Transfection יעיל ביותר של של אדם המקרופאגים THP-1 על ידי nucleofection
Summary
פרוטוקול זה מציג שיטה יעילה ואמינה לtransfect מקרופאגים THP-1 אנושיים עם siRNA או DNA פלסמיד על ידי electroporation עם יעילות transfection גבוהה תוך שמירה על חיוניות תא גבוהה ויכולת מקרופאג מלאה לבידול וקיטוב.
Abstract
המקרופאגים, כשחקני מפתח של תגובת החיסון המולדת, נמצאים במוקד של מחקר העוסק בהומאוסטזיס רקמה או פתולוגיות שונות. Transfection עם siRNA ופלסמיד דנ"א הוא כלי יעיל לחקר תפקודם, אבל transfection של מקרופאגים הוא לא דבר טריוויאלי. למרות גישות רבות ושונות לtransfection של תאים האיקריוטים זמינות, רק מעטים מאפשרים transfection אמין והיעיל של מקרופאגים, אבל חיוניות תא מופחתת וקשה שעברה שינוי התנהגות תא כמו יכולת מופחתת לבידול או קיטוב נצפה לעתים קרובות. לכן נדרש פרוטוקול transfection כי הוא מסוגל להעביר siRNA ופלסמיד דנ"א לתוך מקרופאגים מבלי לגרום לתופעות לוואי רציניות ובכך מאפשרות החקירה של ההשפעה של siRNA או פלסמיד בהקשר של נורמלי התנהגות תא. הפרוטוקול המובא כאן מספק שיטה לאמינות וביעילות transfecting THP-1 מקרופאגים אנושיים ומוnocytes עם חיוניות גבוהה תא, יעילות transfection גבוהה, והשפעות מינימליות על התנהגות תא. גישה זו מבוססת על nucleofection והפרוטוקול כבר מותאם כדי לשמור על היכולת המרבית לתא הפעלה לאחר transfection. הפרוטוקול הוא נאות לתאים חסיד לאחר הניתוק, כמו גם תאים בתרחיף, וניתן להשתמש בם לקטנות למספרים לדוגמה בינוניות. לפיכך, השיטה המוצגת היא שימושית לחקירת השפעות רגולציה גנים במהלך בידול מקרופאג וקיטוב. מלבד הצגת תוצאות אפיון מקרופאגים transfected על פי פרוטוקול זה, בהשוואה לשיטה כימית חלופית, את ההשפעה של בחירת מדיום תרבות תא לאחר transfection בהתנהגות תא גם דנה. הנתונים שהוצגו מצביעים על החשיבות של אימות הבחירה להגדרות ניסוי שונות.
Introduction
בין המרכיבים התאיים של מערכת החיסון האנושית, מקרופאגים הם בעלי חשיבות רבה לתגובה החיסונית המולדת. משימותיהם שונות; הם מעורבים בphagocytosis של פתוגנים וחומר נימקי, הם משחקים תפקיד חשוב בהומאוסטזיס רקמה ולייצר ולהפריש כמות גדולה של ציטוקינים להסדיר ולתאם את התגובה החיסונית 1. לכן מקרופאגים, היו מעורבים בתהליכים פיסיולוגיים רבים ותנאי pathophysiological. בשל הגיוון של משימותיהם, מקרופאגים הם סוג תא מאוד הטרוגנית ורב פנים. זו מושגת על ידי קיטובים שונים; בהתאם למקרופאגים גירויים חיצוניים יכול להתפתח לפנוטיפים שונים 2. השתנות 'מקרופאגים והשפעה על התגובה החיסונית לגרום להם נושא מחקר מעניין מאוד. על מנת להבהיר את חילוף החומרים שלהם מורכבים ופונקציות רגולציה, מקרופאג המתאים במודלים חוץ גופית הוא required שבצורה נכונה משקף את ההטרוגניות מקרופאג והשתנות.
