراد غير CF-اختلافا كبيرا. على وجه التحديد، قامت المجتمعات فج في الأفراد CF الجينات تعكس التعديلات المضيف البكتيرية لفسيولوجيا CF الهوائية، وأظهرت البكتيرية الفوعة 20. ميتاجينومية الدراسات اللاحقة للفيروسات في أنسجة الرئة CF التنوع المكاني واضح في المجتمعات الفيروسية بين المناطق التشريحية 22. وبالإضافة إلى ذلك، تؤوي الأنسجة CF الرئة أدنى التنوع الفيروسي لوحظ حتى الآن في أي نظام إيكولوجي 22. وكانت معظم الفيروسات التي تم تحديدها فاجاتمع احتمال أن تصيب مسببات الأمراض CF. ومع ذلك، تم الكشف أيضا الفيروسات مثل فيروس الهربس حقيقية النواة، الفيروسات الغدية، والفيروسات الورم الحليمي البشري (HPV). في حدث واحد، حيث لوحظت الخراجات في أنسجة الرئة أثناء تشريح، تم استرداد أكثر من 99٪ من الجينوم الورم الحليمي البشري، على الرغم من أن المريض تم تشخيص أبدا مع الورم الحليمي الرئوي أو سرطان. هذا يدل على أن التنوع الفيروسي الحاضر يعكس ليس فقط من شدة تلف الأنسجة، ولكن يمكن أيضا أن يعرض ويفسر مرض uncharacterized الأساسي. بروتوكولات الموصوفة هنا توفر طريقة بسيطة، لكنها قوية لعزل الجزيئات الفيروسية مثل (VLPs) من العينات التي تتكون من كميات كبيرة من المخاط السميك، المضيف والخلايا الميكروبية، DNA مجانا، فضلا عن الحطام الخلية.واستكمالا لmetagenomics، يتم استخدام metatranscriptomics لمراقبة ديناميكية في التعبير الجيني في جميع أنحاء المجتمع الميكروبي والمضيف 9،23. في هذه الحالة، سواء الميكروبية وملتحقار مرنا تحتاج إلى أن يتم اختيار تفضيلي. منذ لا مذيل بعديد الأدينيلات من mRNAs البكتيرية، لا يمكن استغلال مرنا طريقة المنسدلة مقرها بنسبة ضئيلة من DT. تعتمد على تذييل بعديد الأدينيلات RNA التضخيم لا يمكن أن تستخدم في عينات المرتبطة المضيفة إذا ما يعرف العينات تحتوي على كميات كبيرة من مرنا حقيقية النواة. كثير من العينات المرتبطة الحيوان، بما في ذلك CF البلغم، وتحتوي على كثافة عالية من الخلايا، بالإضافة إلى كميات كبيرة من الحطام الخلوي وnucleases التي تشمل RNases. ولذلك، مهمة صعبة أخرى هي لمنع تدهور RNA واسعة النطاق خلال metatranscriptome المعالجة. في معظم الحالات، الحمض النووي الريبي مجموع المستخرج من البلغم CF هو المتدهورة جزئيا، مما يحد من التطبيقات المصب وفائدة من الحمض النووي الريبي مشتقة. في السنوات الأخيرة، وقد وضعت عدة نهج لاستنزاف الرنا الريباسي وتكييفها في مجموعات المتاحة تجاريا. فعالية هذه النهج ولكن يقتصر، وخاصة عند العمل مع متدهورة جزئيا الريباسي 9،24. الأساليب المستخدمة هنا تسمحإد لاسترجاع الحمض النووي الريبي مجموع المتدهورة جزئيا مناسبة للكفاءة التحويلية الإجمالية إزالة الرنا الريباسي. وقد تجلى المقارنة المباشرة من كفاءة في إزالة الرنا الريباسي من الحمض النووي الريبي مجموع المتدهورة جزئيا المقارنة بين اثنين من مجموعات مختلفة من قبل ليم وآخرون (2012) 9.
