Hocheffiziente Transfektion von humanen THP-1 Makrophagen durch Nucleofection
Summary
Dieses Protokoll stellt ein effizientes und zuverlässiges Verfahren zum humanen THP-1 Makrophagen mit siRNA oder Plasmid-DNA durch Elektroporation mit hohen Transfektionseffizienz transfizieren während eine hohe Vitalität der Zellen und Makrophagen volle Kapazität für die Differenzierung und Polarisation.
Abstract
Makrophagen, als wichtige Akteure der angeborenen Immunantwort, stehen im Fokus der Forschung, die sich mit Gewebshomöostase oder verschiedenen Pathologien. Transfektion mit siRNA und Plasmid-DNA ist ein effizientes Werkzeug für das Studium ihrer Funktion, aber die Transfektion von Makrophagen ist keine triviale Angelegenheit. Obwohl viele verschiedene Ansätze für die Transfektion von eukaryontischen Zellen zur Verfügung stehen, nur wenige erlauben zuverlässige und effiziente Transfektion von Makrophagen, sondern reduziert Zellvitalität und stark veränderten Zellverhalten wie verminderte Fähigkeit zur Differenzierung oder Polarisations werden häufig beobachtet. Daher ist eine Transfektion Protokoll benötigt, geeignet zur Übertragung von siRNA und Plasmid-DNA in Makrophagen ohne ernsthafte Nebenwirkungen so dass die Untersuchung der Wirkung der siRNA oder Plasmid im Rahmen der normalen Zellverhalten. Die hier vorgestellten Protokoll liefert ein Verfahren zum zuverlässigen und effizienten Transfektion von humanen THP-1 Makrophagen und Monocytes mit hoher Zellvitalität, hohe Transfektionseffizienz und minimale Auswirkungen auf das Verhalten der Zelle. Dieser Ansatz basiert auf der Grundlage Nucleofection und das Protokoll wurde optimiert, um eine maximale Leistungsfähigkeit für Zell-Aktivierung nach der Transfektion zu erhalten. Das Protokoll ist ausreichend für adhärente Zellen nach dem Ablösen sowie Zellen in Suspension, und kann für kleine bis mittlere Probennummern verwendet werden. Somit ist das vorgestellte Verfahren nützlich zur Untersuchung von Gen-regulatorische Effekte im Makrophagendifferenzierung und Polarisation. Neben der Präsentation Ergebnisse der Charakterisierung Makrophagen nach diesem Protokoll im Vergleich zu einer alternativen chemischen Verfahren transfiziert, wird der Einfluss der Zellkulturmedium Auswahl nach der Transfektion auf das Zellverhalten diskutiert. Die vorgestellten Daten zeigen die Bedeutung der Validierung der Auswahl für verschiedene Versuchsanordnungen.
Introduction
Unter den zellulären Komponenten des Immunsystems sind Makrophagen von großer Bedeutung für die angeborene Immunantwort. Ihre Aufgaben sind vielfältig; sie in die Phagozytose von Pathogenen und nekrotischen Materials beteiligt sind, spielen sie eine wichtige Rolle bei der Gewebe Homöostase und produzieren und sezernieren eine Vielzahl von Zytokinen zu regulieren und zu orchestrieren die Immunantwort ein. Daher Makrophagen integral in vielen physiologischen Prozessen und pathophysiologischen Bedingungen beteiligt. Aufgrund der Vielfalt ihrer Aufgaben sind Makrophagen eine sehr heterogene und vielfältige Zelltyp. Dies wird durch unterschiedliche Polarisationen erreicht; abhängig von äußeren Reizen Makrophagen kann in verschiedene Phänotypen 2 zu entwickeln. Makrophagen Variabilität und Einfluss auf die Immunantwort machen sie zu einem sehr interessanten Forschungsgegenstand. Um ihre komplexe Stoffwechsel-und Regulierungsfunktionen sollte Makrophagen in vitro-Modelle aufzuklären sind required die korrekt widerspiegeln Makrophagen Heterogenität und Variabilität.
