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Biology

Purificare l'Impure: sequenziamento metagenomi e Metatranscriptomes da campioni complessi animali associate

Published: December 22, 2014
doi:
10.3791/52117
, , , , ,
1Department of Biology,San Diego State University, 2DOE Joint Genome Institute, 3Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology,University of Colorado, 4Department of Pediatrics, School of Medicine,University of Colorado

Summary

Utilizzando fibrosi cistica vie respiratorie come esempio, il manoscritto presenta un flusso di lavoro comprendente una combinazione di approcci metagenomiche e metatranscriptomic per caratterizzare la comunità microbiche e virali in campioni animali-associata.

Abstract

L'accessibilità di high-throughput sequencing ha rivoluzionato molti campi della biologia. Per comprendere meglio le comunità virali e microbiche ospite-associato, un flusso di lavoro completo per l'estrazione di DNA e RNA è stato sviluppato. Il flusso di lavoro genera contemporaneamente metagenomi virali e microbiche, nonché metatranscriptomes, da un singolo campione per sequenziamento di prossima generazione. L'accoppiamento di questi approcci fornisce una panoramica sia delle caratteristiche tassonomiche e le funzioni della community codificato. I metodi presentati usano fibrosi cistica (CF) espettorato, un tipo di campione problematica, poiché è estremamente viscoso e contiene elevata quantità di mucine, DNA neutrofili libera, e altri contaminanti sconosciuti. I protocolli descritti qui di mira questi problemi e con successo il recupero del DNA virale e microbico alla contaminazione minima DNA umano. Per completare gli studi metagenomica, un protocollo metatranscriptomics è stato ottimizzato per recuperare sia microbicae mRNA host che contiene relativamente pochi RNA ribosomiale (rRNA) sequenze. Una panoramica delle caratteristiche dei dati viene presentato per servire come riferimento per valutare il successo dei metodi. Altri campioni di espettorato CF sono stati raccolti per (i) valutare la consistenza dei profili microbioma in sette giorni consecutivi in ​​un solo paziente, e (ii) confrontare la coerenza di approccio metagenomica per un sequenziamento basato sui geni 16S RNA ribosomiale. I risultati hanno mostrato che la fluttuazione giornaliera dei profili microbici senza perturbazione antibiotico era minimo ei profili di tassonomia dei comuni batteri CF-associate sono stati molto simili tra le librerie 16S rDNA e metagenomi generati dalla lisi ipotonica (HL) DNA -derived. Tuttavia, le differenze tra i profili tassonomiche 16S rDNA generati dal DNA totale e HL-DNA derivato suggeriscono che lisi ipotonica e le fasi di lavaggio vantaggio non solo rimuovere il DNA di derivazione umana, ma anche extracellul microbica-derivatiDNA ar che possono travisare i profili microbici effettivi.

Introduction

Comunità virali e microbiche associate con il corpo umano sono stati studiati estesamente negli ultimi dieci anni attraverso l'applicazione di tecnologie di sequenziamento 1,2. I risultati hanno portato al riconoscimento dei microbi importanza nella salute umana e la malattia. L'importante iniziativa è venuto dal progetto umano microbioma che descrive i batteri (e alcuni archeobatteri) residenti sulla pelle umana, e all'interno di cavità orale, vie respiratorie, del tratto urogenitale e gastrointestinale 3. Ulteriori studi microbioma di sane vie aeree umani attraverso lavaggio broncoalveolare (BAL) di 4,5 e tamponi nasofaringei 4 hanno dimostrato che il polmone può servire come strumento di campionamento ambientale, i risultati di colonizzazione microbica transitoria nelle vie aeree. Tuttavia, l'impatto della colonizzazione microbica in superfici delle vie aeree con problemi può portare a infezioni polmonari gravi e croniche, come quelli visti in fibrosi cistica (CF) pazienti.

t "> CF è una malattia genetica letale causata dalla mutazione in transmembrana della fibrosi cistica regolatore (CFTR) gene 6. Queste mutazioni generano proteine ​​CFTR difettosa che a loro volta influenzano il trasporto di ioni transepiteliale attraverso la superficie apicale dell'epitelio. La malattia colpisce molteplici sistemi di organi, ma la maggior parte di mortalità e morbilità è imputabile a malattie polmonare FC 7. Il polmone CF fornisce un ecosistema unico per la colonizzazione microbica. Il difetto di trasporto di ioni provoca muco per costruire nelle vie aeree CF, creando microambienti, comprensivi di aerobica , microaerofili e scomparti anaerobici ancorati da una superficie mucosa ricca di nutrienti statico. Questo ambiente facilita la colonizzazione e la proliferazione di microbi, tra cui virali, batteri e funghi. acuta e le infezioni microbiche polmonari croniche portano a risposte immunitarie costanti ma inefficaci, con conseguente ampio rimodellamento delle vie aeree, perdita di capacità polmonare, e in ultima analisi pulmofallimento nario.

Comunità batteriche associate al polmone CF sono stati ben descritti utilizzando approcci cultura-dipendenti e cultura indipendente, che includono uso 16S RNA ribosomiale (rRNA) gene sequenziamento 8 e metagenomica fucile 9,10. L'approccio basato rRNA 16S è in grado di caratterizzare una vasta gamma di specie microbiche e catturare ampi cambiamenti nella diversità delle comunità. Tuttavia, è limitata nella sua risoluzione nella definizione comunità (riassunte Claesson et al. 2010 11) e le previsioni di potenziali metaboliche sono limitati a tali funzioni generali noti per il taxa identificati. Pertanto, 16S rRNA metodi di sequenziamento del gene sono insufficienti per il necessario tassonomica e funzionale la precisione analitica delle diverse comunità microbiche presenti nei polmoni CF. L'approccio metagenomica descritto qui completa l'approccio basato rRNA 16S, supera i suoi limiti, e consente un modo relativamente efficaceper analizzare sia la tassonomia comunità microbica e contenuto genetiche nei polmoni CF.

DNA microbica isolato da campioni animale associato spesso contiene una grande quantità di DNA ospite. Campioni di espettorato o tessuto polmonare CF solito contengono una grande quantità di DNA umano rilasciata dai neutrofili nella risposta immunitaria, spesso superiore al 99% del DNA totale 12 – 14. Sebbene alcune cellule umane intatti possono essere presenti, la maggior parte di questo DNA è libero in soluzione o adsorbiti sulla superficie dei microbi. Inoltre, la presenza di tappi particolarmente viscosi muco, detriti cellulari e altri contaminanti sconosciuti complicare ulteriormente isolamento delle cellule microbiche. Diversi metodi sono stati testati per deplezione questi campioni di DNA umano, compresi Percoll a gradienti umana separata da cellule microbiche 15, il trattamento con DNasi I, bromuro di etidio monoazide a degradare selettivamente DNA umano 16, e il kit MolYsis, tutti con successo limitato. Ad oggi la procedura di purificazione del DNA microbico più efficace per CF espettorato è una modificazione del processo descritto da Breitenstein et al. (1995) 17. Questo approccio, noto come metodo qui ipotonica lisi (HL), utilizza una combinazione di β-mercaptoetanolo per ridurre mucina legami disolfuro, lisi ipotonica delle cellule eucariotiche e trattamento DNasi I di DNA solubile 9. Nonostante la mancanza di alternative al metodo HL ha sollevato alcune preoccupazioni a causa di (i) eventuali pregiudizi derivanti dalla lisi indesiderato di microbi e (ii) se le fluttuazioni osservate nella composizione della comunità 9,10 sono un artefatto di variazioni associate con l'elaborazione del campione. Oltre alla generazione di metagenomi fucile, abbiamo affrontare questi problemi confrontando i profili del gene 16S rRNA del DNA totale e DNA microbico estratto dal metodo HL utilizzando la stessa serie di campioni di espettorato raccolti da un singolo paziente in sette giorni consecutivi.

ent "> Rispetto alla comunità microbiche, la caratterizzazione delle comunità virali associati con gli animali è limitato 18,19 Le comunità virali CF vie aeree sono state caratterizzate solo in minima parte 20 -.. 22 Il primo studio metagenomica caratterizza il DNA delle comunità virali in CF vie respiratorie hanno dimostrato che la maggior parte dei virus associati polmoni CF sono fagi 20. Il potenziale metabolico del fago in CF e individui non-CF è stata significativamente diversa. In particolare, le comunità dei fagi in individui CF effettuate geni riflettente di adattamenti ospitanti batteriche alla fisiologia del CF vie aeree, e batterici di virulenza. 20 studi metagenomiche successivi di virus nel tessuto polmonare CF dimostrato distinto eterogeneità spaziale delle comunità virali tra le regioni anatomiche 22. Inoltre, il tessuto polmonare CF ospitava la diversità virale più basse fino ad oggi in qualsiasi ecosistema 22. La maggior parte dei virus identificati erano fagicon la possibilità di infettare i patogeni CF. Tuttavia, sono state rilevate anche virus eucariotiche quali herpesvirus, adenovirus e virus del papilloma umano (HPV). In un caso in cui sono stati osservati cisti nel tessuto polmonare durante la dissezione, più del 99% di un genoma papillomavirus umano è stato recuperato, anche se il paziente non è mai stato diagnosticato un papilloma polmonare o carcinoma. Ciò indica che la diversità virale presente non solo riflette la gravità del danno tissutale, ma può anche esporre e spiegare una malattia non caratterizzato sottostante. I protocolli descritti forniscono un modo semplice, ma potente per isolare particelle virali (VLPs) da campioni che consistono di grandi quantità di muco denso, di accoglienza e di cellule microbiche, DNA libero, così come detriti cellulari.