وعموما، فإن الهدف من هذا المخطوط هو توفير مجموعة كاملة من البروتوكولات (الشكل 1) لتوليد metagenomes بندقية الفيروسية والجرثومية، وmetatranscriptome، من عينة المرتبط حيوان واحد، وذلك باستخدام عينة البلغم الناجم عن كمثال على ذلك. وينبغي أن تتضمن سير العمل مختبر الجزيئية مناطق منفصلة قبل وبعد التضخيم للحد من التلوث المتبادل. أساليب قابلة للتكيف بسهولة إلى أنواع أخرى مثل عينة الأنسجة 22، البلعوم والفم والبلعوم مسحات 25، غسيل القصبات (BAL) والمرجان (بيانات غير منشورة). يجب معالجة كل عينة فور جمع وخصوصا عندما metagenomics الميكروبية والتقىوالمطلوب atranscriptomics الدراسات. إذا تم تجميد العينات، أنه يحد من عزل الخلايا الميكروبية سليمة لmetagenomes الميكروبي عن تجميد يحتمل تعطيل سلامة الخلية. ومع ذلك، لا يمنع تجميد metatranscriptomics والعزلة الفيروسية، ولكن نوعية من الحمض النووي الريبي وكمية من الجسيمات الفيروسية تعافى قد تتأثر من خلال عملية تجميد ذوبان الجليد. من المهم أن نلاحظ أن البلغم قد خدم يسببها كمصدر أساسي للعينات في العديد من الدراسات المرتبطة مع المرضى CF الكبار والأمراض الرئوية المزمنة الأخرى 26،27 كما BAL يمكن أن يكون الغازية أيضا. في دراساتنا، تم جمع عينات البلغم مع طريقة أخذ العينات دقيق وثابت، أي بعد غسول الفم والشطف من تجويف الفم باستخدام محلول ملحي معقم للحفاظ على تلوث الميكروبات عن طريق الفم داخل عينات البلغم إلى أدنى حد ممكن.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metagenomics الفيروسية
وتتركز الجسيمات الفيروسية باستخدام البولي ايثيلين جلايكول (PEG) هطول الأمطار أو مركزات حجم الصغيرة. في بعض الحالات، قد لا تكون هناك حاجة إلى تركيز، ولكن تستخدم ما قبل الترشيح أو منخفضة الخطوات سرعة الطرد المركزي لإزالة الخلايا حقيقية النواة والميكروبية. وسيتواصل إثراء لست] الفيروسية وتنقيتها باستخدام التدرج الكثافة تنبيذ فائق 9،41 أو مرشحات صغيرة الحجم (على سبيل المثال، 0.45 ميكرون) لإزالة الخلايا الميكروبية حقيقية النواة والكبيرة 25. وعادة ما يتم تنفيذ كثافة التدرج تنبيذ فائق مع حلول كثيفة ولكن الخاملة مثل السكروز أو السيزيوم كلوريد لعزل والتركيز الجسيمات الفيروسية 41. ويستند الفصل المادي على حجم وكثافة الطفو من الجسيمات الفيروسية. لذلك، واختيار المناسب لحجم مرشح المسام وإعداد دقيق للالتدرجات ضرورية لعزل المجتمعات الفيروسية محددة، ونجاح التأهيل البدني للVLPs يحدد المجتمع معزولة 41 (أي الجسيمات الفيروسية التي لا تمر عبر مرشح أو يدخل في كثافة استخراج لن يتم الكشف في metagenome). بعد العزلة الفيروسية والتركيز، قد يكون هناك تلوث غير الفيروسية الحاضر المواد الجينومية في العينة سواء في شكل الأحماض النووية حرة والجراثيم والخلايا حقيقية النواة. لذا، فمن الأهمية بمكان للتحقق من نقاء الجسيمات الفيروسية في عينات (أرقام 1A و 1B). ويستخدم العلاج الكلوروفورم عادة لليز الخلايا المتبقية، تليها العلاج نوكلياز للحط من الأحماض النووية المجانية قبل استخراج الحمض النووي.
وكان التحذير لسير العمل قدم استخدام كثافة الفصل المتدرج لعزل الجزيئات الفيروسية لأنها قد تستبعد الجسيمات الفيروسية يلفها التي قد تكون مزدهرة جدا لدخول التدرج CSCL. بديل "الصيد الجميع" طريقة لحذف separ كثافة التدرجأوجه وعزل DNA المجتمع من 0.45 ميكرون – الرواشح تعامل مع الكلوروفورم والدناز I. هذا النهج هو أيضا مناسبة لاستيعاب حجم عينة صغيرة مثل تلك التي من مسحات أو بلازما الدم. ومع ذلك، فإن هذا قد يؤدي إلى التلوث الجرثومي مقاومة للالكلوروفورم ومبلغ أعلى من الحمض النووي خارج الخلية مقاومة للI الدناز.