Transfection של תאים עם וקטורי פלסמיד דנ"א או RNAs התערבות קטן (siRNAs) כדי לשנות את ביטוי הגנים סלולארי הפך לכלי בשימוש וחזק באופן נרחב בביולוגיה של תא לחקירת שתי ויסות הגנים ותפקוד גן. כיום יש מבחר גדול של כלים שונים זמינים עבור transfection של תאים האיקריוטים. כלים אלה כוללים יישום של וקטורים ויראליים, שיטות מכאניות (כגון רובי גן), גישות כימיות (אשר מסתמכות על פולימרים או שומנים שיכולים ליצור קומפלקסים עם חומצות גרעין), וelectroporation של תאים 3. כל הגישות הללו יש יתרונות וחסרונות שלהם והבחירה המתאימה ביותר ממגוון רחב זה לסוג תא מסוים ויישום יכולה להיות תהליך גוזל קשה וזמן.
המקרופאגים הם קשים לtransfect transfe כמו כמעט כל מבוסס היטבגישות ction להפחית באופן דרסטי את הכדאיות 'מקרופאגים או להפריע להתנהגות שלהם, כלומר אבחנה ובקיטוב מסוים. לכן, אנו מציגים כאן פרוטוקול יעיל, שאינו נגיפי לtransfect מקרופאגים THP-1 האנושיים באמצעות טכנולוגית Nucleofector מבוססת electroporation, המייצגת את גישת electroporation מותאמת הדורשת כמויות מופחתות של DNA. Nucleofection מתאים היטב לתאים רגישים כגון מונוציטים ומקרופאגים. פרוטוקול זה הוא עיבוד של גרסאות שפורסמו בעבר 4,5.
בקיצור, phorbol 13 יצטט 12 myristate (PMA) משמש כדי להבדיל מונוציטים THP-1 בבני אדם ל48 שעות לתוך מקרופאגים מוקדמים לפני transfection עם siRNA או פלסמיד דנ"א. לtransfection מקרופאגים predifferentiated מנותקים אנזימים ידי Accutase אני טיפול. Transfection מתבצע באמצעות מכשיר 2b Nucleofector electroporation של התאים. לאחר transfection, שונהentiation הוא המשיך ל24 עד 48 שעות נוספות כנדרש. לבסוף, מקרופאגים transfected הבוגרים מודגרת עם סוגים שונים של תרכובות ללימודים פונקציונליים שונים.
גישה זו מאפשרת לtransfection של שורות תאים כגון מונוציטים THP-1 אנושיים ומקרופאגים ויושמה בהצלחה ב6-10 העבר. בניגוד לרוב גישות transfection הכימי, הליך nucleofection שונה שלנו באמצעות מקרופאגים מוקדמים מניב יעילה transfection גבוהה בשילוב עם כדאיות תא שאינו פגומות, ללא הצורך להשתמש בוקטורים ויראליים או להוסיף תרכובות מוביל נוספות עם תופעות לוואי ידועים. בנוסף, מקרופאגים לשמור את הפוטנציאל שלהם מלא לבידול, כמו גם קיטוב ובכך מאפשרים חקירות פונקציונליות ללא הפרעה הבאה transfection 11.
יתר על כן, מדיום תרבות התא מיושם לאחר nucleofection מאוד משפיע מחקרים תפקודיים tran הבאsfection; בפרט, היכולת 'מקרופאגים לקיטוב יכולה להיות מושפעת בהתאם למדיום התרבות מיושם. הנה ארבעה סוגים שונים של תקשורת בתרבות התא (IMDM, X-VIVO 20, בינוני Nucleofector סלולארי LGM3 ועכבר T) נבדקו בתנאי כיבוי באמצעות interleukin (IL) 10. השימוש THP-1 מקרופאגים, שציינו כי היענות תא לIL10 היא החזק ביותר כאשר בינוני Nucleofector הנייד העכבר T משמש בהשוואה לתקשורת והתרבות האחרות שהוזכר לעיל. תוצאות אלו מראות כי אופטימיזציה המתאימה של כל תנאי תרבית התאים חיונית ללימודים פונקציונליים הבאים und transfection המוצלח כמו אלה עשויים לשפר באופן משמעותי את תוצאות ניסוי.