A complemento metagenomica, metatranscriptomics viene utilizzato per monitorare le dinamiche di espressione genica in tutta la comunità microbica e l'host 9,23. In questo caso, sia microbica e host mRNA devono essere preferenzialmente selezionato. Poiché mRNA batteriche non sono poliadenilato, un metodo di pull-down mRNA basato oligo-dT non può essere sfruttata. Poliadenilazione dipendente RNA amplificazione non può essere utilizzato in campioni ospitanti associata se sono noti i campioni contengono grandi quantità di mRNA eucariotico. Molti campioni animali-associata, compresi CF espettorato, contengono un'alta densità di cellule oltre a elevate quantità di detriti cellulari e nucleasi che includono RNasi. Pertanto, un altro compito impegnativo è quello di evitare una eccessiva degradazione dell'RNA durante metatranscriptome lavorazione. Nella maggior parte dei casi, l'RNA totale estratto da espettorato CF è parzialmente degradata, limitando le applicazioni a valle e l'utilità del RNA derivato. Negli ultimi anni, numerosi approcci per rRNA deplezione sono stati sviluppati e adattati in kit disponibili in commercio. L'efficacia di questi approcci è tuttavia limitata, soprattutto quando si lavora con parzialmente degradato rRNA 9,24. I metodi impiegati qui consentonoed per il recupero di RNA totale parziale degrado adatto per la rimozione efficiente rRNA totale valle. Confronto diretto della efficienza nella rimozione rRNA parzialmente degradata da RNA totale confrontando due diversi kit è stato illustrato da Lim et al. (2012) 9.

In generale, lo scopo di questo manoscritto è quello di fornire un set completo di protocolli (figura 1) per generare metagenomi fucile virali e microbiche, e un metatranscriptome, da un singolo campione animale-associata, utilizzando campione di espettorato indotto come esempio. Flusso di lavoro di laboratorio molecolare dovrebbe includere zone pre e post-amplificazione separati per ridurre al minimo la contaminazione incrociata. I metodi sono facilmente adattabili ad altri tipi di campioni come il tessuto 22, nasofaringeo e orofaringei 25, lavaggio broncoalveolare (BAL) e corallo (dati non pubblicati). Ogni campione deve essere trattato immediatamente al momento della raccolta soprattutto quando metagenomica microbica e ha incontratoatranscriptomics studi sono desiderati. Se sono stati congelati i campioni, limita l'isolamento di cellule microbiche intatte per metagenomi microbici come il congelamento potenzialmente compromettere l'integrità delle cellule. Tuttavia, il congelamento non esclude metatranscriptomics e isolamento virale, ma la qualità di RNA e la quantità di particelle virali recuperati possono essere influenzati attraverso il processo di congelamento-scongelamento. È importante notare che espettorato indotto è servito come fonte primaria di campioni in molti studi associati pazienti CF adulti e altre malattie polmonari croniche come 26,27 BAL può essere troppo invasivo. Nei nostri studi, campioni di espettorato sono stati raccolti con un metodo di campionamento attenta e coerente, cioè, dopo collutorio e risciacquo della cavità orale con soluzione salina sterile per mantenere la contaminazione microbi orali nei campioni di espettorato al minimo.

