複雑な動物に関連したサンプルからのシーケンシングメタゲノムとMetatranscriptomes：不純を精製する

注：誘発喀痰サンプルは、サンディエゴ校（UCSD、カリフォルニア大学の研究コーディネータにより、カリフォルニア大学施設内倫理委員会（HRPP 081500）とサンディエゴ州立大学治験審査委員会（SDSU IRBの＃2121）に応じて、収集した）大人のCFクリニック。 1.サンプルの収集と前処理（収集後30分以内に前処理サンプル） 前にサンプリングするコレクション、ラベル4 15ミリリットルのチューブとしては、（i）は、ウイルスメタゲノム、（II）微生物メタゲノム、（III）metatranscriptome、及び（iv）余分な痰。各サンプルについて、この手順を繰り返します。グアニジンイソチオシアネートベースのRNA溶解バッファー（GITC、溶解緩衝液）を6mlの後に "Metatranscriptome」とラベルチューブへの0.1mmのシリカビーズを2 mlを加える。 サンプル収集中に、口腔の微生物による汚染を最小限にする口内洗浄剤として、無菌生理食塩水（60 ml）を使用。 30分後の期間にわたり唾液サンプルを収集噴霧器を経由して7％高張食塩水の4ミリリットルの吸入。直ちにプロセスサンプル、下記のように。 8ミリリットルの全体積に試料を希釈する。 前とサンプル採取後空痰カップを秤量することによって試料容量を推定する。 試料の体積が8未満mlである場合、少なくとも8 mLの総サンプル体積を生成するために0.02μmの濾過された1×PBSを適量加える。 目に見える塊が痰内なくなるまですぐに3ミリリットルシリンジでサンプルを均質化する同じ注射器を用いて、痰の2ミリリットルを策定し、1.4すぐにステップ進んでください。 喀痰試料からの全RNAの保存シリカビーズとGITC-溶解バッファーを含む「metatranscriptome "チューブにステップ1.3.4から2ミリリットル痰サンプルを注入します。 蓋を閉め、漏れを避けるために、パラフィルムでしっかりとチューブをシール。 10マイルのために中程度の速度ですぐに痰を均質化するN。利用可能なボルテックスによっては、水平にチューブを配置し、必要に応じてテープで固定します。 必要に応じて研究室にアイスボックスと輸送、4℃で、またはチューブを保管してください。 「ウイルスメタゲノム」と「微生物メタゲノム」というラベルのチューブに同じ注射器、痰のアリコート2ミリリットルそれぞれの使い方と「余分な痰」とラベルチューブに痰カップから残りの痰を転送する。 必要に応じて研究室に4℃またはアイスボックス及び輸送でのすべてのチューブを保管してください。 2.生成ウイルスメタゲノム緩衝液および溶液の調製 4℃で事前に店舗に50 mMのジチオスレイトール（DTT）を準備します。これは2週間安定である。 生理食塩水マグネシウム（SM）バッファー（250ml）で準備：1 MのNaCl、10mMのMgSO 4を、50mMのトリス-HCl、 pHを7.4に調整します。室温でフィルター滅菌し（0.02μmの孔サイズ）とストア。 </li> 私はドルナーゼユニット/ mgの乾燥重量で定義されたアクティビティに応じて凍結乾燥したウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼから（分子グレードの水で）私は100 U /μlに酵素DNアーゼを準備します。 準備I緩衝液10倍のDNase（50ml）を100のMgCl 2、20mMのCaCl 2を 。 pHを6.5に調整します。室温でフィルター滅菌し（0.02μmの孔サイズ）とストア。 4％パラホルムアルデヒドを準備します。 200X TEバッファーを準備します：2 Mトリス塩酸（pHは8.5）、0.2 M EDTA。室温でフィルター滅菌し（0.02μmの孔サイズ）とストア。 分子グレードの水を使用して10％のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の10ミリリットルを準備します。 