بروتوكولات التسلسل الحالية تتطلب 1 نانوغرام إلى 1 ميكروغرام من الأحماض النووية لإعداد مكتبة التسلسل حيث توفر عوائد أعلى DNA خيارات أوسع من الخيارات التسلسل. تركيز الحمض النووي من viromes الناتجة غالبا ما يتراوح بين أقل من الحد الكشف لأكثر من 200 نانوغرام / ميكرولتر. كمية الأحماض النووية الفيروسية تعافى قد لا تكون كافية لإعداد مكتبة التسلسل المباشر. في مثل هذه الحالات، والتضخيم الحمض النووي أمر ضروري. رابط التضخيم بندقية المكتبات (LASLs) 2،42،43 وكله تضخيم الجينوم على أساس تعدد التضخيم النزوح (MDA) هي اثنينطرق الأكثر شيوعا لتوليد DNA كافية لالتسلسل. ومن المعروف طرق MDA مثل تلك القائمة على Phi29 DNA بوليميريز تعاني من التحيز التضخيم، ويمكن تضخيم تفضيلي ssDNA وDNA دائري، مما أدى إلى تصنيفية غير الكمي وتوصيف وظيفي 44،45. وقد تبين لإصدار الأمثل للنهج LASLs لإدخال فقط الحد الأدنى من التحيزات، ويعزز حساسية أعلى (لكميات صغيرة من المواد ابتداء)، ويتم تكييف بسهولة لمنصات مختلفة تسلسل 43. ومع ذلك، فإن النهج العديد من الخطوات، يتطلب معدات متخصصة لتقليل الخسائر DNA، ويقتصر على القوالب dsDNA. في المختبر لدينا، وقد تم تكييف هذا النهج بنجاح لتضخيم كمية كشفها وغير قابل للكشف من الحمض النووي المستخرج من lavage- القصبات، VLPs المرجان والبحر المستمدة من المياه (غير منشورة وهرويتز وآخرون 46).
تطوير خطوط أنابيب تحليل البيانات لديها CLAكان ssically واحدة من أصعب جوانب التحليل metagenomics الفيروسي بسبب الطبيعة المتنوعة للغاية وغير معروفة إلى حد كبير من المجتمعات الفيروسية. في حين أن هناك ما يقدر بنحو 10 8 التراكيب الوراثية الفيروسية في المحيط الحيوي، حتى الآن قواعد البيانات الفيروسية الحالية احتواء ~ 4،000 الجينومات الفيروسية، وهي عبارة عن 1/100000 من مجموع هذا التنوع الفيروسي تقريبي. لذلك، وعمليات التفتيش القائم على التشابه (مثل BLAST 47) لاحالة التصنيف وظيفية في metagenomes الفيروسي تمتلك التحديات الكامنة. تفشل العديد من متواليات أن هناك أوجه شبه كبيرة لالجينوم في قاعدة البيانات، وبالتالي، تصنف على أنها غير معروفة. على الرغم من عمليات البحث على أساس التماثل هي أهم التطبيقات لتعيين التصنيف وتعمل لتسلسل البيانات، تم وضع النهج البديلة على أساس تحليل قاعدة بيانات مستقلة 48- 50. Fancello وآخرون. 51 تقديم استعراض كاملة من الأدوات والخوارزميات الحسابية المستخدمة في فيراmetagenomics لتر.
الميكروبية Metagenomics
عادة، فإن المبلغ الإجمالي من الحمض النووي المستخرج من المجتمعات ناقص التوتر المعالجة تحلل الميكروبية (HL-DNA) تتراوح من 20 نانوغرام إلى 5 ميكروغرام. العائد يعتمد اعتمادا كبيرا على الحالة الصحية للمريض وكمية عينة البلغم التي تم جمعها، وهو ما يفسر الاختلافات ينظر في العائد الكلي للHL-DNA المستخرج في هذه الدراسة (الجدول 2). الخطوات الحاسمة لتوليد تعتمد البيانات تسلسل نوعية جيدة على نوعية المكتبات تسلسل ولدت. ويبين الشكل 2 مجموعة حجم نموذجية لمكتبات التسلسل المتولدة من الحمض النووي الميكروبي المستمدة البلغم-CF باستخدام إجراء تجزئة الحمض النووي القائم على الأنزيمية. حجم مكتبة الأمثل يعتمد على اختيار منصة التسلسل والتطبيق، وبالتالي، يمكن أن يكون الأمثل الإجراء التجزؤ، وإذا لزم الأمر، من خلال النهج البديلة مثل صوتنة وإرذاذ. بالإضافة إلىنتائج تمثيلية المقدمة، ويتضح نجاح الطريقة المعروضة على البلغم CF جمعها من المرضى متعددة عبر نقاط زمنية متعددة أيضا في ليم وآخرون (2012) 9 وليم وآخرون (2014) 10.