Protocol

NOTA: Induced campioni di espettorato sono stati raccolti in conformità con l'Università della California Institutional Review Board (HRPP 081.500) e San Diego State University Institutional Review Board (IRB SDSU # 2121), dal coordinatore di ricerca della University of California, San Diego (UCSD ) clinica CF per adulti. 1. Raccolta e pre-trattamento (campioni pre-trattare entro 30 min dopo Collection) Prima raccolta a campione, etichetta quattro 15 ml provette come: (i) metagenoma virale, (ii) metagenoma microbica, (iii) metatranscriptome, e (iv) espettorato supplementare. Ripetere l'operazione per ogni campione. Aggiungere 2 ml di 0,1 mm perle di silice nella provetta con l'etichetta "Metatranscriptome", seguito da 6 ml di base-isotiocianato guanidina tampone di RNA di lisi (tampone GITC-lisi). Durante la raccolta del campione, utilizzare soluzione fisiologica sterile (60 ml) come un risciacquo bocca per minimizzare la contaminazione da microbi orali. Raccogliere campioni di espettorato in un periodo di tempo di 30 minuti dopo ilinalazione di 4 ml di 7% soluzione salina ipertonica tramite un nebulizzatore. Campioni di processo immediatamente, come descritto di seguito. Diluire il campione ad un volume totale di 8 ml. Stimare volume del campione da pesare tazza espettorato vuota prima e dopo la raccolta del campione. Se il volume del campione è inferiore a 8 ml, aggiungere quantità appropriata di 0,02 micron filtrata 1x PBS per generare un volume totale campione di almeno 8 ml. Omogenizzare immediatamente il campione con una siringa da 3 ml fino a quando non grumi visibili restano di espettorato Usando la stessa siringa, elaborare 2 ml di espettorato e procedere immediatamente al punto 1.4. Preservare RNA totale da dell'espettorato campione Iniettare 2 ml campione di espettorato dal punto 1.3.4 nel tubo "metatranscriptome" contenente microsfere di silice e di buffer GITC-lisi. Chiudere il coperchio e sigillare il tubo in modo sicuro con Parafilm per evitare perdite. Omogeneizzare il espettorato immediatamente a velocità media per 10 kmn. A seconda della disposizione vortex, posizionare il tubo orizzontalmente e fissare con nastro se necessario. Mantenere il tubo a 4 ° C o in un contenitore di ghiaccio e il trasporto al laboratorio se necessario. Usando la stessa siringa, un'aliquota 2 ml di espettorato ciascuno nelle provette etichettate "metagenoma virale" e "metagenoma microbica" e trasferire il espettorato rimanente dalla coppa sputo nella provetta con l'etichetta "espettorato extra". Conservare tutte le provette a 4 ° C o contenitore di ghiaccio e il trasporto al laboratorio, se necessario. 2. Generazione Viral metagenoma Preparazione di buffer e soluzioni Preparare 50 ditiotreitolo mm (DTT) in anticipo e conservare a 4 ° C. Questo è stabile per 2 settimane. Preparare Saline Magnesio (SM) tampone (250 ml): 1 M NaCl, 10 mM MgSO 4, 50 mM Tris-HCl; regolare il pH a 7,4. Sterilizzare Filter (0,02 micron dimensione dei pori) e conservare a temperatura ambiente. </li> Preparare DNasi enzima di 100 U / ml (in acqua grado molecolare) di liofilizzato bovina pancreas DNasi I secondo l'attività definita per unità Dornase / mg di peso a secco. Preparare 10x DNase I Buffer (50 ml): 100 mm MgCl 2, 20 mM CaCl 2; regolare il pH a 6,5. Sterilizzare Filter (0,02 micron dimensione dei pori) e conservare a temperatura ambiente. Preparare 4% paraformaldeide. Preparare 200x TE Buffer: 2 M Tris-HCl (pH 8.5), 0.2 M EDTA. Sterilizzare Filter (0,02 micron dimensione dei pori) e conservare a temperatura ambiente. Preparare 10 ml di 10% di sodio Dodecyl Sulfate (SDS) con acqua di grado molecolare. Preparare 50 ml CTAB / NaCl (10%. NaCl CTAB 700 mm) con acqua di grado molecolare. Sciogliere CTAB durante la notte. Se persistono precipitati, riscaldare la soluzione a 65 ° C. Soluzione è altamente viscoso nella temperatura ambiente. NOTA: La filtrazione di buffer utilizzando 0,02 micron filtro consente la rimozione di particelle virali simili all'interno della soluzione, ma noncontaminazione acido nucleico gratuito. Pre-trattamento del campione Preparare quantità appropriata di ditiotreitolo fresco mM 6.5 (DTT). Diluire il omogenato aggiungendo tampone SM 0,02 micron filtrato per generare un volume totale di 6 ml. Per facilitare muco dissoluzione, aggiungere volume uguale (6 ml) di 6,5 mM ditiotreitolo (DTT) per il campione, vortice vigorosamente per miscelare e incubare per 1 ora a 37 ° C. Vortex il campione trattato con forza e rotazione a 10 ° C, 3.056 xg per 15-20 minuti. Raccogliere il supernatante in un nuovo tubo 15 ml. Ripetere il passaggio 2.2.3 e 2.2.5 per il campione successivo. Trasferimento e filtrare il surnatante con un filtro da 0,45 micron montato su una siringa in un nuovo tubo 15 ml. NOTA: Se il filtro si intasa, recuperano i campioni della siringa e omettono la fase di filtrazione. Prendete un sottocampione 100 ml del campione micron filtrata 0.45, eseguire il cloroformio e il trattamento DNasi I (vedi section 2.3.12-2.3.15) e aggiungere uguale volume di 4% paraformaldeide per fissare il campione per epifluorescenza (Figura 2A). Per un particelle virali approccio arricchimento "catch-all" (vedi la discussione), passare al punto 2.3.12 di omettere selezione particelle virali sulla base di cesio gradiente di cloruro ultracentrifugazione. Tuttavia, ciò può provocare la contaminazione batterica cloroformio-resistenti e superiori quantità di host-DNA nel lisato virale. Particelle virali simili (VLP) Purificazione Preparare soluzioni individuale cloruro di cesio (CsCl) sciogliendo la giusta quantità di CsCl con tampone non filtrata SM alla densità desiderata (1,7 g / ml, 1,5 g / ml, 1,35 g / ml e 1,2 g / ml). Filtrare ogni soluzione attraverso un filtro di 0,02 micron prima dell'uso. Impostare CsCl gradiente come mostrato nella Figura 2B. Carico 1 ml di 1,7 g / ml in ogni provetta, carico 1 ml di 1,5 g / ml in ogni provetta, carico 1 ml di 1,35 g/ ml in ciascun tubo, carico 1,2 g / ml in ogni provetta (opzionale), e infine caricare 6-8 ml di campione nella rispettiva provetta. Mark singoli strati per indicare la posizione di ogni frazione. Equilibrio ciascuna coppia contrapposte di tubi di 1 mg. Sistemare con cura ogni tubo nel secchio di spin. Spin tutti secchi, anche se sono vuote. Caricare il secchio centrifuga sul rotore. Centrifugare a 82.844 xga 4 ° C per 2 ore. Dopo la centrifugazione, rimuovere con attenzione i tubi del titolare senza interrompere i gradienti di densità. Usando una siringa 3 ml con un ago 18 G, perforare il tubo appena sotto la g / ml strato 1.5 densità (figura 2, freccia rossa) e tirare ~ 1,5 ml nella siringa. Raccogliere frazione superiore rimuovendo lentamente l'ago e permettendo la frazione rimanente nel tubo di gocciolare in un nuovo tubo 15 ml attraverso la puntura. Etichettare questo come "rifiuti frazione superiore". Raccogliere la 1,5 g / ml fraction (contenente VLP) dalla siringa estraendo il contenuto in due nuovi tubi microcentrifuga. Ripetere il passaggio 2.3.8-2.3.10 per tutti i campioni. Aggiungere 0,2 volumi di cloroformio nel concentrato virale, agitare vigorosamente, incubare a temperatura ambiente per 10 minuti, far girare a velocità massima per 5 minuti, e raccogliere la fase acquosa. Aggiungere tampone 10x e DNasi DNasi I (concentrazione finale = 2,5 U / ml) nel concentrato virale cloroformio-trattati, e incubare a 37 ° C per 1,5-2 ore. Inattivare dell'attività DNasi a 65 ° C per 15 min. Rimuovere 15 ml di cloroformio e la frazione virale DNasi I-trattati in un nuovo tubo, e aggiungere 15 microlitri 4% paraformaldeide per fissare il campione per epifluorescenza. Estrazione del DNA Piscina concentrati virali da ogni campione in 50 ml di Oak Ridge provetta da centrifuga ad alta velocità puliti e sterilizzati in autoclave. Aggiungere la seguente: 0,1 volumi 200x tampone TE, 10 microlitri 0,5 M EDTA per ml di sampio, 1 volume di formammide, e 10 microlitri glicogeno. Mescolare bene e incubare a temperatura ambiente per 30 min. Utilizzando i nuovi volumi, aggiungere 2 volumi di temperatura ambiente 100% di etanolo. Mescolare bene e incubare a 4 ° C per almeno 30 minuti. DNA pellet facendo girare il tubo a 17.226 xg per 20 minuti, a 4 ° C utilizzando un rotore SS-34. Eliminare con cura il surnatante utilizzando una pipetta sierologica. Lavare il pellet due volte con ghiacciata etanolo al 70%. Rimuovere quanto più liquido possibile e consentire il pellet asciugare a temperatura ambiente per 15 min. Risospendere il pellet di DNA in 567 microlitri di tampone 1x TE (pH 8,0). NOTA: Lasciare almeno 15 min per risospensione completa a temperatura ambiente. Conservare il DNA risospeso notte a 4 ° C fino ad ulteriore lavorazione. Trasferire l'intero 567 ml di soluzione di DNA risospeso in un nuovo tubo di 1,5 ml microcentrifuga. Aggiungere 30 ml di pre-riscaldato 10% SDS e 3 ml di proteinasi K (20 _6; g / ml), mescolare accuratamente e incubare per 1 ora a 56 ° C. Pre-caldo CTAB / NaCl a 65 ° C. Aggiungere 100 ml di 5 M NaCl e mescolare accuratamente. Aggiungere 80 ml di soluzione CTAB / NaCl pre-riscaldato, vortice, e incubare per 10 minuti a 65 ° C. Aggiungere uguale volume di cloroformio, vortice di mescolare e centrifugare a 16.100 g per 5 