50ミリリットルCTAB / NaClを用意する（10％CTABを700 mMのNaCl）を分子グレードの水を使用する。一晩CTABを溶解する。沈殿物が解決しない場合は、65℃で溶液を加熱。溶液を室温で高粘性である。 NOTE：0.02μmのフィルターを用いて緩衝液の濾過は溶液中のウイルス様粒子の除去を可能にするが、しない無料の核酸汚染。 サンプル前処理新鮮な6.5 mMのジチオスレイトール（DTT）の適切な量を準備します。 6ミリリットルの全体積を生成するために、0.02μmのろ過SM緩衝液を添加することによってホモジネートを希釈する。 試料に6.5 mMのジチオスレイトール（DTT）の等量（6 ml）を追加し、粘液の溶解を助けるために、渦を激しく混合し、37℃で1時間インキュベートする。 10℃、15〜20分間3056×gで精力的に処理された試料をボルテックスし、スピン。 新しい15ミリリットルチューブに上清を収集します。 次のサンプルについて、ステップ2.2.3と2.2.5を繰り返します。 転送と新しい15ミリリットルチューブに注射器に取り付けられた0.45μmのフィルターで上清をフィルタリングする。 注：フィルタの目詰まりは、注射器からのサンプルを取得し、ろ過工程を省略した場合。 （SEを参照してくださいクロロホルムおよびDNase I処理を行い、0.45μmのろ過した試料100μlのサブサンプルを取る2.3.12-2.3.15 ction）とエピ蛍光顕微鏡（ 図2A）のサンプルを修正するために4％パラホルムアルデヒドの等しいボリュームを追加。 「キャッチオール」のウイルス粒子の濃縮アプローチについて（説明を参照）、塩化セシウム勾配超遠心分離に基づいて、ウイルス粒子の選択を省略することが2.3.12に進みます。しかし、これは、ウイルス溶解物中のクロロホルム耐性細菌汚染および宿主DNAのより高い量をもたらし得る。 ウイルス様粒子（VLP）の濃縮および精製所望の密度を非濾過SM緩衝液でのCsClの適切な量を溶解することにより、個々の塩化セシウム（CsClの）溶液を調製する（1.7グラム/ mlのは1.5g / mlで、1.35グラム/ mlで、1.2グラム/ミリリットル）。使用前に0.02μmのフィルターを通した各ソリューションをフィルタリングします。 図2Bに示すように、CsCl勾配を設定する。 負荷各チューブに1.7グラム/ mlの1mlを、各チューブには1.5g / mlで負荷1mlの1.35グラムの荷重を1ミリリットル/ mlの各チューブに、各チューブに負荷1.2グラム/ mlの（オプション）、そして最終的にそれぞれのチューブに6〜8ミリリットルサンプルをロードします。マークの個々の層は、各画分の位置を示すために。 1mgの範囲内に管のそれぞれの対向ペアをバランス。 慎重にスピンバケツに各チューブをロードします。彼らは空であっても、すべてのバケットをスピン。ローター上にスピンバケットをロードします。 2時間4℃で82844×gで遠心し。 遠心分離後、慎重に密度勾配を中断することなく、ホルダーからチューブを外します。 18 G針で3ミリリットル注射器を使用して、ちょうど1.5グラム/ mlの密度層（ 図2、赤い矢印）の下にチューブを貫通し、シリンジ内に〜1.5ミリリットルを引っ張る。 ゆっくりと針を取り外し、チューブ内の残りの部分は、穿刺を通じて新しい15ミリリットルチューブに滴下できるようにすることで、上部の一部を収集します。 「上分数廃棄物」として、このラベルを付けます。 が1.5g / mlのfractio集めるnは2の新しいマイクロチューブに内容を吐出することにより、注射器から（VLPを含む）。 すべてのサンプルを繰り返しステップ2.3.8-2.3.10。 ウイルスの濃縮液にクロロホルム0.2ボリュームを追加し、激しく振り、室温で10分間インキュベート、5分間最大速度でスピンし、水相を収集します。 