Transfektion von Zellen mit Plasmid-DNA-Vektoren oder small interfering RNAs (siRNAs), um zelluläre Genexpression zu verändern hat sich zu einem weit verbreiteten und leistungsfähiges Werkzeug in der Zellbiologie zur Untersuchung sowohl der Genregulation und Genfunktion. Derzeit gibt es eine große Auswahl an verschiedenen Tools für die Transfektion von eukaryontischen Zellen zur Verfügung. Diese Werkzeuge umfassen die Anwendung von viralen Vektoren, mechanische Verfahren (wie Genpistolen), chemische Ansätze (die auf Polymeren oder Lipide, die Komplexe mit Nukleinsäuren zu bilden, verlassen können), und die Elektroporation von Zellen 3. Alle diese Ansätze haben ihre Vorteile und Nachteile, und die Auswahl der am besten aus dieser Vielzahl für einen bestimmten Zelltyp und Anwendung kann eine schwierige und zeitraubender Prozess sein.
Makrophagen sind notorisch schwierig, da fast alle etablierten transfe Transfektionction Ansätze Makrophagen Lebensfähigkeit drastisch zu reduzieren oder zu stören mit ihrem Verhalten, dh Differenzierung und insbesondere Polarisation. Deshalb präsentieren wir hier eine effiziente, nicht-virale Protokoll der menschlichen THP-1-Makrophagen mit Hilfe der Elektroporation basierenden Nucleofector-Technologie, die eine optimierte Elektroporation Vorgehen erfordern geringere Mengen von DNA stellt transfizieren. Für empfindliche Zellen, wie Monozyten und Makrophagen Nukleofektion gut geeignet ist. Dieses Protokoll ist eine Anpassung der bisher veröffentlichten Versionen 4,5.
Kurz, Phorbol 12-Myristat-13-Acetat (PMA) verwendet, um menschliche THP-1 Monozyten für 48 h in eine vorzeitige Makrophagen vor der Transfektion mit siRNA oder Plasmid-DNA zu unterscheiden. Für die Transfektion die prädifferenziert Makrophagen werden enzymatisch durch Behandlung Accutase ich abgelöst. Die Transfektion wird unter Verwendung einer Nucleofector 2b Vorrichtung zur Elektroporation der Zellen. Nach der Transfektion unterscheidenzierung wird weitere 24 bis 48 Stunden fortgesetzt, wie erforderlich. Schließlich werden reife Makrophagen transfiziert mit verschiedenen Arten von Verbindungen für funktionelle Studien inkubiert.
Dieser Ansatz erlaubt die Transfektion von Zelllinien, wie humanen THP-1 Monozyten und Makrophagen und wurde in der Vergangenheit erfolgreich angewendet 6-10. Im Gegensatz zu den meisten chemischen Transfektion Ansätze ergibt unserer modifizierten Nucleofection Verfahren mit vorzeitiger Makrophagen hohe Transfektionseffizienzen in Kombination mit der Lebensfähigkeit der Zellen nicht beeinträchtigt, ohne dass virale Vektoren verwenden oder weitere Träger Verbindungen mit unbekannten Nebenwirkungen. Darüber hinaus sind die Makrophagen behalten ihre volle Potenzial zur Differenzierung sowie Polarisierung so dass ungehindert funktionelle Untersuchungen nach der Transfektion 11.
Darüber hinaus sind die nach Nucleofection angewendet Zellkulturmedium stark beeinflusst funktionelle Studien folgende transfection; Insbesondere kann die Fähigkeit der Makrophagen zur Polarisation in Abhängigkeit von der angewandten Kulturmedium beeinflusst. Hier vier verschiedene Arten von Zellkulturmedien (IMDM, X-VIVO 20, LGM3 und Maus-T-Zellen Nucleofector Medium) wurden unter Deaktivierung Bedingungen mit Interleukin getestet (IL) 10. Mit THP-1-Makrophagen, beobachteten wir, dass Zellen gegenüber IL10 ist am stärksten, wenn der Maus-T-Zell-Nucleofector Medium im Vergleich zu den anderen oben erwähnten Kulturmedien verwendet. Diese Ergebnisse zeigen, dass entsprechende Optimierung aller Zellkulturbedingungen notwendig für eine erfolgreiche Transfektion und anschließende funktionelle Untersuchungen, da diese deutlich experimentellen Ergebnisse zu verbessern.