min. Trasferire il surnatante in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 ml. Aggiungere un volume uguale di fenolo / cloroformio, agitare per miscelare e centrifugare a 16.100 xg per 5 min. Trasferire il surnatante in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 ml. Aggiungere un uguale volume di cloroformio, agitare per miscelare e centrifugare a 16.100 xg per 5 min. Trasferire il surnatante in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 ml. Aggiungere uguale volume di isopropanolo alla frazione supernatante, miscelare e incubare a -20 ° C per almeno 30 min. Pellet il DNA, rotazione a 16.100 xg per 15 minuti a 4 ° C. Pipetta il sopranatante accuratamente e lavare il pellet due volte con ghiacciata etanolo al 70%. </li> Eseguire una breve centrifuga e rimuovere l'etanolo residuo dal tubo. Far asciugare il pellet per 15 min. Risospendere il pellet di DNA con 50 microlitri di tampone di eluizione (5 mM Tris, pH 8,5). Lasciare che il pellet per reidratare per almeno 5 minuti in temperatura ambiente. Quantificare il DNA utilizzando un saggio basato fluorescenza ad alta sensibilità. Amplificazione usando Phi29 polimerasi (opzionale) Preparare 2x tampone ricottura: 80 mm Tris-HCl (pH 8.0), 20 mM MgCl 2. Diluire DNA polimerasi Phi29 a 5 U / ml. Tampone campione pre-mix, composto da 50 ml casuale Primer esamero (100 micron), 125 buffer di ricottura microlitri 2x, e 25 ml di acqua. Aliquota e conservare a -20 ° C. Buffer pre-mix di reazione, composta da 100 microlitri di buffer Phi29 10x, dNTP 40 ml a 10 mm, e 560 ml di acqua. Aliquota e conservare a -20 ° C. Aggiungere 1 ml DNA stampo in 4 tampone microlitri. Incubare the miscela a 95 ° C per 3 minuti e raffreddare su ghiaccio. Aggiungere 14 ml di tampone di reazione nella miscela da 2.4.4, mescolare pipettando su e giù. Aggiungere 1 ml di DNA polimerasi Phi29, mescolare pipettando su e giù, e incubare a 30 ° C per 18 ore seguito da 65 ° C per 10 min. Pulire le reazioni con colonne di DNA genomico o fenolo / cloroformio e precipitazioni etanolo. Epifluorescenza Microscopia (Vedere Haas et al. 2014 28 per la configurazione del sistema di filtrazione) NOTA: Dopo isolamento e purificazione, epifluorescenza con coloranti acidi nucleici può essere utilizzato per verificare la presenza e la purezza di particelle virali nei campioni (figure 2A e 2C). DNA libero nel campione può dar luogo a fondo elevato fluorescenza. Pertanto, il campione deve essere DNasi I trattati prima della fissazione e colorazione per micrografie. Preparare la soluzione di montaggio (acido ascorbico 0,1%, 50% glicerolo). Aggiungere 100 ml di 10% di acido ascorbico a 4,9 ml di 1x tampone fosfato salino (PBS), mescolare accuratamente. Aggiungere 5 ml di 100% glicerolo al composto, mescolare bene ed etichettare il tubo come "monte". Montaggio del filtro con un 0,02 micron matrice di allumina filtro siringa monouso, aliquota in tubi microcentrifuga, e conservare a -20 ° C. Aliquotare 100 ml di campione in una nuova provetta per microcentrifuga e aggiungere uguale volume di 4% paraformaldeide per fissare i VLP. Incubare la miscela a temperatura ambiente per almeno 10 min. Portare al volume di 1 ml con l'aggiunta di 800 ml di acqua 0,02 micron filtrata. Aggiungere 1 ml di colorante SYBR oro nella provetta e incubare a temperatura ambiente per 10 min. Impostare il sistema di filtrazione, attivando la pompa del vuoto tra -9 e -10 psi (-62,1 e -68,9 kPa). Lavare il piedistallo con acqua e mettere un filtro matrice di allumina 0,02 micron con anello di supporto in polipropilene anulare nel piedistallo del filtro. Inserire una torre filtro sulla parte superiore del piedistallo filtro con il filtro e sicuro con un morsetto. Pipettare il contenuto della provetta per microcentrifuga da 1,5 ml nella torre del filtro, e attendere qualche minuto per il campione di filtrare. Label e pipetta 10 ml di reattivo monte in un vetrino microscopico. Lasciare il vuoto su durante la rimozione della torre del filtro e il morsetto. Rimuovere accuratamente il filtro dal piedistallo filtro e asciugare il fondo del filtro con un Kimwipe, quindi posizionare il filtro direttamente sulla parte superiore del supporto sul vetrino microscopico. Pipetta altri 10 ml di reagente monte sul filtro e mettere un coprioggetto sul filtro. 3. Generazione microbica metagenoma Preparazione di tamponi e soluzioni Preparare 50 ml di tampone 1x DNasi: 50 NAAC mM, 10 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2; regolare il pH a 6,5. Sterilizzare Filter (0,22 micron) e negozioa temperatura ambiente. Preparare DNasi Enzyme a 1000 U / ml (in acqua grado molecolare) di liofilizzato bovina pancreas DNasi I secondo l'attività definita per unità Dornase / mg di peso a secco. Preparare 100 ml di tampone SE: NaCl 75 mM, EDTA 25 mM; regolare il pH a 7,5. Sterilizzare Filter (0,22 micron) e conservare a temperatura ambiente. Pre-trattamento del campione prima dell'estrazione del DNA Diluire l'omogeneizzato con l'aggiunta di 5 volumi di 0,22 micron filtrata 1x PBS. Ad esempio, aggiungere 10 ml di 1x PBS in 2 ml di campione. Aggiungere β-mercaptoetanolo al 2% (v / v) concentrazione finale. Oscillare la miscela (nella cappa chimica) a temperatura ambiente per 2 ore. Spin il campione a 10 ° C e 3.056 xg per 15 min, ed eliminare il surnatante. Risospendere il pellet in 10 ml di acqua grado molecolare (o 0,22 micron acqua filtrata), ed incubare a temperatura ambiente per 15 min. Ripetere i punti 3.2.3 e 3.2.4 una volta. Spin a 10 ° C e 3.056 xg per 15 min, ed eliminare il surnatante. Risospendere il pellet in 5 ml di tampone 1x DNasi e aggiungere 15 microlitri DNasi I (1.000 U / ml) per ml di campione. Incubare a 37 ° C con ripetuti miscelazione per 2 ore. Inattivare dell'attività DNasi a 65 ° C per 15 min. Spin a 10 ° C e 3.056 xg per 15 minuti, e scartare il surnatante. Risospendere il pellet in 10 ml SE buffer. Ripetere il punto 3.2.10. Spin a 10 ° C e 3.056 xg per 15 minuti, e scartare il surnatante. Risospendere il pellet in 2 ml SE tampone, e il trasferimento di due tubi microcentrifuga. Agglomerare le cellule nei tubi microcentrifuga. Spin le provette a 16.100 xg a temperatura ambiente per 15 min. Rimuovere il surnatante ed estrarre il DNA dalle cellule pellet usando un kit di estrazione di DNA genomico, protocollo variazione Gram-positivi. 4. Generazione Metatranscriptome Campione Pre-Trattamento Eseguire lisi meccanica delle cellule di cordone di battere in un tampone GITC-lisi immediatamente dopo il prelievo del campione e omogeneizzazione. Vedere il punto 1.4. Spin la miscela a 4 ° C e 600 xg per 5 minuti per sedimentare le perline di silice. Trasferire il surnatante in un nuovo tubo. Aggiungere 200 ml di cloroformio per ogni 750 ml di tampone GITC-lisi utilizzati, agitare vigorosamente a mano per 15 secondi, incubare a temperatura ambiente per 10 minuti, e centrifuga a 4 ° C e 3.056 xg per 15 min. Nel corso di questo 15 min rotazione, prepararsi per passo 4.2. Dopo l'15 min di spin (una netta separazione delle forme di fase fase interfase-organici acquosi), estrarre la fase acquosa (senza interrompere l'interfase) nel nuovo tubo (s) RNasi-free. NOTA: La fase acquosa contiene l'RNA. Tenere le provette su ghiaccio fino alla fase successiva. Eseguire l'estrazione di RNA totale e purificazione utilizzando i kit di purificazione RNA disponibili in commercio basati su colonne o conveNtional base isopropanolo-RNA precipitazione. A base di silice colonna RNA Purification Misurare il volume totale della frazione acquosa ottenuta. Aggiungere adeguato volume di tampone-RNA vincolante per il campionamento e mescolare bene. Regolare la miscela di appropriarsi condizione vincolante secondo il protocollo del produttore. Mescolare bene e fare un breve giro. Caricare il composto nella RNA-colonna. Per un campione di grande volume, utilizzare il carico multipla e caricare ogni colonna fino a 4x. In caso contrario, considerare l'utilizzo di più colonne per ogni campione. Lavare la colonna in modo appropriato secondo il protocollo del produttore. Eluire l'RNA con almeno 30 ml di acqua RNase-free. Doppio-eluizione aumenta leggermente la resa di RNA. Tuttavia, questo diluire la concentrazione di RNA. Misurare la concentrazione di RNA e procedere direttamente al trattamento DNasi I. Utilizzare il Bioanalyzer per controllare la qualità del RNA (consigliato). </ol> RNA Precipitazioni Aggiungere un volume uguale di isopropanolo (ad esempio, 500 ml di isopropanolo in 500 ml di frazione acquosa) e 2 ml di 10 mg / mL glicogeno senza RNasi al campione. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 10 min. Spin a 12.000 xg e 4 ° C per 15 min. Rimuovere con attenzione il surnatante, aggiungere 1 ml di RNase-free 75% di etanolo. Gira la miscela a 7.500 xg e 4 ° C per 5 minuti per assicurarsi che il pellet è intatto. Rimuovere con cautela l'etanolo. Ripetere i punti 4.2.2.4 e 4.2.2.5 volta. Far asciugare il pellet per 10 min. Reidratare il pellet in 50 ml di acqua RNase-free, incubare a 55 ° C per 5 minuti e procedere direttamente al trattamento DNasi. Utilizzare il Bioanalyzer per controllare la qualità del RNA (consigliata). Conservare RNA in aliquote a -20 ° C, o -80 ° C per la conservazione a lungo termine. </ol>