クロロホルム処理したウイルスの濃縮液に10倍のDNaseバッファーおよびDNase I（最終濃度= 2.5 U /μl）を追加し、1.5〜2時間、37℃でインキュベートする。 15分間65℃でのDNase活性を不活性化する。 新しいチューブにクロロホルム – およびDNアーゼIで処理したウイルス画分の15μlのを削除し、エピ蛍光顕微鏡検査用のサンプルを修正するために15μlの4％パラホルムアルデヒドを追加します。 DNA抽出プールウイルスを洗浄し、50mlのオークリッジ高速遠心管をオートクレーブ処理し、各試料から濃縮する。 以下を追加します。0.1ボリューム200X TEバッファー、Sの1mlあたり10μlの0.5 M EDTAをホルムアミドの十分な、1ボリューム、および10μlのグリコーゲン。よく混ぜ、30分間室温でインキュベート。 新しいボリュームを使用して、室温100％エタノールの2ボリュームを追加。よく混合し、少なくとも30分間、4℃でインキュベートする。 SS-34ローターを用いて4℃で20分間17226×gでチューブをスピンすることによってペレットDNA。 血清学的ピペットを使用して慎重に上清を捨てる。氷冷70％エタノールでペレットを2回洗浄する。 できるだけ多くの液体を除去し、15分間室温で空気乾燥にペレットを許す。 1×TE緩衝液（pH 8.0）を567μlの中にDNAペレットを再懸濁する。 注：室温での完全な再懸濁のために少なくとも15分を許可します。さらに処理するまで4℃で一晩再懸濁したDNAを保管してください。 新しい1.5mlマイクロチューブに再懸濁DNA溶液の全体567μLを転送します。 20 _（予め温め、10％SDSおよびプロテイナーゼKの3μlの30μlのを追加します。6; G / ml）を、完全に混合し、56℃で1時間インキュベートする。 65℃でのCTAB / NaClの事前暖かい。 5 M NaClを100μl添加し、十分に混合します。 、予め温めCTAB / NaCl溶液80μlを加え、ボルテックスし、65℃で10分間インキュベートする。 、等量のクロロホルムを添加し、混合するためにボルテックスし、5分間、16,100×gでスピン。 新しい1.5mlマイクロチューブに上清を移し。 、等量のフェノール/クロロホルムを添加し、混合するためにボルテックスし、5分間、16,100×gでスピン。 新しい1.5mlマイクロチューブに上清を移し。 、等量のクロロホルムを添加し、混合するためにボルテックスし、5分間、16,100×gでスピン。 新しい1.5mlマイクロチューブに上清を移し。上清画分に等量のイソプロパノールを添加し、混合し、少なくとも30分間、-20℃でインキュベートする。 DNA、4℃で15分間16,100×gでスピンをペレット化。注意深く上清をピペットで氷冷70％エタノールで2回ペレットを洗浄する。 </lI> 短いスピンを行い、チューブから残りのエタノールを除去。空気は、15分間、ペレットを乾燥させる。 溶出緩衝液50μl（5 mMトリス、pHが8.5）を用いてDNAペレットを再懸濁する。ペレットは、室温で少なくとも5分間再水和することを許可する。 高感度の蛍光に基づくアッセイを用いてDNAを定量する。 ファージPhi29ポリメラーゼを用いて増幅（オプション） 80 mMトリス-塩酸（pH8.0）、20のMgCl 2：2倍アニーリング緩衝液を準備します。 5 U /μlにファージPhi29 DNAポリメラーゼを希釈する。 50μlのランダムヘキサマープライマー（100μM）、125μlの2×アニーリング緩衝液、および25μlの水からなるプレミックスサンプルバッファー、。 -20℃で小分けし、保存。 プレミックスの反応100μlのファージPhi29 10倍バッファで構成バッファー、40μlの10のdNTP、および560μlの水。 -20℃で小分けし、保存。 4μlのサンプル·バッファに1μlのテンプレートDNAを追加します。 目をインキュベート電子を3分間95℃で混合し、氷上で冷却する。 