כמקרופאגים מעורבים במחלות אנושיות שונות, הרבה מחקר מתמקד בהבהרת התנהגות מקרופאג כמו גם מנגנוני ויסות משפיעים מקרופאגים או בתורו נשלטו על ידי מקרופאגים. לכן, פרוטוקול זה הוא רלוונטי בתחומי מחקר רבים ושונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מציג דרך אמינה ויעילה לtransfect THP-1 מקרופאגים אשר בדרך כלל די קשים transfect. Transfection ניתן להשיג עם יעילות transfection של 90% מעל לsiRNA ללא הפחתה משמעותית של חיוניות תא. יעילות לפלסמידים עשויה להיות פחות בשל יעילות הגודל אבל transfection של כ -70% בדרך כלל ניתן להשיג. היעילות של מציאה בתיווך siRNA יכולה להגיע 80 90% בהתאם לsiRNA מיושם. יתרון עיקרי של פרוטוקול זה הוא שזה לא מפריע להתמיינות תאים. לאחר transfection התאים עדיין מגיבים בדרך כלל לסוכן בידול (איור 1 א ל1B ואיור 4) PMA 12. בקיטוב סלולארי בנוסף על ידי גירויי ציטוקינים כגון IL10 או LPS / IFNγ הוא 12 מושפעים, אם כי זה גם תלוי במידה רבה במדיום שנבחר לטיפוח לאחר transfections מוצג באיור 4.
ישנן מספר אפשרויות בהליך שיכול להיות שונה כדי להתאים את הפרוטוקול לדרישות ספציפיות. כפי שניתן לראות באיור 4 התאים מגיבים באופן שונה לאותו הגירוי IL10 תלוי במדיום התרבות שנבחר לאחר transfection. זה מצביע על כך שיש בהרכב הבינוני השפעה חזקה על התנהגות סלולרית. כאפקט שהוטל על ידי המדיום עשוי להיות שונה לגירויים ניסיוניים שונים, זה אפשרי, כי המדיום האופטימלי עשוי להשתנות ולכן יש צורך לבדוק את התאמתו של המדיום לניסויים שונים באופן עצמאי. עם זאת בינוני RPMI-1640, המהווה את ברירת המחדל 'בינוני המשמש לטיפוח THP-1 תאים, הוכיח את עצמו לא מתאים לעיבוד חקלאי לאחר transfection כהפסד משמעותי בחיוניות תא נצפה. יתר על כן הפרוטוקול יכול להיות מיושם גם לTHP-1 מונוציטים ללא בידול מושרה PMA לפני, זהברור שמסיר את הצורך בניתוק תא במהלך ההליך, אבל אין לי כל השלבים הנותרים להיות מותאמים. יכולים להיות מובחנים מונוציטים THP-1 לאחר מכן במידת צורך.
האלמנטים הקריטיים ביותר של הפרוטוקול הם קודם כל הניתוק ושנית הזמן הנדרש לtransfection. הניתוק חייב להתבצע בעדינות ככל האפשר, על מנת לשמור על כדאיות תא גבוהות. לכן אנו ממליצים על הניתוק האנזימטית יחסית קל על ידי Accutase עליי שיטות די אגרסיביות כגון trypsinization. שיטות ניתוק נוספות כגון טיפול בLidocain או גירוד נמצאו ולא מזיקה ולא אמור לשמש. במקרה ש30 דקות של Accutase אני טיפול לא צריכה להיות מספיק כדי לנתק את כל התאים כמו שצריך זה הוא בדרך כלל אינדיקציה לאופן שגוי מאוחסן או שפג תוקף פתרון Accutase אני או של להקפיא להפשיר מחזורים רבים מדי. יש לנו להשיג תוצאות טובות על ידי אחסון aliquots הקטנים של Accutase אני ב-20 °C כדי להפחית את מספר מחזורי ההפשרה הקפאה. עם זאת, כאשר יש ניתוק מספק או להחליף Accutase אני עם Accutase הטרי או להגדיל את זמן דגירה עד שעה 1. בהקשה עדינה בנוסף או שטיפה של הבקבוק או צלחת יכול לסייע ניתוק. לגבי הזמן הדרוש לtransfection את זמן החשיפה של התאים לפתרון Nucleofector טהור יש לי השפעה גבוהה על הישרדות תא ובכך צריך להיות קצר ככל האפשר. הדרך הטובה ביותר להשיג זאת היא לבצע כל transfection בכל פעם (2.10-2.15 השלבים) ולא transfections מרובה במקביל.