Representative Results

Metagenomi virali CF espettorato è eccezionalmente viscosa e contiene una quantità elevata di mucina e DNA libero (Figura 2A); l'ultracentrifugazione gradiente di densità facilita l'eliminazione di DNA host-derivato (Figura 2B). I risultati di uno studio precedente 9 che mostra otto viromes generati dal flusso di lavoro presentato sono riassunte qui (Tabella 1). Sette campioni (CF1-D, CF1-E, CF1-F, CF4-B, CF4-C, CF5-A, e CF5-B; Tabella 1) sono stati trattati come descritto nella Sezione 2. Le viromes generati contenevano poco (0,02 % -3,7%) sequenze di derivazione umana, con una sola eccezione (70%). CF4-A è stato omesso dal passo ultracentrifugazione gradiente di densità (CF4-A) e il virome generati da questo campione specifiche contenute> 97% sequenze di derivazione umana (Tabella 1). La Figura 2 mostra un esempio di immagine epifluorescenza di un tipico CF sputum campione prima (figura 2A) e dopo (figura 2C) gradiente di densità ultracentrifugazione. Particelle virali simil-Cancella (VLPs) sono stati osservati nei microscopio senza particelle di grandi dimensioni in seguito alla separazione gradiente di densità. Dopo l'estrazione del DNA VLP, la contaminazione batterica è spesso testato utilizzando 16S rDNA amplificazione prima del sequenziamento del DNA VLP. Microbiche metagenomi Sette campioni di espettorato qui presentati sono stati raccolti da un singolo paziente CF in sette giorni consecutivi. Il paziente ha iniziato a antibiotico orale (ciprofloxacina e doxiciclina) il giorno 3 dopo l'espettorato è stato raccolto. Il volume di ciascun campione di espettorato raccolti da questo paziente era 15 ml durante 7 giorni; Pertanto, non è stato aggiunto PBS al campione. L'obiettivo di questo evento il campionamento è stato quello di valutare i protocolli presentati in questo flusso di lavoro (i) per valutare la fluttuazione giornaliera di struttura della comunità microbica, e (ii) confrontola struttura della comunità microbica e la risoluzione tra metagenomica e sequenziamento del 16S rDNA. Pertanto, il DNA totale e HL-DNA sono stati estratti da ciascun campione. La concentrazione HL-DNA di ciascun campione di espettorato dopo l'estrazione del DNA è presentato nella tabella 2. La resa totale di HL-DNA variava da 210 ng a> 5 mg. Librerie sequenziamento Illumina stati generati con un materiale di partenza totale di 1 ng per ogni campione (Figura 3). Le caratteristiche dei dati metagenomica sono presentati nella tabella 2. Tutte tranne una biblioteca ha prodotto più di 1 milione di sequenze e oltre l'85% delle sequenze di alta qualità sono stati mantenuti su pre-elaborazione dei dati utilizzando il software PRINSEQ 29. Tutti i set di dati sono stati preelaborati prima per rimuovere i duplicati e sequenze di bassa qualità (punteggio di qualità minima di 25), seguita da ulteriori controlli e di sequenze di derivazione umana utilizzando DeconSeq 30. La quantità di uomo-decontaminazione sequenza Rived è fortemente dipendente dalle proprietà del campione. Qui, la quantità totale di sequenze di derivazione umana variava 14-46% (Tabella 2). Le sequenze preprocessati stati poi annotati utilizzando il Metaphlan 31 oleodotto e MG-RAST server a 32. Oltre a metagenomi, librerie ampliconi 16S rDNA stati generati sia dal DNA totale e HL-DNA mediante primers destinati circa 300 bp della regione variabile V1-V2 nel gene 16S rRNA 33,34. Prodotti di PCR di singoli campioni sono stati normalizzati e raggruppati per sequenziamento utilizzando il Illumina 500-cycle sequencing accoppiato-end eseguito sulla piattaforma MiSeq. Accoppiato-end 16S rDNA sequenze ampliconi sono stati ordinati per esempio tramite codici a barre utilizzando uno script python e accoppiati letture di stati assemblati utilizzando phrap 35,36. Estremità sequenza assemblati sono stati tagliati fino al punteggio medio di qualità è stato ≥20 usando una finestra 5 nt. Potenziali chimere eranon rimosso utilizzando Uchime 37 contro un sottoinsieme senza chimera delle sequenze di riferimento SILVA 38. Taxanomy è stato assegnato alla qualità legge con SINA 39 (versione 1.2.11) utilizzando i 418.497 sequenze batteriche dal database SILVA 38. Sequenze con incarichi tassonomici identici sono stati raggruppati per produrre unità tassonomiche operativi (Otus). Questo processo ha generato 1.655.278 sequenze per 16 campioni (dimensione media: 103.455 sequenze / campione, min: 72.603; max: 127.113). Il punteggio di copertura merci mediana, una misura di completezza di sequenziamento, è stato ≥ 99,9%. Il pacchetto software Explicet 40 (v2.9.4, www.explicet.org) è stato utilizzato per l'analisi e la generazione di figura. Alpha-diversità (intra-campione) e beta-diversità (inter-campione) sono stati calcolati in Explicet al punto di rarefazione di 72.603 sequenze con 100 bootstrap re-campionamenti. La prima domanda di mira da questo studio era se ipotonica lisi preferentialleato seleziona per (cioè, preferenzialmente conserva o lisi) particolari gruppi di microbi. Dopo il primo lisi ipotonica, le cellule pellet ri-sospesi sono stati sotto-campione dai primi due campioni (CF1-1A * e CF1-2A *) per confrontare con gli stessi campioni dopo la seconda lisi ipotonica (CF1-1and CF1-2). Tutti i campioni sono stati trattati allo stesso modo, cioè, trattato con DNasi I prima dell'estrazione del DNA, seguita da estrazione del DNA e la conduttura sequenziamento. Come mostrato in figura 4, i profili microbici di sottocampioni sono molto simili ai campioni dopo due trattamenti lisi ipotonica. Inoltre, secondo lisi ipotonica aumenta la frazione di sequenze non umani da 6-17% entro i metagenomi (Tabella 2). Per verificare le differenze nella composizione microbica tra metagenomic- e profiling a base di rDNA 16S, e per le modifiche prima e dopo lisi ipotonica che potrebbero spiegare le differenze già visto tra il nostro stalloneee gli altri, batteriche librerie sequenziamento del 16S rDNA stati generati sia dal DNA totale e DNA HL-derivato (Figura 4B). A livello di genere, i profili tassonomia dei batteri CF-associate comuni come Pseudomonas, Stenotrophomonas, Prevotella, Veillonella, e Streptococcus erano molto simili tra le librerie 16S rDNA e metagenomi generati dal DNA HL-derivato. Tuttavia, Rothia rilevazione nelle biblioteche 16S rDNA non era così abbondante come con le librerie metagenomiche. Confrontando i profili tassonomiche 16S rDNA generati dal DNA totale e DNA HL-derivato, Pseudomonas stato differenzialmente rappresentato nel DNA totale rispetto al DNA di partenza HL-derivato dal giorno 3. Metatranscriptomes Tipicamente, l'RNA totale estratto da espettorato CF è parzialmente degradato e la dimensione varia da 25-4,000 bps (Figure 5A e <strong> 5C). Qui, i risultati rappresentativi presentati tradotto in Lim et al. 2012 9. La frazione di rRNA nei metatranscriptomes non impoverito varia 27-83%, e l'abbondanza relativa di rRNA variato attraverso campioni (tabella 3; dati estratti da Lim et al. 9). Tuttavia, deplezione di kit Ribo-Zero diminuito l'rRNA relativa abbondanza di rRNA al 1-5% con l'eccezione di campione CF1-F. La variazione nell'efficacia di rimozione rRNA potrebbe riflettere la qualità dell'RNA estratto, o differenze nella comunità microbica presente e quindi l'accessibilità di rRNA per sonde di ibridazione 9. Gli elettroferogrammi di un successo (Figura 5B) e infruttuoso procedura di rimozione (Figura 5D) rRNA utilizzando il kit di rimozione Ribo-Zero rRNA differiscono, in cui i picchi di rRNA sono visibili nella rimozione senza successo. La dimensione di cDNA biblioteche generated spesso riflette la gamma di dimensioni del campione di partenza RNA. Le librerie di cDNA qui presentati sono stati generati con un intero kit trascrittoma di amplificazione (WTA2) su rRNA esaurimento seguita da Roche-454 biblioteca sequenziamento preparazione 9. Il cDNA generato contiene frammenti che vanno da 50-4,000 bps (Figure 5E e 5F) ed è altamente coerente tra i campioni (Lim et al. 2012) 9. La disponibilità di altri RNA-Seq kit di preparazione biblioteca