Makrophagen sind in verschiedenen menschlichen Krankheiten beteiligt sind, wird viel Forschung auf Aufklärung Makrophagen Verhalten sowie regulative Mechanismen beeinflussen Makrophagen oder wiederum durch Makrophagen gesteuert konzentriert. Daher ist von Bedeutung dieses Protokoll invielen verschiedenen Forschungsbereichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll stellt eine zuverlässige und effiziente Weise zu THP-1 Makrophagen, die in der Regel sehr schwierig zu transfizieren sind, zu transfizieren. Transfektion mit Transfektionseffizienzen von über 90% für siRNA ohne signifikante Reduktion der Zellvitalität erreicht werden. Wirkungsgrade für Plasmide können weniger aufgrund ihrer Größe aber Transfektionseffizienzen von 70% kann in der Regel erreicht werden kann. Die Effizienz der siRNA-vermittelten Zuschlags kann 80 bis 90% zu erreichen, abhängig von der angelegten siRNA. Ein Hauptvorteil des Protokolls ist, dass es nicht mit der Zelldifferenzierung beeinflussen. Nach der Transfektion werden die Zellen normalerweise reagiert noch mit dem Differenzierungsmittel PMA (1A bis 1B und Figur 4) 12. Zusätzlich zellulären Polarisation durch Cytokin Reize wie IL10 oder LPS / IFN unbeeinflußt 12, obwohl dieser auch stark abhängig von der für die Kultivierung nach der Transfektion ein ausgewähltes MediumS in Abbildung 4 dargestellt.
Es gibt mehrere Optionen, die in dem Verfahren, um das Protokoll an spezifische Anforderungen anzupassen geändert werden kann. Wie in 4 gezeigt, die Zellen reagieren unterschiedlich auf die gleiche IL10 Stimulus in Abhängigkeit von der nach der Transfektion ausgewählten Kulturmedium. Dies zeigt, dass die mittlere Zusammensetzung hat starken Einfluss auf das Zellverhalten. Da der Effekt, der durch das Medium auferlegt könnte für verschiedene experimentelle Stimuli unterscheiden, ist es möglich, dass die optimale Medium ändern kann und daher ist es notwendig, um die Eignung des Mediums für verschiedene Experimente unabhängig zu überprüfen. Jedoch ist die RPMI-1640-Medium, dem Standardmedium für die Kultivierung von THP-1-Zellen verwendet wird, hat sich als ungeeignet für die Kultivierung nach Transfektion als ein signifikanter Verlust in der Zellvitalität wurde beobachtet. Darüber hinaus kann das Protokoll auch auf THP-1 Monozyten ohne vorherige PMA-induzierte Differenzierung, in dem diese,offensichtlich entfällt die Zellablösung während des Verfahrens, aber alle übrigen Schritte müssen nicht eingestellt werden. Die THP-1 Monozyten kann danach, falls erforderlich, zu unterscheiden.
Die wichtigsten Elemente des Protokolls sind zum einen die Ablösung und zweitens die Zeit, die für die Transfektion notwendig. Die Ablösung muss so schonend wie möglich durchgeführt werden, um eine hohe Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten. Daher empfehlen wir die vergleichsweise milden enzymatischen Ablösung von Accutase ich über ziemlich aggressiv Methoden wie Trypsinierung. Weitere Ablösung Methoden wie Behandlung mit Lidocain oder Schaben gefunden eher schädlich sein und sollte nicht verwendet werden. Im Fall, dass 30 min Accutase ich sollte die Behandlung nicht ausreicht, um alle Zellen zu lösen sein richtig ist dies meist ein Hinweis auf falsch gelagert oder abgelaufen Accutase I-Lösung oder von zu vielen Frost-Tau-Zyklen. Wir haben gute Ergebnisse, indem kleine Teilmengen von Accutase ich bei -20 ° erhaltenC die Anzahl der Gefrier-Tau-Zyklen zu verringern. Allerdings, wenn es nicht genügend Distanz entweder ersetzen Accutase ich mit frischen Accutase oder erhöhen Inkubationszeit bis zu 1 Stunde. Zusätzlich leichtes Klopfen oder Spülen des Kolbens oder Platte Ablösung zu unterstützen. Hinsichtlich der erforderlichen Zeit für die Transfektion die Belichtungszeit der Zellen auf reine Nucleofector Lösung ist wichtig für das Überleben der Zellen erhielt und somit sollte so kurz wie möglich sein. Der beste Weg, dies zu erreichen, ist jede Transfektion zu einem Zeitpunkt (Schritte von 2,10 bis 2,15) und nicht mehrere Transfektionen parallel durchzuführen.