الدراسات السابقة 9،10 تشير إلى أن كل مريض المرافئ مجموعة فريدة من المجتمع الميكروبي أن التحولات بمرور الوقت، مما يعكس استمرار اللاعبين الرئيسيين في المجتمع في حين من المرجح تقلبات بسبب الاضطرابات مثل العلاج بالمضادات الحيوية. إذا ما كان سبب هذه التقلبات يوميا حتى من دون اضطرابات الخارجية أو نتيجة لإجراءات أخذ العينات وتجهيز العينات، لا يزال في السؤال. وبناء على ميتاجينومية-DNA HL و16S rDNA تحليل amplicon، تظهر أخذ العينات طولية لمدة 7 أيام أن التذبذب اليومي لمحات الميكروبية دون اضطراب المضادات الحيوية (يوم 1 و 2 و 3) والحد الأدنى (أرقام 3A و 3B). على مقدمةالدرفلة الجديد من المضادات الحيوية عن طريق الفم مباشرة بعد أخذ العينات يوم 3، وأصبحت التغييرات في ملف تعريف المجتمع على ما يبدو في يوم 4. على الرغم من أن سيبروفلوكساسين المضادات الحيوية يستهدف طائفة واسعة من مسببات الأمراض البكتيرية المعروفة مثل P. الزنجارية، المكورات العنقودية الذهبية، والالتهاب الرئوي العقدية، زادت العلاج الوفرة النسبية للP. الزنجارية في حين خفض النيابة العقدية. وP. melaninogenica. قبل يوم 6، والمجتمع تعافى ببطء إلى بنية المجتمع الانطلاق الأولي. وتشير النتائج إلى أن تقلبات لمحات الميكروبية في مريض واحد أكثر عرضة بسبب الاضطرابات المجتمع في الشعب الهوائية.
وبالنظر إلى الاتساق بين ملامح الميكروبية المكتبات 16S rDNA وmetagenomes من DNA HL المشتقة، ونحن استبعد التحيز منشؤها من الاشعال 16S الرنا الريباسي المستخدمة في هذه الدراسة. أحد التفسيرات المحتملة للاختلافات في انحاء 16S rDNA للتصنيفلمحات آل المتولدة من الحمض النووي DNA الكلي وHL المشتقة (الشكل 3B) قد يكون وجود كميات عالية من أنواع الزائفة. DNA خارج الخلية بعد العلاج بالمضادات الحيوية. ويؤيد ذلك النتائج أن هذه الخلافات كانت الأكثر وضوحا في يوم 7، بعد ثلاثة أيام من العلاج بالمضادات الحيوية، والذي يستهدف الزائفة. بالإضافة إلى آخرين. يستخدم سيبروفلوكساسين عادة كعلاج الخط الأول في المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي وP. المزمن العدوى الزنجارية على الرغم من الطيف نشاطها يشمل معظم مسببات الأمراض المرتبطة CF. لقد افترضنا أن العلاج بالمضادات الحيوية تقضي على المجتمعات عرضة بما في ذلك العقدية النيابة. وبالتالي خلق مكانة يشغلها مقاومة P. الزنجارية. الزائفة الزنجارية قد كسب المقاومة من خلال زيادة المجتمعات بيوفيلم ولقد ثبت DNA خارج الخلية ليكون الدعم الهيكلي الرئيسي للعمارة بيوفيلم لها 52. حتى مع رإنه بنية المجتمع استردادها، DNA خارج الخلية قد ظلت في CF البلغم. ولذلك، تشير هذه البيانات إلى أن تحلل منخفض التوتر والخطوات غسل الواردة في هذا العمل أن تستفيد ليس فقط إزالة DNA المستمدة من الإنسان، ولكن DNA خارج الخلية أيضا المستمدة الميكروبية التي قد تحريف لمحات الميكروبية الفعلية.