、2.4.4から混合物に反応バッファーの14μl加えピペッティングにより混合します。 、ファージPhi29 DNAポリメラーゼの1μlを添加して、上下にピペッティングして混合し、10分間65℃、続いて18時間30℃でインキュベートする。 ゲノムDNAの列またはフェノール/クロロホルムとエタノール沈殿を使用して反応をクリーンアップします。 エピ蛍光顕微鏡（ハースらを参照してください。2014年28ろ過システムのセットアップのために） 注：単離および精製の ​​後、核酸色素と落射蛍光顕微鏡の試料中のウイルス粒子の存在および純度（ 図2Aおよび2C）を確認するために使用することができる。試料中の遊離DNAの高いバックグラウンド蛍光を生じさせることができる。したがって、サンプルはDNアーゼ顕微鏡写真のための固定および染色の前に、私は、扱われるべきである。 マウント溶液を調製（0.1％のアスコルビン酸、50％グリセロール）。 1Xリン酸緩衝生理食塩水（PBS）の4.9ミリリットルに10％のアスコルビン酸の100μl加え、完全に混合。 、混合物に100％のグリセロールの5ミリリットルを追加し完全に混合し、「マウント」としてチューブにラベルを付ける。 フィルタは、-20℃で0.02μmのアルミナマトリックス使い捨てシリンジフィルター、マイクロチューブにアリコートし、ストアを使用してマウントします。 新しいマイクロチューブに小分けしたサンプルを100μlとVLPを修正するために4％パラホルムアルデヒドの等しいボリュームを追加。少なくとも10分間室温で混合物をインキュベートする。 0.02μmのろ過水800μlのを追加することによって、1ミリリットルのボリュームを構成する。チューブにSYBRゴールドステインの1μLを加え、10分間室温でインキュベートする。 -9および-10 PSI（-62.1及び-68.9キロパスカル）の間に真空ポンプをオンにしてろ過システムをセットアップします。 水で台座を洗浄し、フィルター台座に環状のポリプロピレン支持リングと0.02μmのアルミナマトリックスフィルタを配置。 フィルターとフィルター台座の上にフィルタタワーを配置し、クランプで固定します。 フィルター塔に1.5mlマイクロチューブからコンテンツをピペット、およびを通じてフィルタリングするためのサンプルのために数分を許可する。 ラベルとピペット、顕微鏡スライドにマウント試薬10μlの。 フィルター塔とクランプを除去しながら上の真空のままにしておきます。 慎重にフィルター台座からフィルターを削除し、キムワイプでフィルターの底にブロット、その後、顕微鏡スライド上にマウントの上に直接フィルタを置く。 フィルター上にマウント試薬の別の10μlのピペットフィルター上カバースリップを置く。 3.生成微生物メタゲノム緩衝液および溶液の調製 1XのDNase緩衝液50mlを準備します50 mMののNaAc、10のMgCl 2、2のCaCl 2; pHを6.5に調整します。フィルター滅菌し（0.22μmの）と店舗室温で。 私はドルナーゼユニット/ mgの乾燥重量で定義されたアクティビティに応じて凍結乾燥したウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼから（分子グレードの水で）私は1000年U /μlに酵素DNアーゼを準備します。 SEバッファーの100ミリリットルの準備：75のNaCl、25mMのEDTAを。 pHを7.5に調整します。室温でフィルター滅菌し（0.22μmの）と店舗。 DNA抽出の前に、サンプルの前処理 0.22μmのフィルター1×PBSの5ボリュームを追加することによりホモジネートを希釈する。例えば、試料の2ミリリットルに1×PBSの10ミリリットルを追加します。 2％（v / v）の最終濃度になるようにβメルカプトエタノールを加える。 2時間室温で（化学フード内）混合物を揺する。 10°Cと15分間3056×gでサンプルをスピンし、上清を捨てる。 