specifiche della piattaforma attualmente fornisce più opzioni alternative per una di coniugare sintesi del DNA e preparazione biblioteca sequenziamento in condizioni ottimali. Una opzione raccomandata fino ad oggi è la ScriptSeq Gold Kit completo che unisce rRNA reagenti rimozione sopra raccomandate e kit di preparazione biblioteca RNA-Seq. Figura 1: Flusso di lavoro per la preparazionearazione di campioni ospite-associate, come campione di espettorato, per virome, microbioma, e metatranscriptome sequenziamento. Figura 2: Cesio cloruro di gradienti di densità ultracentrifugazione facilitare l'eliminazione del DNA extracellulare e particelle di grandi dimensioni (A), e consentire l'isolamento ottimale di particelle virali, come da CF espettorato. Un millilitro di ogni sfumatura è stratificato sopra l'altro prima di caricare il campione pretrattato (B). Particelle seguito isolamento e purificazione, epifluorescenza con coloranti acidi nucleici come SYBR oro vengono utilizzati per verificare la presenza e la purezza di particelle virali nei campioni. Particelle virali simil-Cancella (C; freccia bianca) sono stati osservati in seguito il gradiente di separazione densità del CF campione di espettorato. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "always"> Figura 3:. Esempio della distribuzione delle dimensioni delle librerie Nextera XT generati dal 1 ng di HL-DNA che ha portato microbiomes espettorato CF normalizzazione biblioteca, miscelatura, e caricamento importo è stato fatto come descritto nel protocollo produttore, senza alcuna deviazione. Figura 4: analisi tassonomica delle comunità microbiche in nove campioni raccolti longitudinalmente da un CF paziente (A) profili microbici basati sulle librerie metagenomiche generate da lisi ipotonica DNA metodo basato.. L'assegnazione specie era basata sulla Metaphlan dati conduttura seguente preelaborazione che rimuovere duplicati e sequenze con bassa qualità e omologia di sequenza umana. Al fine di dimostrare che due steps lisi ipotonica non ha preferenzialmente seleziona per particolari gruppi di microbi, sottocampioni (*) dopo il primo lisi ipotonica sono stati inclusi. (B) profili microbici in base alla regione v1v2 di 16S rRNA gene sequenziamento del DNA da totale (T) e il metodo di lisi ipotonica DNA basata (HL). Questi dati non sono stati precedentemente pubblicati. Figura 5: Esempi di bioanalizzatore Agilent 2100 elettroferogrammi di RNA (AD) e cDNA (EF) generato per le librerie metatranscriptomic, utilizzando rispettivamente RNA pico e ad alta sensibilità chip dsDNA. (A) e (C) mostrano esempi di elettroferogrammi prima procedure di rimozione rRNA. Gli elettroferogrammi di un successo (B) e infruttuoso procedura di rimozione (D) rRNA utilizzando kit totale rimozione rRNA leggermente diverse, unat che rRNA picchi sono visibili nella rimozione senza successo. La dimensione di cDNA (EF) generato utilizzando il kit di amplificazione intero trascrittoma-(Sigma-Aldrich) è simile alla gamma di dimensioni della partenza RNA rRNA-impoverito, e altamente coerente tra i due campioni diversi. Clicca qui per visualizzare un grande versione di questa figura. CF1-D CF1-E CF1-F CF4-A CF4-B CF4-C CF5-A CF5-B Numero totale di letture 224.859 87.891 106.189 93.301 140.020 1.558 272.552 217.438 Pre-elaborato legge un 109.389 73.624 67.070 82.011 68.617 1.137 215.808 158.432 49% 84% 63% 88% 49% 73% 79% 73% Numero di basi 47.239.573 33.351.525 28.922.479 27.667.695 29.386.841 243.986 95.205.805 69.581.811 Media lunghezza lettura 432 453 431 337 428 215 441 439 Sequenze Host b 240 526 28 79.774 13 797 585 5859 0,21% 0,71% 0,04% 97.27% 0,02% 70.10% 0,27% 3,70% Risultati virali c 7214 23.550 4.070 737 4642 22 6466 5981 6,59% 31.99% 6,07% 0,90% 6,77% 1.93% 3,00% 3,78% Non assegnato Letture d 103.888 60.490 32.780 1.935 68.440 311 105.612 119.551 94.97% 82.16% 48.87% 2.36% 99.74% 27.35% 48.94% 75.46% una Legge dopo i dati pre-processing da PRINSEQ 29. b umano letture identificato da DeconSeq 30 plus legge con un migliore colpo BLASTN (NCBI database di nucleotide) al phylum Chordata. c tBLASTx colpisce contro banca dati del genoma virale in-house. La percentuale è stata calcolata usando il numero totale di pre-elaborato legge. d Legge senza BLASTN colpito nel database nucleotide NCBI. La percentuale è stata calcolata usando il numero totale di pre-elaborato legge. Alcune letture senza BLASTN colpito nel database nucleotide NCBI sono stati identificati come virale a livello proteico nell'analisi tBLASTx. Tabella 1:. Caratteristiche Biblioteca di otto viromes generati da campioni di espettorato utilizzando workflow presentato Questa tabella è estratto da Lim <em> et al. (2012) 9. Sette campioni (CF1-D, CF1-E, CF1-F, CF4-B, CF4-C, CF5-A, e CF5-B) sono stati trattati come descritto nella Sezione 2 e viromes che contenevano poco (0,02% generato – 3.7 sequenze%) di derivazione umana con un'eccezione (70%). CF4-A è stato omesso dal passo ultracentrifugazione gradiente di densità (CF4-A) e virome generato che conteneva> 97% sequenze di derivazione umana. Campione Concentrazione Resa totale Numero totale Letture Numero totale Legge (Processed b) Sequenze non umani (Ng / ml) (Ng) (Raw a) (%) CF1-1A * 2.3 <td rowspan = "2"> 230 1098454 937.688 691.541 74% CF1-1 13 1.300 2212756 1958910 1574520 80% CF1-2A * 2.1 210 672.878 588.106 407.530 69% CF1-2 5.2 520 1944012 1697010 1455174 86% CF1-3 28.8 2.880 1048304 896.756 560.852 63% CF1-4 24.1 2.410 1154922 984.702 621.098 63% CF1-5 33.6 3.360 1029622 888.630 481.548 54% CF1-6 43.2 4.320 1434016 1256504 725.858 58% CF1-7 57.8 5780 1000174 872.036 565.376 65% * 1 ml di campione è stato sotto-campione da CF1 -1 E CF1-2 seguito della prima fase di lisi ipotonica (Step 3.1.5) prima della seconda procedura di lisi ipotonica. Le cellule sono state centrifugati come descritto in 3.1.7 e procedere attraverso il protocollo rimanente senza alcuna modifica. un Lordo Illumina legge da una corsa 2 x 300 bp MiSeq sequenziamento. B legge sono stati valutati, tagliati, e rimossi basata sulla qualità e la durata come descritto nella discussione. Tabella 2:. Caratteristiche di microbiomes generati da campioni di espettorato utilizzando workflow presentato la concentrazione di DNA di ogni campione in 100 microlitri tampone di eluizione (5 mM Tris / HCl, pH 8,5) e le caratteristiche dei dati di sequenza sono presentati. Un totale di 1 ng è stato usato per generare singola libreria usando il kit di preparazione biblioteca Nextera XT. 0 "fo: keep-together.within-page =" always "> Campione CF1-D CF1-F CF4-B CF4-C Trattamento Nessuno Ribo-Zero Nessuno Ribo-Zero Nessuno Ribo-Zero Nessuno Ribo-Zero Pre-elaborato legge 2.088 1.991 40.876 25.238 19.728 32.737 31.791 36.172 Media lunghezza lettura 275 245 262 270 233 259 240 267 Totale rRNA legge 1.737 91 29.499 17.267 5.285 291 16.371 1.761 83.20% 4,60% 72.20% 68.40% 26.80% 0,90% 51.50% 4,90% Microbica rRNA 1.414 32 19.978 12.035 23 227 6916 1.076 67.70% 1,60% 48.90% 47.70% 0,10% 0,70% 21.80% 3,00% Eucarioti rRNA 323 59 9520 5232 5.262 64 9455 683 15.50% 3,00% 23.30% 20.70% 26.70% 0.20% 29.70% 1,90% % RRNA rimosso * 0% 95% 0% 5% 0% 97% 0% 91% Non-rRNA legge 351 (16,8%) 1.900 (95,4%) 11.377 (27,8%) 7971 (31,6%) 14.443 (73,2%) 32.446 (99,1%) 15.420 (48,5%) 34.411 (95,1%) Totale colpi NR 102 (4,9%) 691 (34,7%) 3.327 (8,1%) 2.857 (11,3%) 4.938 (25,0%) 10.751 (32,8%) 5.905 (18,6%) 15.766 (43,6%) Eukaryotic 74 407 2.790 2.524 4.614 10.227 4553 8274 Batterico 26 283 520 312 287 471 1.326 7442 Non assegnato legge 249 (11,9%) 1.209 (60,7%) 8.050 (19,7%) 5.114 (20,3%) 9505 (48,2%) 21.695 (66,3%) 9515 (29,9%) 18.645 (51,5%) * La quantità di rRNA rimosso espressa come percentuale della quantità presente nella parte aliquota non impoverito. Tabella 3:. Caratteristiche biblioteca del metatranscriptomes con e senza rRNA deplezione I dati vengono estratti dal Lim et al (2012) 9, che ha ulteriore confronto di altri kit rimozione rRNA e l'effetto di nebulizzazione cDNA prima della preparazione biblioteca sequenziamento..