Metatranscriptomics
A جودة عالية metatranscriptome يجب أن يحتوي على عدد قليل نسبيا من RNA الريباسي (الرنا الريباسي) تسلسل وتمثل أخذ العينات غير متحيزة للمحاضر المجتمع (مرنا). نظرا لنصف عمر قصير وكمية محدودة من مرنا، فمن الأهمية بمكان أن البروتوكول، كما وردت هنا، ويقلل من التعامل مع عينة لتحقيق أقصى قدر من عدد من النصوص استردادها.
في السنوات الأخيرة، وقد وضعت عدة نهج لاستنزاف الرنا الريباسي وتكييفها في مجموعات المتاحة تجاريا. وتشمل هذه MICROB إثراء، RIBO-صفر، وعينة محددة ح مطروحybridizations 53 التي تستند التهجين قليل النوكليوتيد، و-ONLY مرنا المجموعة التي تقوم على النشاط الأنزيمي نوكلياز خارجية تستهدف RNA يحتوي على "أحادي 5. وبالإضافة إلى ذلك، هناك عدة مناهج لالتخصيب مرنا مثل MessageAmp كيت II-البكتيريا التي polyadenylates تفضيلي، ويضاعف RNA الخطي وتتوفر أيضا. وتستخدم بعض هذه الأساليب (مثل مرنا-ONLY، MICROB E إكسبرس وMessageAmp) في وقت واحد لتحقيق الكفاءة المثلى. ومع ذلك، فإن فعالية كل من هذه الطرق محدودة، وخاصة عند العمل مع المتدهورة جزئيا الريباسي، وكثيرا ما لوحظ في الحمض النووي الريبي مجموع المستخرج من عينات CF. تعتمد على تذييل بعديد الأدينيلات RNA التضخيم لا يمكن استخدامها لتوليد metatranscriptomes تتألف من مرنا حقيقية النواة وبدائيات النواة. وبالإضافة إلى ذلك، أضاف بولي (A) الذيل لتسلسل قد يقلل من كمية البيانات تسلسل مفيدة. والمناطق التي تمتد المبلمر المتجانس تميل إلى أن انخفاض درجات الجودة، جausing عددا كبيرا من يقرأ لتتم تصفيته من قبل التسلسل والبرمجيات بعد التسلسل، ومتوسط طول المفيد قراءة بعد التشذيب قبالة بولي سيتم تخفيض (A) ذيول بشكل كبير 54.
التعامل مع المجتمعات الميكروبية CF معقدة وRNA المتدهورة جزئيا (أرقام 4A و 4C)، وأظهرت دراسة سابقة أن لدينا طريقة التهجين التقاط الذهب من قبل عدة RIBO-صفر كان أكثر فعالية في إزالة البشرية والميكروبية الريباسي مقارنة مع الجمع بين العلاج باستخدام مجموعات أخرى 9 (الجدول 3). يسمح البيانات الناتجة التحليل المتزامن لكلا المضيف البشري والنصوص الميكروبية. اعتمادا على المحصول ونوعية RNA، فضلا عن الاختيار النهائي من منصة التسلسل، وكثير من هذه العمليات بما في ذلك خطوة التوليف [كدنا يمكن تبسيط مع الجيل مكتبة التسلسل. على سبيل المثال، RIBO-صفر RNA المعالجة يمكن استخدامها لجعل metatranscriptome التسلسل برةريس باستخدام عدة ScriptSeq RNA تسلسل إعداد المكتبة.