分子グレードの水10ml（または0.22μmの濾過水）中でペレットを再懸濁し、15分間室温でインキュベートする。 繰り返しますが、一度3.2.3と3.2.4を繰り返します。 SPI10℃でN、15分間3056×gで、上清を捨てる。 5ミリリットル1XのDNaseバッファーにペレットを再懸濁し、試料1ml当たり15μlのDNアーゼI（1,000 U /μl）を追加します。 繰り返し2時間混合しながら37℃でインキュベートする。 15分間65℃でのDNase活性を不活性化する。 10°Cと15分間3056×gでスピンし、上清を捨てる。 10ミリリットルSEバッファにペレットを再懸濁。 手順を繰り返し3.2.10。 10°Cと15分間3056×gでスピンし、上清を捨てる。 2ミリリットルSEバッファにペレットを再懸濁し、そして2マイクロチューブに移す。 マイクロチューブに細胞をペレット。 15分間室温で16,100×gでチューブをスピン。 上清を除去し、ゲノムDNA抽出キットを用いてペレット化した細胞からDNAを抽出し、グラム陽性変動プロトコル。 4.生成Metatranscriptome サンプル前- 処​​理すぐにサンプル収集及び均質化した後にGITC-溶解緩衝液中のビーズビーティングによる細胞の機械的な溶解を実行します。ステップ1.4を参照してください。 シリカビーズをペレット化し、4℃で混合し、5分間600×gでスピン。 新しいチューブに上清を移し。 、使用GITC-溶解バッファーのすべての750μlのクロロホルム200μlを追加し15秒間手で激しく振る、10分間室温でインキュベートし、4℃でスピンし、15分間3056×gで。この15分間のスピンの間に、ステップ4.2の準備。 15分スピン（水相-中間相 – 有機相形の明確な分離）した後、新しいRNaseフリーチューブ（S）に変換（相間を中断せずに）水相を抽出。 注：水相は、RNAが含まれています。次のステップまで氷上にチューブを保管してください。 市販のカラムベースのRNA精製キットまたはの都合のを使用して全RNA抽出および精製を行ってntionalイソプロパノールベースの​​RNA沈殿。 シリカカラムベースのRNA精製得られた水性画分の総体積を測定する。 サンプリングし、よく混合するために、RNA結合バッファーの適切なボリュームを追加します。 製造業者のプロトコルに従って、結合条件を適切な混合物を調整します。よく混ぜ、ショートスピンを行う。 RNA-カラムに混合物をロードします。大容量のサンプルについては、複数のロードを使用し、4倍までの各列をロードします。そうでない場合は、各サンプルについて、複数のカラムを使用することを検討。 製造業者のプロトコルに従って適切にカラムを洗浄。 RNaseフリー水の少なくとも30μlのRNAを溶出。ダブル溶出はわずかRNAの収量を増加させる。しかし、これは、RNAの濃度を希釈するであろう。 RNA濃度を測定し、DNアーゼI処理に直接進む。 RNAの品質をチェックするバイオアナライザを使用します（推奨）。 </oL> RNA降水等量のイソプロパノールを追加します（ 例えば 、水性画分を500μlに500μlのイソプロパノール）と試料には10μg/μlのRNaseフリーグリコーゲン2μlの。 10分間室温で混合物をインキュベートする。 15分間12000×gで4℃でスピン。 慎重に、上清を除去し、RNaseフリーの75％エタノールの1ミリリットルを追加します。ペレットが完全であることを確認するために5分間7500×gで4℃で混合物をスピン。 慎重にエタノールを除去。 繰り返しますが、一度4.2.2.4と4.2.2.5を繰り返します。 空気は、10分間、ペレットを乾燥させる。 5分間55℃でインキュベートし、DNase処理に直接進む、RNaseフリー水50μlにペレットを再水和。 RNAの品質をチェックするバイオアナライザを使用します（推奨）。 -20℃、または長期保存のために-80℃でアリコートに保管してRNA。 </oL>