Wenn Knockdown Effizienz niedrig ist, dies in der Regel nicht durch niedrige Transfektionseffizienz verursacht wird, aber dies kann leicht unter Verwendung von Durchflusszytometrie oder Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen werden und fluoreszierend markierte siRNA oder ein GFP-kodierenden Plasmid. Meistens ist die Ursache eine ineffiziente siRNA oder Plasmid-DNA. Unter diesen Umständen ist zu berücksichtigen, die Menge an siRNA (bis zu 2-3 ug) zu erhöhen oderPlasmid-DNA (bis zu 1-2 ug) oder um eine andere siRNA oder Expressionsvektor, sofern diese verfügbar ist. Alternativ können zufriedenstellende Ergebnisse auch mit einem Pool von verschiedenen siRNAs gegen das gleiche Ziel gerichtet erreicht. Ferner könnte Zeitverlaufsexperimente erforderlich, um die Zeit der maximalen Wirkung, die in der Regel nach 24 bis 72 Stunden nach der Transfektion erreicht wird genau zu bestimmen.
Neben der Transfektion durch Elektroporation gibt es weitere etablierte Techniken zur Transfektion von Säugerzellen. Häufig verwendeten Systemen sind chemische Mittel, die Transfektion Komplexe mit der Ladung Nukleinsäure bilden kann und erleichtern den Transport in die Zellen. Die am häufigsten verwendeten Reagenzien sind entweder an verschiedenen Lipidarten basieren oder kann aus einer Reihe von kationischen Polymeren 3 gewählt werden. Für beide Ansätze eine vielfältige Auswahl im Handel erhältlich. Diese Transfektionsreagenzien bieten den Vorteil, dass sie in der Regeleinfach zu bedienen, brauchen nicht viel Zeit, und die Arbeit mit adhärenten Zellen als gut, so entfernt die Notwendigkeit für die Ablösung. Leider sind Makrophagen ziemlich schwierig, mit diesen Methoden transfizieren, da sie nicht wesentlich proliferieren in vitro und besitzen gegenüber ausländischen zytosolischen DNA 13-15 gerichtet Abwehrmechanismen. So chemische Transfektion Ansätze häufig zu einer starken Reduzierung der Lebensfähigkeit der Zellen. Jedoch, wie in 2 gezeigt, gibt es chemische Transfektionsmittel erfolgreich siRNA in Makrophagen übertragen kann, aber durchflusszytometrischen (2A) und Fluoreszenz-mikroskopische (2B) Analysen zeigen sie nicht die gleiche homogene Verteilung von siRNA in Zellen als erzielen von Nucleofection erhalten. In der Tat, die durchflusszytometrische Daten zeigen, daß zwei verschiedene Populationen von transfizierten Zellen auftreten, zunächst eine Population mit ähnlichen Fluoreszenz der Zellen nach Nucleofectiauf erfaßt und zweitens gibt es eine Population mit intensiver Fluoreszenz. Definite Bestätigung ist immer noch erforderlich, aber nehmen wir an, dass die erste Bevölkerung ist in der Fluoreszenzmikroskopie identisch mit jenen Zellen, die eine homogene Verteilung von fluoreszierenden siRNA im Cytosol zu zeigen, während die zweite Population wahrscheinlich entspricht den Zellen mit sehr hellen Agglomerate. Die in 2A gezeigt durchflusszytometrischen Daten legen nahe, dass Nukleofektion Ergebnisse in weniger siRNA pro Zelle als der alternative Ansatz Lipofektion. Jedoch werden die Daten in Abbildung 3 zeigt, dass auch die vergleichsweise geringe Menge von siRNA durch Nucleofection eingebaut ist bereits ausreichend für 80 bis 90% Knockdown des Zielgens. Deshalb ist die zusätzliche Menge von siRNA durch die zweite Population nach der chemischen Transfektion eingearbeitet ist sehr wahrscheinlich, Überschüsse und ist somit eher zu unerwünschten Nebenwirkungen als eine weitere Erhöhung Knockdown Effizienz führen. AnsonstenBildung von intrazellulären Agglomerate ist an sich schon unerwünscht, da diese siRNA-Moleküle sind wahrscheinlich nicht funktionsfähig oder zumindest weniger effizient als freie siRNA-Moleküle und kann dazu führen, vorbei Wirkungen. Ferner die wahre Natur dieser Agglomerate ist noch nicht klar. Es ist möglich, dass diese hellen Flecken stellen Endosomen darauf hinweist, dass die siRNA wurde von den Zellen internalisiert, aber anschließend Freisetzung aus den Endosomen ausgefallen und der siRNA bleibt gefangen und daher unwirksam. Alternativ könnten die Punkte Agglomerate die intrazellulär gebildet werden. Funktionsauswertungen der chemischen Transfektion anhängig, daher keine endgültigen Aussagen über Zuschlagseffizienz kann noch gemacht werden, noch die Existenz von zwei unterschiedlichen Populationen bereits ungünstig, da dies bedeutet, dass alle Ergebnisse beschreiben den Mittelwert der beiden Populationen, bedeutet dies also nicht zu entsprechen eine der Populationen. Aus diesem Grund ist die überlegene Nucleofection Ansatz.