אם יעילות מציאה היא נמוכה, זה בדרך כלל לא נגרם על ידי יעילות transfection נמוכה, אבל זה יכול להיות מאומת בקלות באמצעות cytometry זרימה או מיקרוסקופ פלואורסצנטי ושכותרתו fluorescently siRNA או פלסמיד קידוד GFP. בעיקר הסיבה היא DNA siRNA או פלסמיד לא יעיל. בנסיבות אלה יש לשקול להגדיל (עד 2-3 מיקרוגרם) הסכום של siRNA אופלסמיד דנ"א (עד 1-2 מיקרוגרם) או להשתמש וקטור siRNA או ביטוי שונה אם הוא זמין. לחלופין, תוצאות משביעות רצון יכולות גם להיות מושגת על ידי שימוש בברכה של כמה siRNAs שונה המכוונים נגד אותו היעד. יתר על כן, ניסויים כמובן זמן ייתכן שיהיו צורך לקבוע את התקופה של אפקט מקסימאלי, שהוא בדרך כלל הגיע לאחר 24 עד 72 שעות לאחר transfection במדויק.
מלבד transfection ידי electroporation יש עוד טכניקות מבוססות היטב על transfection של תאי יונקים. לעתים קרובות מערכות מיושמות סוכני transfection כימיים אשר יכולה ליצור קומפלקסים עם חומצות גרעין מטען ולאחר מכן להקל על התחבורה אל תוך התאים. הנפוץ ביותר ריאגנטים מבוססים גם על מיני שומנים שונים או ניתן לבחור ממספר של הפולימרים קטיוני 3. עבור שני גישות מבחר מגוון זמין באופן מסחרי. ריאגנטים transfection אלה מציעים יתרון שהם בדרך כללקל לשימוש, אינו דורש הרבה זמן, ולעבוד עם תאים חסיד, כמו גם, ובכך להסיר את הצורך בניתוק. לרוע המזל, מקרופאגים הם די קשים transfect בשיטות אלה כפי שהם אינם מתרבים באופן משמעותי במבחנה ויש מנגנוני הגנה מכוונים נגד DNA cytosolic הזר 13-15. לפיכך, גישות transfection הכימי לעתים קרובות לגרום לירידה חמורה ביכולת הקיום של תאים. עם זאת, כפי שמוצג באיור 2 יש סוכני transfection כימיים אשר יכול להעביר בהצלחה siRNA לתוך מקרופאגים, אלא כזרימה cytometric (איור 2 א) ומיקרוסקופי ניאון (איור 2) מניתוחי הם לא מצליחים להשיג את אותה חלוקה הומוגנית של siRNA בתוך התאים כ מתקבל על ידי nucleofection. למעשה, נתוני הזרימה cytometric, עולים כי שתי אוכלוסיות שונות של תאי transfected להתרחש, קודם כל אוכלוסייה עם הקרינה דומה לזו של תאים לאחר Nucleofectiבמזוהה ושנית יש אוכלוסייה עם הקרינה חזקה יותר. אישור ברור עדיין נדרש אבל אנחנו מניח שהאוכלוסייה הראשונה היא במיקרוסקופ פלואורסצנטי הזהה לאלה תאים שמראים חלוקה הומוגנית של siRNA ניאון בתוך cytosol בעוד האוכלוסייה השנייה צפויה תואמת את התאים עם agglomerates בהיר מאוד. נתוני הזרימה cytometric שמוצגים באיור 2 א עולים כי תוצאות nucleofection בפחות siRNA לכל תא מגישת lipofection החלופית. עם זאת הנתונים בתרשים 3 מראה כי אפילו הכמות הקטנה יחסית של siRNA שולבה על ידי nucleofection היא כבר מספיק ל80 עד 90 מציאה% מגן המטרה. לכן הסכום נוסף של siRNA שולב על ידי האוכלוסייה השנייה לאחר transfection הכימי סביר מאוד עודף ולכן סיכוי גבוה יותר לגרום לתופעות לוואי לא רצויים מאשר לעלייה נוספת יעילות מציאה. חוץ מזה היווצרות של agglomerates תאיים היא כבר לא רצויה בעצמו מאז מולקולות siRNA אלה הן כנראה לא פונקציונליים או לפחות פחות יעיל מאשר מולקולות siRNA חופשיות ועלולה לגרום לתופעות את היעד. יתר על כן טבעו האמיתי של agglomerates אלה עדיין לא ברור. יתכן כי כתמים אלה בהירים מייצגים endosomes מצביע על כך שsiRNA הופנם על ידי התאים אך לאחר מכן לשחרר מendosomes נכשל וsiRNA נותר לכוד ולכן לא יעיל. לחלופין הכתמים יכולים להיות agglomerates אשר נוצרים intracellularly. הערכות תפקודיות של transfection הכימי תלויות ועומדות, ולכן אין הצהרות חד משמעיות על יעילות מציאה יכולות להתבצע עדיין, עדיין קיומם של שתי אוכלוסיות מובחנות הוא כבר שלילי כמו זה אומר שכל התוצאות לתאר הממוצעת של שני האוכלוסיות, זה לכן לא מתאים ל אחת מהאוכלוסיות. מסיבה זו nucleofection הוא הגישה מעולה.