يوفر تحليل ميتاجينومية من المجتمعات المرتبطة الحيوان تمثيل شامل للكيان وظيفي شامل يتضمن المضيفة والمجتمعات المرتبطة بها. سير العمل المعروضة هنا هي قابلة للتكيف مع مجموعة متنوعة من عينات المرتبطة الحيوان المعقدة، وخاصة تلك التي تحتوي على مخاط سميك، على كميات عالية من الحطام الخلية، والحمض النووي خارج الخلية والبروتينات والمجمعات بروتين سكري، وكذلك الخلايا المضيفة بالإضافة إلى المطلوب الميكروبية الفيروسية و الجسيمات. على الرغم من الجسيمات الفيروسية والجرثومية قد تفقد في كل خطوة، والجسيمات العزل وتنقية ضرورية لتقليل كمية من الحمض النووي المضيف. في حين يوفر بيانات metagenomics إمكانات التمثيل الغذائي للمجتمعات فحصها، metatranscriptomics تكمل هذا من خلال الكشف عن التعبير التفاضلية من الوظائف المشفرة 9. وقد أسفر تقييم شامل للعلم الجينوم والنصوص البيانات الإضافية الجديدةights لديناميات التفاعل المجتمعي ويسهل تطوير وتحسين العلاجات 9،10،55.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة (1 R01 GM095384-01) منحت لغابة Rohwer. نشكر EPICENTRE، وهي شركة البورشيد لتوفير الوصول المبكر إلى مجموعات RIBO-صفر علم الأوبئة. نشكر كافة هاتاي لتصميم وإنتاج حامل أنبوب تنبيذ فائق. نشكر أندرياس هاس وبنيامين نولز للقراءات ومناقشات حاسمة للمخطوطة، ولورين بول لمساعدة عملية التصوير.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Guanidine isothiocyanate-based RNA lysis buffer | Life Technologies | 10296-028 | TRIzol LS Reagent was used in this study |
| Silica beads; 0.1 to 0.15 mm | Cole-Parmer | YO-36270-62 | Zirconia-Silicate Beads were used in this study |
| Dithiothreitol Molecular Grade (Dry Powder) | Promega | V3155 | Can be purchased from any other company |
| Sterile syringe filter; 0.45 µm pore size hydrophilic PVDF membrane | Millipore | SLHV033RS | |
| DNase I enzyme | Calbiochem | 260913 | |
| Sterile syringe filter; 0.02 µm pore size | FisherScientific | 09-926-13 | Diameter: 25mm |
| Ultra-Clear Centrifuge Tubes | Beckman | 344059 | 9/16 X 3 ½ in. (14X90mm), suitable for SW41 Ti Rotor and VLPs density gradient ultracentrifugation |
| SW41 Ti Rotor | Beckman | 333790 | |
| SS-34 Fixed Angle Rotor | Thermo Scientific | 28020 | |
| Phi29 DNA polymerase | Monserate Biotech | 4001 | 10 U/µl |
| Phi29 Random Hexamer | Thermo Scientific | S0181 | Previously bought from Fidelity Systems |
| Alumina matrix filter with annular polypropylene support ring; 0.02 µm pore size | FisherScientific | 09-926-34 | Whatman Anodisc Filter Membranes were used in this study; Diameter 25mm |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Life Technologies | S-11494 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| RNase-free DNase I | NEB | M0303S | Can be purchased from any other company |
| Glycogen, RNA grade | FisherScientific | FERR0551 | Can be purchased from any other company |
| Oak Ridge high-speed centrifuge tubes | FisherScientific | 05-562-16B | For large volume DNA extraction procedure, suitable for SS-34 fixed-angle rotor |
| Total rRNA removal kit | Epicentre | MRZE724 | ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiology) can be used to couple rRNA removal with sequencing library preparation |
| Cesium chloride | FisherScientific | BP1595-500 | |
| Hexadecytrimethyl-ammonium bromide (CTAB) | Sigma-Aldrich | H5882-100G |
References
- Suau, A., et al. Direct analysis of genes encoding 16S rRNA from complex communities reveals many novel molecular species within the human gut. Applied and Environmental Microbiology. 65 (11), 4799-4807 (1999).
- Breitbart, M., et al. Genomic analysis of uncultured marine viral communities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (22), 14250-14255 (2002).
- Proctor, L. M. The human microbiome project in 2011 and beyond. Cell Hos., & Microbe. 10 (4), 287-291 (2011).
- Charlson, E. S., et al. Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 184 (8), 957-963 (2011).
- Pragman, A. A., Kim, H. B., Reilly, C. S., Wendt, C., Isaacson, R. E. The lung microbiome in moderate and severe chronic obstructive pulmonary disease. PLoS ONE. 7 (10), e47305 (2012).
- Kerem, B., et al. Identification of the Cystic Fibrosis gene: Genetic analysis. Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).
- Kleven, D., McCudden, C., Willis, M. Cystic Fibrosis: Newborn screening in America. Medical Laboratory Observer. 40 (7), 16-27 (2008).