<p class = "jove_content"> Trotzdem gibt es auch Einschränkungen bei der Transfektion Verfahren hier beschrieben. Da die Zellen in Suspension für Nucleofection adhärenten Zellen müssen entfernt werden, was einen zusätzlichen Stressfaktor für die Zellen zeigt. Darüber hinaus wird das gesamte Protokoll ist ziemlich zeitaufwendig. 10 pro Versuch – da Transfektionen können nicht gleichzeitig durchgeführt werden, sondern müssen, um Zellschäden zu vermeiden, schnell durchgeführt werden, wird die Anzahl der Proben, die etwa 8 begrenzt. Somit ist dieses Protokoll nicht für Hochdurchsatz-Screening-Projekten geeignet. Für Anwendungen mit hohem Durchsatz verschiedenen Nucleofector Systeme zur Verfügung. Zum einen gibt es das 4D-Nucleofector System, das eine 16 Well Streifen-Format bietet. Für noch größere Durchsatz, gibt es die 96-Loch-Shuttle-System und das 384er HT Nucleofector System. Doch als diese neueren Systeme arbeiten mit leitfähigen Polymer-Elektroden anstelle von Aluminium und damit elektrischen Bedingungen, dh Programme und Composition von Nucleofector Lösung, entsprechend geändert, bestimmt, ob unsere Protokoll kann auf diese Systeme übertragen werden können sie braucht.Doch trotz dieser Einschränkungen das Protokoll hier vorgestellte hat ergeben eine zuverlässige und effektive Transfektion von THP-1-Zellen, die besser als alle anderen nicht-virale Ansätze ist. Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung der Auswirkungen von Veränderungen der Genexpression in THP-1-Zellen, die in allen anderen Aspekten unterscheiden und zu polarisieren, und somit in der Regel wenig Nebenwirkungen der Transfektion wie möglich zu zeigen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind dankbar, dass Lonza Group AG für das Sponsoring, diese Veröffentlichung durch das Abdecken der Veröffentlichungskosten. Wir danken der Deutschen Infarktforschungshilfe, Wilhelm-Vaillant-Stiftung, Ernest-Solvay-Stiftung, und der Thüringer Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Kultur für die finanzielle Unterstützung, um SL.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Accutase I | Sigma-Aldrich | A6964 | |
| Amino acids, nonessential | PAA | M11-003 | |
| Centrifuge tubes (15 ml) | TPP | TPP91015 | |
| Fetal calf serum (FCS gold) | PAA | A15-151 | |
| Human Monocyte Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1007 | Contains Nucleofector Solution, cuvettes and Pasteur pipettes |
| Human serum off the clot | Lonza | C11-020 | |
| Isove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) with 25 mM HEPES and 25 mM L-glutamine | Lonza | 12-722F | |
| Lymphocyte Growth Medium 3 (LGM3) | Lonza | CC-3211 | |
| Mouse T Cell Nucleofector Medium | Lonza | VZB-1001 | |
| Nucleofector 2b | Lonza | AAD-1001 | |
| Penicillin / Streptomycin / L-glutamine (100×) | Sigma-Aldrich | G1146 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Fisher Scientific | BP685 | |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI 1640) | PAA | E15-840 | |
| siRNA / plasmid | |||
| Sodium pyruvate (100 mM) | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| THP-1 human leukemia monocytes | CLS | 300356 | |
| Tissue culture flasks (75 cm²; 150 cm²) | TPP | TPP90076/TPP90151 | |
| Tissue culture plates (6-well; 12-well) | TPP | TPP92406/TPP92012 | |
| Tubes (1.5 ml) | StarLab | S 1615-5500 | |
| Water (nuclease-free) or appropriate siRNA/plasmid buffer | |||
| X-Vivo 20 with Gentamycin | Lonza | BE04-448Q | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 |
References
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