<p clהתחת = "jove_content"> ובכל זאת יש גם מגבלות להליך transfection המתוארים כאן. מאז התאים צריכים להיות בהשעיה לתאים חסיד nucleofection צריכים להיות מנותקים, המציג גורם לחץ נוסף לתאים. יתר על כן כל הפרוטוקול זמן רב למדי. מאז לא ניתן לבצע בו זמנית transfections, אך יש לבצע במהירות על מנת למנוע נזק לתאים, במספר הדגימות מוגבל לכ 8 – 10 לכל ניסוי. לפיכך, פרוטוקול זה אינו מתאים לפרויקטי הקרנת תפוקה גבוהה. עבור יישומי תפוקה גבוהים מערכות Nucleofector שונות זמינות. ראשית, יש את מערכת 4D-Nucleofector שמציעה פורמט רצועה 16 גם. עבור תפוקה גדולה עוד יותר, יש מערכת הסעות 96 היטב ומערכת HT Nucleofector 384 גם. עם זאת כפי שמערכות חדשות יותר אלה לעבוד עם אלקטרודות מוליך פולימר במקום אלומיניום ולכן תנאים חשמליים, תוכניות כלומר ויערותition של פתרון Nucleofector, השתנה בהתאם, זה צריך להיקבע אם הפרוטוקול שלנו יכול להיות מועבר למערכות אלה.עם זאת, למרות מגבלות אלה הפרוטוקול מובא כאן אינו להניב transfection אמין והיעיל של THP-1 תאים אשר הוא עדיף על כל הגישות שאינן נגיפיות האחרות. פרוטוקול זה מאפשר החקירה של האפקטים של ביטוי גנים שעבר שינוי בתאי THP-1, אשר להבדיל ובכל ההיבטים האחרים לקטב בדרך כלל ובכך להראות מעט תופעות לוואי כמו של transfection ככל האפשר.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לLonza גרופ בע"מ להנותנים חסות פרסום זה על ידי כיסוי עלויות הפרסום. אנו מודים לדויטשה Infarktforschungshilfe, וילהלם-Vaillant-Stiftung, ארנסט-סולביי-Stiftung, וMinisterium Thuringer für Bildung, דעם und Kultur לתמיכה כספית לSL.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Accutase I | Sigma-Aldrich | A6964 | |
| Amino acids, nonessential | PAA | M11-003 | |
| Centrifuge tubes (15 ml) | TPP | TPP91015 | |
| Fetal calf serum (FCS gold) | PAA | A15-151 | |
| Human Monocyte Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1007 | Contains Nucleofector Solution, cuvettes and Pasteur pipettes |
| Human serum off the clot | Lonza | C11-020 | |
| Isove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) with 25 mM HEPES and 25 mM L-glutamine | Lonza | 12-722F | |
| Lymphocyte Growth Medium 3 (LGM3) | Lonza | CC-3211 | |
| Mouse T Cell Nucleofector Medium | Lonza | VZB-1001 | |
| Nucleofector 2b | Lonza | AAD-1001 | |
| Penicillin / Streptomycin / L-glutamine (100×) | Sigma-Aldrich | G1146 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Fisher Scientific | BP685 | |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI 1640) | PAA | E15-840 | |
| siRNA / plasmid | |||
| Sodium pyruvate (100 mM) | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| THP-1 human leukemia monocytes | CLS | 300356 | |