- Fodor, A. A., et al. The adult cystic fibrosis airway microbiota is stable over time and infection type, and highly resilient to antibiotic treatment of exacerbations. PLoS ONE. 7 (9), e45001 (2012).
- Lim, Y. W., et al. Metagenomics and metatranscriptomics: Windows on CF-associated viral and microbial communities. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 12 (2), 154-164 (2012).
- Lim, Y. W., et al. Clinical insights from metagenomic analysis of sputum samples from patients with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 52 (2), 425-437 (2014).
- Claesson, M. J., et al. Comparison of two next-generation sequencing technologies for resolving highly complex microbiota composition using tandem variable 16S rRNA gene regions. Nucleic Acids Research. 38 (22), e200 (2010).
- Breitenstein, S., Tümmler, B., Römling, U. Pulsed field gel electrophoresis of bacterial DNA isolated directly from patients’ sputa. Nucleic Acids Research. 23 (4), 722-723 (1995).
- Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. Recombinant human DNase I reduces the viscosity of Cystic Fibrosis sputum. Proceedings of the National Academy of Sciences. 87 (23), 9188-9192 (1990).
- Lethem, M., James, S., Marriott, C., Burke, J. The origin of DNA associated with mucus glycoproteins in Cystic Fibrosis sputum. European Respiratory Journal. 3 (1), 19-23 (1990).
- Childs, W. C., Gibbons, R. J. Use of percoll density gradients for studying the attachment of bacteria to oral epithelial cells. Journal of Dental Research. 67 (5), 826-830 (1988).
- Lee, J. -. L., Levin, R. E. Use of ethidium bromide monoazide for quantification of viable and dead mixed bacterial flora from fish fillets by polymerase chain reaction. Journal of Microbiological Methods. 67 (3), 456-462 (2006).
- Breitenstein, S., Tümmler, B., Römling, U. Pulsed field gel electrophoresis of bacterial DNA isolated directly from patients’ sputa. Nucleic Acids Research. 23 (4), 722-723 (1995).
- Mokili, J. L., Rohwer, F., Dutilh, B. E. Metagenomics and future perspectives in virus discovery. Current Opinion in Virology. 2 (1), 63-77 (2012).
- Bibby, K. Improved bacteriophage genome data is necessary for integrating viral and bacterial ecology. Microbial Ecology. 67 (2), 242-244 (2014).
- Willner, D., et al. Metagenomic analysis of respiratory tract DNA viral communities in Cystic Fibrosis and non-Cystic Fibrosis individuals. PloS One. 4 (10), e7370 (2009).
- Willner, D., Furlan, M. Deciphering the role of phage in the cystic fibrosis airway. Virulence. 1 (4), 309-313 (2010).
- Willner, D., et al. Case studies of the spatial heterogeneity of DNA viruses in the cystic fibrosis lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46 (2), 127-131 (2012).
- Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics. mBio. 2 (2), e00012-e00011 (2011).
- He, S., et al. Metatranscriptomic array analysis of “Candidatus Accumulibacter phosphatis”-enriched enhanced biological phosphorus removal sludge. Environmental Microbiology. 12 (5), 1205-1217 (2010).
- Mokili, J. L., et al. Identification of a novel Human Papillomavirus by metagenomic analysis of samples from patients with febrile respiratory illness. PLOS ONE. 8 (3), e58404 (2013).
- Henig, N. R., Tonelli, M. R., Pier, M. V., Burns, J. L., Aitken, M. L. Sputum induction as a research tool for sampling the airways of subjects with Cystic Fibrosis. Thorax. 56 (4), 306-311 (2001).
- Rogers, G. B., et al. Use of 16S rRNA gene profiling by terminal restriction fragment length polymorphism analysis to compare bacterial communities in sputum and mouthwash samples from patients with Cystic Fibrosis. J. Clin. Microbiol. 44 (7), 2601-2604 (2006).
- Haas, A., et al. Unraveling the unseen players in the ocean – a field guide to water chemistry and marine microbiology. Journal of Visualized Experiments. In press, .
- Schmieder, R., Edwards, R. Quality control and preprocessing of metagenomic datasets. Bioinformatics. 27 (6), 863-864 (2011).
- Schmieder, R., Edwards, R. Fast identification and removal of sequence contamination from genomic and metagenomic datasets. PLOS ONE. 6 (3), e17288 (2011).