Discussion

Metagenomica virali

Particelle virali sono concentrati utilizzando polietilene glicole (PEG) precipitazione o piccoli concentratori di volume. In alcuni casi, la concentrazione può non essere necessario, ma pre-filtrazione o centrifugazione a bassa velocità passi sono usati per rimuovere le cellule eucariotiche e microbiche. Lisati virali saranno ulteriormente arricchite e purificati mediante gradiente di densità ultracentrifugazione 9,41 o filtri di piccole dimensioni (ad esempio, 0,45 micron) per rimuovere le cellule microbiche eucariotiche e grandi 25. Gradiente di densità ultracentrifugazione viene in genere effettuata con soluzioni dense ma inerti come saccarosio o di cesio cloruro di isolare e concentrare le particelle virali 41. La separazione fisica si basa sulla dimensione e densità di galleggiamento di particelle virali. Pertanto, la corretta scelta della dimensione dei pori del filtro e la rigorosa preparazione di gradienti sono essenziali per isolare comunità virali specifici, come il successo del recupero fisico diVLP determina la comunità isolata 41 (cioè particelle virali che non passano attraverso il filtro o rientrano la densità di estrazione non saranno rilevate nel metagenoma). Dopo isolamento virale e concentrazione, ci possono essere contaminanti non virale materiale genomico presente nel campione sia nella forma di acidi nucleici liberi e microbica e cellule eucariotiche. Pertanto, è fondamentale per verificare la purezza di particelle virali nei campioni (Figure 1A e 1B). Un trattamento cloroformio è comunemente utilizzato per lisare cellule rimanenti, seguito da un trattamento con nucleasi di degradare gli acidi nucleici liberi prima dell'estrazione dell'acido nucleico.

Un avvertimento al flusso di lavoro presentato è stato l'uso della separazione gradiente di densità per isolare le particelle virali come può escludere particelle virali con involucro che possono essere troppo positivo per inserire il gradiente di CsCl. Un'alternativa "catch-all" metodo è quello di omettere la SEPAR gradiente di densitàzione e isolare il DNA comunità dalle 0,45 micron – filtrati trattati con cloroformio e DNasi I. Questo approccio è anche opportuno accogliere piccoli volumi di campione come quelli di tamponi o plasma sanguigno. Tuttavia, ciò può provocare la contaminazione batterica cloroformio-resistenti e superiori quantità di DNasi I-resistenti DNA extracellulare.

Protocolli di sequenziamento attuali richiedono 1 ng a 1 mg di acidi nucleici per la preparazione biblioteca sequenziamento del DNA per cui i rendimenti più elevati offrono una scelta più ampia di opzioni di sequenziamento. La concentrazione di DNA viromes generati varia spesso da sotto del limite di rilevazione a più di 200 ng / ml. La quantità di acidi nucleici virali recuperati può essere insufficiente per la preparazione diretta biblioteca sequenziamento. In tali casi, l'amplificazione dell'acido nucleico è essenziale. Amplificazione fucile librerie Linker (LASLs) 2,42,43 e tutta l'amplificazione del genoma basata su più spostamenti di amplificazione (MDA) sono i duemetodi più comunemente utilizzati per generare DNA sufficiente per sequenziamento. MDA metodi come quelli basati su Phi29 DNA polimerasi sono noti a soffrire di pregiudizi amplificazione, e possono amplificare preferenzialmente ssDNA e DNA circolare, con conseguente tassonomico non quantitativa e caratterizzazione funzionale 44,45. Una versione ottimizzata dell'approccio LASLs ha dimostrato introdurre solo distorsioni minime, promuove maggiore sensibilità (per piccole quantità di materiale di partenza), ed è facilmente adattato per diverse piattaforme 43 sequenziamento. Tuttavia, l'approccio ha molti passaggi, richiede attrezzature specializzate per ridurre al minimo la perdita di DNA, ed è limitata ai modelli dsDNA. Nel nostro laboratorio, questo approccio è stato adattato con successo per amplificare quantità rilevabile e non rilevabili di DNA estratto da lavage- broncoalveolare, VLP-derivati ​​acqua coralline e mare (inediti e Hurwitz et al. 46).

Lo sviluppo di gasdotti di analisi dei dati ha classically stato uno degli aspetti più impegnativi di analisi metagenomica virale a causa della natura altamente diversificata e in gran parte sconosciuti delle comunità virali. Mentre ci sono circa 10 8 genotipi virali nella biosfera, ad oggi attuali banche dati virali contenere ~ 4.000 genomi virali, che è circa 1 / 100.000 di questa diversità virale totale approssimativa. Pertanto, le ricerche basate similarità (come BLAST 47) per l'assegnazione tassonomica e funzionale in metagenomi virali possiedono sfide inerenti. Molte sequenze non avere analogie significative genomi nel database, e di conseguenza, sono classificati come sconosciuti. Anche se le ricerche basate omologia-sono le applicazioni più importanti per l'assegnazione di tassonomia e la funzione per la sequenza di dati, metodi alternativi basati su analisi indipendente dal database sono stati sviluppati 48- 50. Fancello et al. 51 forniscono una revisione completa di strumenti di calcolo e gli algoritmi utilizzati in Virametagenomica l.

Microbica Metagenomica

Tipicamente, la quantità totale di DNA estratto da comunità ipotonici lisi trattati microbiche (HL-DNA) vanno da 20 ng a 5 mg. La resa è fortemente dipendente dallo stato di salute del paziente e la quantità di campione di espettorato raccolti, che spiega le variazioni visti nella resa totale di HL-DNA estratto in questo studio (Tabella 2). I passaggi critici per generare dati di sequenza buona qualità affidamento sulla qualità delle librerie sequenziamento generati. Figura 2 mostra un intervallo tipico dimensioni per le librerie sequenziamento generati dal DNA microbico CF espettorato derivato utilizzando una procedura basata frammentazione del DNA enzimatica-. La dimensione ottimale biblioteca dipende dalla scelta della piattaforma sequenziamento e l'applicazione, e di conseguenza, la procedura frammentazione può essere ottimizzata, se necessario, attraverso approcci alternativi come sonicazione e nebulizzazione. Inoltrei risultati rappresentativi presentati, il successo del metodo presentato su espettorato CF raccolti da più pazienti su più punti di tempo è anche illustrata in Lim et al. (2012) 9 e Lim et al. (2014) 10.

Studi precedenti 9,10 suggeriscono che ogni paziente ospita un set unico di comunità microbica che sposta nel tempo, riflettendo così la persistenza dei principali attori all'interno della comunità, mentre fluttuazioni sono probabilmente dovute a perturbazioni quali trattamenti antibiotici. Se queste fluttuazioni si verificano quotidianamente anche senza perturbazioni esterne oa causa di modalità di campionamento e trattamento del campione, è ancora in discussione. Basato sul metagenomic HL-DNA e l'analisi amplicon 16S rDNA, il campionamento longitudinale 7 giorni mostra che la fluttuazione giornaliero di profili microbici senza perturbazioni antibiotico (giorno 1, 2 e 3) è minima (Figure 3A e 3B). Su introproduzione di antibiotici per via orale subito dopo il Day 3 di campionamento, i cambiamenti nel profilo di comunità divenne evidente il giorno 4. Mentre la ciprofloxacina antibiotico si rivolge a un ampio spettro di batteri patogeni noti come P. aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus e la polmonite, il trattamento aumentato la relativa abbondanza di P. aeruginosa mentre diminuendo il spp Streptococcus. e P. melaninogenica. By Day 6, la comunità lentamente recuperato alla struttura iniziale comunità di partenza. I risultati suggeriscono che le fluttuazioni dei profili microbici all'interno di un singolo paziente è più probabile a causa di perturbazioni della comunità nelle vie aeree.