| Tissue culture flasks (75 cm²; 150 cm²) | TPP | TPP90076/TPP90151 | |
| Tissue culture plates (6-well; 12-well) | TPP | TPP92406/TPP92012 | |
| Tubes (1.5 ml) | StarLab | S 1615-5500 | |
| Water (nuclease-free) or appropriate siRNA/plasmid buffer | |||
| X-Vivo 20 with Gentamycin | Lonza | BE04-448Q | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 |
References
- Ricardo, S. D., van Goor, H., Eddy, A. A. Macrophage diversity in renal injury and repair. J Clin Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
- Morille, M., Passirani, C., Vonarbourg, A., Clavreul, A., Benoit, J. P. Progress in developing cationic vectors for non-viral systemic gene therapy against cancer. Biomaterials. (24-25), 3477-3496 (2008).
- Schnoor, M., et al. Efficient non-viral transfection of THP-1 cells. J Immunol Methods. 344 (2), 109-115 (2009).
- Maeß, M. B., Buers, I., Robenek, H., Lorkowski, S. Improved protocol for efficient nonviral transfection of premature THP-1 macrophages. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (5), (2011).
- Ma, W., Liu, Y., Ellison, N., Shen, J. Induction of C-X-C chemokine receptor type 7 (CXCR7) switches stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling and phagocytic activity in macrophages linked to atherosclerosis. J Biol Chem. 288 (22), 15481-15494 (2013).
- Xie, Q., et al. Cell surface localization of ABCG1 does not require LXR activation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26 (11), 143-144 (2006).
- Buers, I., Robenek, H., Lorkowski, S., Nitschke, Y., Severs, N. J., Hofnagel, O. TIP47, a lipid cargo protein involved in macrophage triglyceride metabolism. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (5), 767-773 (2009).
- Robenek, H., Buers, I., Hofnagel, O., Lorkowski, S., Severs, N. J. GFP-tagged proteins visualized by freeze-fracture immuno-electron microscopy: A new tool in cellular and molecular medicine. J Cell Mol Med. 13 (7), 1381-1390 (2009).
- Guh, J. H., et al. Development of novel adenosine monophosphate-activated protein kinase activators. J Med Chem. 53 (6), 2552-2561 (2010).
- Park, E. K., Jung, H. S., Yang, H. I., Yoo, M. C., Kim, C., Kim, K. S. Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli. Inflamm Res. 56 (1), 45-50 (2007).
- Maeß, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli. J Immunol Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).
- Angosto, D., et al. Evolution of inflammasome functions in vertebrates: Inflammasome and caspase-1 trigger fish macrophage cell death but are dispensable for the processing of IL-1b. Innate Immun. 18 (6), 815-824 (2012).
- Latz, E., Xiao, T. S., Stutz, A. Activation and regulation of the inflammasomes. Nat Rev Immunol. 13 (6), 397-411 (2013).
- Muruve, D. A., et al. The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response. Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).