- Segata, N., et al. Metagenomic microbial community profiling using unique clade-specific marker genes. Nature Methods. 9 (8), 811-814 (2012).
- Meyer, F., et al. The metagenomics RAST server – a public resource for the automatic phylogenetic and functional analysis of metagenomes. BMC Bioinformatics. 9 (1), 386 (2008).
- Hara, N., et al. Prevention of virus-induced type 1 diabetes with antibiotic therapy. Journal of Immunology (Baltimore, Md.: 1950). 189 (8), 3805-3814 (2012).
- Markle, J. G. M., et al. Sex differences in the gut microbiome drive hormone-dependent regulation of autoimmunity. Science (New York, N.Y.). 339 (6123), 1084-1088 (2013).
- Ewing, B., Green, P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Research. 8 (3), 186-194 (1998).
- Ewing, B., Hillier, L., Wendl, M. C., Green, P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. I. Accuracy assessment. Genome Research. 8 (3), 175-185 (1998).
- Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics (Oxford, England). 27 (16), 2194-2200 (2011).
- Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).
- Pruesse, E., Peplies, J., Glöckner, F. O. SINA: accurate high-throughput multiple sequence alignment of ribosomal RNA genes. Bioinformatics (Oxford, England). 28 (14), 1823-1829 (2012).
- Robertson, C. E., et al. Explicet: graphical user interface software for metadata-driven management, analysis and visualization of microbiome data. Bioinformatics (Oxford, England). 29 (23), 3100-3101 (2013).
- Thurber, R. V., Haynes, M., Breitbart, M., Wegley, L., Rohwer, F. Laboratory procedures to generate viral metagenomes. Nat. Protocols. 4 (4), 470-483 (2009).
- Henn, M. R., et al. Analysis of high-throughput sequencing and annotation strategies for phage genomes. PLoS ONE. 5 (2), e9083 (2010).
- Duhaime, M. B., Deng, L., Poulos, B. T., Sullivan, M. B. Towards quantitative metagenomics of wild viruses and other ultra-low concentration DNA samples: a rigorous assessment and optimization of the linker amplification method. Environmental Microbiology. 14 (9), 2526-2537 (2012).
- Yilmaz, S., Allgaier, M., Hugenholtz, P. Multiple displacement amplification compromises quantitative analysis of metagenomes. Nat Meth. 7 (12), 943-944 (2010).
- Kim, K. -. H., Bae, J. -. W. Amplification methods bias metagenomic libraries of uncultured single-stranded and double-stranded DNA viruses. Applied and Environmental Microbiology. 77 (21), 7663-7668 (2011).
- Hurwitz, B. L., Deng, L., Poulos, B. T., Sullivan, M. B. Evaluation of methods to concentrate and purify ocean virus communities through comparative, replicated metagenomics. Environmental Microbiology. 15 (5), 1428-1440 (2013).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology. 215, 403-410 (1990).
- Angly, F., et al. PHACCS, an online tool for estimating the structure and diversity of uncultured viral communities using metagenomic information. BMC Bioinformatics. 6 (1), 41 (2005).
- Angly, F. E., et al. The GAAS Metagenomic Tool and Its Estimations of Viral and Microbial Average Genome Size in Four Major Biomes. PLoS Comput Biol. 5 (12), (2009).
- Dutilh, B. E., et al. Reference-independent comparative metagenomics using cross-assembly: crAss. Bioinformatics (Oxford, England). 28 (24), 3225-3231 (2012).
- Fancello, L., Raoult, D., Desnues, C. Computational tools for viral metagenomics and their application in clinical research. Virology. 434 (2), 162-174 (2012).
- Allesen-Holm, M., et al. A characterization of DNA release in Pseudomonas aeruginosa cultures and biofilms. Molecular Microbiology. 59 (4), 1114-1128 (2006).
- Stewart, F. J., Ottesen, E. A., DeLong, E. F. Development and quantitative analyses of a universal rRNA-subtraction protocol for microbial metatranscriptomics. ISME J. 4 (7), 896-907 (2010).
- Frias-Lopez, J., et al. Microbial community gene expression in ocean surface waters. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (10), 3805-3810 (2008).
- Lim, Y. W., et al. Mechanistic model of Rothia mucilaginosa adaptation toward persistence in the CF lung, based on a genome reconstructed from metagenomic data. PLOS ONE. 8 (5), e64285 (2013).