Data la coerenza tra i profili microbici delle biblioteche 16S rDNA e metagenomi di DNA HL-derivato, abbiamo escluso i pregiudizi derivanti dai primer 16S rRNA utilizzati in questo studio. Una possibile spiegazione per le differenze viste attraverso 16S rDNA tassonomicaprofili AL generati dal DNA totale e DNA HL-derivato (Figura 3B) possono essere la presenza di elevate quantità di Pseudomonas spp. DNA extracellulare dopo il trattamento antibiotico. Questo è supportato dai risultati che queste differenze sono più evidenti a 7 ° giorno, tre giorni dopo il trattamento di antibiotici, che si rivolge Pseudomonas spp. oltre ad altri. La ciprofloxacina è comunemente usato come trattamento di prima linea nei pazienti con FC e P. cronica infezione aeruginosa anche se il suo spettro di attività include la maggior parte patogeni CF-associate. Abbiamo ipotizzato che il trattamento antibiotico sradica le comunità a rischio, tra cui Streptococcus spp. e quindi la creazione di una nicchia riempito da resistente P. aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa può ottenere aumentando la resistenza sue comunità biofilm e DNA extracellulare ha dimostrato di essere il principale sostegno strutturale della sua architettura biofilm 52. Anche se tegli struttura della comunità recuperato, DNA extracellulare può stare nella CF sputo. Pertanto, questi dati suggeriscono che la lisi ipotonica e le fasi di lavaggio presentati in questo flusso di lavoro potenzialmente beneficiare non solo rimuovere il DNA di derivazione umana, ma il DNA extracellulare anche microbica derivato che possono falsare i profili microbici reali.

Metatranscriptomics

Un'alta qualità metatranscriptome deve contenere relativamente poche sequenze di RNA ribosomiale (rRNA) e rappresentano un campione imparziale delle trascrizioni comunità (mRNA). A causa della breve emivita e quantità limitata di mRNA, è fondamentale che il protocollo, come presentato qui, riduce al minimo la manipolazione del campione per massimizzare il numero di trascrizioni recuperati.

Negli ultimi anni, numerosi approcci per rRNA deplezione sono stati sviluppati e adattati in kit disponibili in commercio. Questi includono MicroB Enrich, Ribo-Zero, e specifici del campione sottrattiva hybridizations 53 che si basano sulla oligonucleotide ibridazione, e l'mRNA SOLO kit che si basa sull'attività enzimatica exonuclease RNA mira contenente un 'monofosfato 5. Inoltre, diversi approcci per arricchimenti mRNA come il MessageAmp Kit II-I batteri che polyadenylates preferenzialmente ed amplifica RNA lineari sono inoltre disponibili. Alcuni di questi metodi (ad esempio, di mRNA-ONLY, MicroB E Xpress e la MessageAmp) vengono utilizzati contemporaneamente per l'efficienza ottimale. Tuttavia, l'efficacia di tutti questi approcci sono limitati, in particolare quando si lavora con parzialmente degradata rRNA, come spesso osservato in RNA totale estratto da campioni CF. Poliadenilazione dipendente RNA amplificazione non può essere utilizzato per generare metatranscriptomes costituiti sia mRNA eucariotico e procariotica. Inoltre, il poli (A) coda aggiunto alle sequenze può ridurre la quantità di dati di sequenza utili. Regioni con tratti omopolimero tenderanno ad avere punteggi di qualità inferiori, causing un numero significativo di legge per essere filtrati dal sequenziamento e software di post-sequencing, e la durata media di lettura utile dopo il taglio off poly (A) code saranno ridotti significativamente 54.

Trattare con le comunità microbiche complesse CF e RNA parzialmente degradati (Figure 4A e 4C), il nostro studio precedente ha mostrato che il metodo di ibridazione-capture dal kit oro Ribo-Zero è stato più efficace nella rimozione sia rRNA umana e microbica rispetto ai trattamenti combinare con altri kit 9 (tabella 3). I dati risultante permette l'analisi simultanea di entrambi ospite umano e trascrizioni microbiche. A seconda della resa e la qualità dell'RNA, nonché scelta definitiva della piattaforma di sequenziamento, molti di questi processi compreso sintesi passo cDNA possono essere semplificati con generazione librerie sequenziamento. Ad esempio, RNA trattato Ribo-Zero può essere usato per fare metatranscriptome sequenziamento libraRies utilizzando kit ScriptSeq RNA-Seq Biblioteca Preparazione.

Analisi metagenomica di comunità animali associate fornisce una rappresentazione completa dell'entità funzionale globale che comprende l'host e le sue comunità associate. Il flusso di lavoro qui presentato è adattabile ad una varietà di campioni animali associata complesse, in particolare quelli che contengono muco denso, elevate quantità di detriti cellulari, DNA extracellulare, proteine ​​e complessi glicoproteici, così come cellule ospiti, oltre al microbica virale e desiderato particelle. Anche se le particelle virali e microbiche possono essere persi ad ogni passo, particelle isolamento e purificazione sono essenziali per minimizzare la quantità di DNA ospite. Mentre i dati metagenomica offre potenzialità metaboliche delle comunità esaminati, metatranscriptomics completare tale rivelando l'espressione differenziale delle funzioni codificate 9. Una valutazione completa dei dati genomica e trascrizioni ha dato nuove insIRITTI alla dinamica delle interazioni nelle comunità e facilita lo sviluppo di migliorare terapie 9,10,55.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Health (1 R01 GM095384-01) assegnato a Forest Rohwer. Ringraziamo Epicentre, una società di Illumina per fornire accesso anticipato ai kit Ribo-Zero Epidemiologia. Ringraziamo Mark Hatay per la progettazione e la produzione del supporto tubo ultracentrifugazione. Ringraziamo Andreas Haas e Benjamin Knowles per letture critiche e le discussioni del manoscritto, e Lauren Paolo per assistere il processo di ripresa.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Guanidine isothiocyanate-based RNA lysis buffer Life Technologies 10296-028 TRIzol LS Reagent was used in this study
Silica beads; 0.1 to 0.15 mm Cole-Parmer YO-36270-62 Zirconia-Silicate Beads were used in this study
Dithiothreitol Molecular Grade (Dry Powder) Promega V3155 Can be purchased from any other company
Sterile syringe filter; 0.45 µm pore size hydrophilic PVDF membrane Millipore SLHV033RS
DNase I enzyme  Calbiochem 260913
Sterile syringe filter; 0.02 µm pore size FisherScientific 09-926-13 Diameter: 25mm
Ultra-Clear Centrifuge Tubes Beckman 344059 9/16 X 3 ½ in. (14X90mm), suitable for SW41 Ti Rotor and VLPs density gradient ultracentrifugation
SW41 Ti Rotor Beckman 333790
SS-34 Fixed Angle Rotor Thermo Scientific 28020
Phi29 DNA polymerase Monserate Biotech 4001 10 U/µl
Phi29 Random Hexamer Thermo Scientific S0181 Previously bought from Fidelity Systems
Alumina matrix filter with annular polypropylene support ring; 0.02 µm pore size FisherScientific 09-926-34 Whatman Anodisc Filter Membranes were used in this study; Diameter 25mm
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain Life Technologies S-11494
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-100ML
RNase-free DNase I  NEB M0303S Can be purchased from any other company
Glycogen, RNA grade FisherScientific FERR0551 Can be purchased from any other company
Oak Ridge high-speed centrifuge tubes FisherScientific 05-562-16B For large volume DNA extraction procedure, suitable for SS-34 fixed-angle rotor
Total rRNA removal kit Epicentre MRZE724 ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiology) can be used to couple rRNA removal with sequencing library preparation
Cesium chloride  FisherScientific BP1595-500
Hexadecytrimethyl-ammonium bromide (CTAB) Sigma-Aldrich H5882-100G
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Lim, Y. W., Haynes, M., Furlan, M., Robertson, C. E., Harris, J. K., Rohwer, F. Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples. J. Vis. Exp. (94), e52117, doi:10.3791/52117 (2014).
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