ヌクレオによるヒトTHP-1マクロファージの高効率トランスフェクション
Summary
このプロトコルは、高い細胞活力と分化と偏光のための完全なマクロファージの容量を維持しつつ、高いトランスフェクション効率でエレクトロポレーションによってsiRNAまたはプラスミドDNAを用いたヒトTHP-1マクロファージをトランスフェクションするための効率的で信頼性の高い手法を提案する。
Abstract
マクロファージは、先天性免疫応答のキープレーヤーとして、組織の恒常性やさまざまな病状を扱う研究の焦点である。 siRNAおよびプラスミドDNAを用いたトランスフェクションは、それらの機能を研究するための効果的なツールですが、マクロファージのトランスフェクションは、些細な問題ではありません。真核細胞のトランスフェクションのための多くの異なったアプローチが利用可能であるが、わずか数は、マクロファージの信頼性と効率的なトランスフェクションが、減少した細胞の活力と頻繁に観察され、分化や偏光のために減少した能力のような深刻な改変された細胞の挙動を可能にする。従って、トランスフェクションプロトコールは、このように正常な細胞挙動の文脈におけるsiRNAの効果またはプラスミドの調査を可能にする重大な副作用を引き起こすことなく、マクロファージへのsiRNAおよびプラスミドDNAを伝達することが可能であることが要求される。ここに提示されたプロトコルは、確実かつ効率的にヒトTHP-1マクロファージおよびカをトランスフェクトするための方法を提供高い細胞活力、高いトランスフェクション効率、および細胞の挙動に最小限の影響でnocytes。このアプローチは、ヌクレオに基づいており、プロトコルは、トランスフェクション後、細胞活性化のための最大能力を維持するために最適化されている。プロトコルは、接着性剥離後の細胞ならびに懸濁液中の細胞のために適切であり、小型の媒体にサンプル番号のために使用することができる。このように、提示された方法は、マクロファージ分化と偏光の間に遺伝子調節の効果を調査するのに便利です。別に代替化学的方法と比較してこのプロトコルに従ってトランスフェクションしたマクロファージを特徴付ける結果を提示から、細胞の挙動上のトランスフェクション後の細胞培養培地の選択の影響も議論されている。提示されたデータは、さまざまな実験的な設定のための選択を検証することの重要性を示している。
Introduction
ヒト免疫系の細胞成分の中で、マクロファージは、先天性免疫応答のために非常に重要である。彼らのタスクは多様である。彼らは、組織恒常性において重要な役割を果たし、免疫応答1を調整し、調整するために多数のサイトカインを産生し、分泌し、病原体及び壊死物質の食作用に関与している。したがって、マクロファージは、一体的に、多くの生理学的プロセスおよび病態生理学的状態に関与している。それらの作業の多様性に、マクロファージは非常に異質で多面細胞型である。これは、異なる偏光によって達成される。外部刺激のマクロファージに応じて異なる表現型2内に開発することができます。免疫応答に対するマクロファージ '変動性と影響、それらは非常に興味深い研究対象にする。彼らの複雑な代謝および調節機能を解明するために、in vitroモデル内の適切なマクロファージはREQです正しくマクロファージの不均一や変動性を反映しているuired。
細胞遺伝子の発現を変更するために、プラスミドDNAベクターまたは小さな干渉RNA（siRNA）を用いた細胞のトランスフェクションは、遺伝子調節、遺伝子機能の両方を調査するための細胞生物学で広く使用される強力なツールとなっている。現在、真核細胞のトランスフェクションのための利用可能なさまざまなツールの大規模な選択があります。これらのツールは、（核酸と複合体を形成することができるポリマーまたは脂質に依存している）ウイルスベクター（例えば、遺伝子銃など）機械的方法、化学的ア プローチの適用、およびセル3のエレクトロポレーションが含まれる。これらのアプローチの全ては、それぞれの長所と短所があり、特定の細胞型およびアプリケーションのためにこの広い配列から最適なを選択することが困難で時間のかかるプロセスであることができる。
マクロファージは、ほぼすべての十分に確立されたtransfeをトランスフェクションが困難であることが知られてctionアプローチは大幅にマクロファージ'の生存率を低下させるか、その行動を妨害する、 すなわち分化及び特定の偏光における。したがって、ここではDNA量の減少を必要とする最適化されたエレクトロポレーションアプローチを表し、エレクトロポレーション、ヌクレオベース技術を用いてヒトTHP-1マクロファージをトランスフェクトするための効率的な、非ウイルス性プロトコルを提示する。クレオは、単球やマクロファージなどの感受性細胞に非常に適している。このプロトコルは、以前に公開されたバージョン4,5を最適化したものです。
要するに、ホルボール12 – ミリステート13 – アセテート（PMA）は、従来siRNAまたはプラスミドDNAでのトランスフェクションに未熟マクロファージへの48時間のヒトTHP-1単球を区別するために使用される。トランスフェクションのために未分化マクロファージのAccutase I処理により酵素的に切り離されている。トランスフェクションは、細胞のエレクトロポレーションのためのヌクレオ2bの装置を用いて行われる。トランスフェクションの後、異なる必要に応じてentiationは、別の24〜48時間継続される。最後に、成熟したトランスフェクトされたマクロファージは、機能的研究のための化合物の異なる種類と共にインキュベートする。
このアプローチは、ヒトTHP-1単球およびマクロファージのような細胞株のトランスフェクションを可能にし、正常に過去6-10に適用されている。ほとんどの化学的トランスフェクションアプローチとは対照的に、未熟マクロファージを使用して私たちの修正されたヌクレオ手順は、ウイルスベクターを使用するか、または未知の副作用がさらに担体化合物を添加する必要なしに、損なわれていない細胞の生存率と組み合わせた高トランスフェクション効率をもたらす。また、マクロファージは、このように、トランスフェクション11以下のスムーズな機能の調査を可能にするそれらの完全な差別化のための可能性だけでなく、偏光を保持します。
さらに、ヌクレオ後に適用細胞培地を強くトランに続く機能的研究に影響を与えsfection;特に、偏光のためのマクロファージの能力が適用培地に依存して影響を受ける可能性がある。ここで、細胞培養培地の4つの異なるタイプが（IMDM、X-VIVO 20、LGM3およびマウスT細胞のNucleofector培地）THP-1マクロファージを用いたインターロイキン（IL）10を用いて不活性化する条件下で試験した、私たちはIL10に対する細胞の応答性があることが観察さマウスT細胞のNucleofector媒体は、上述した他の培地と比較して使用される場合、最も強い。これらの結果は、これらが大幅に実験結果を改善することができるように、すべての細胞培養条件の適切な最適化が成功したトランスフェクションundの後続の機能的研究のために必須であることを示している。
マクロファージは、さまざまなヒト疾患に関与しているように、多くの研究が、マクロファージの行動だけでなく、マクロファージによって制御マクロファージまたは順番に影響を与える規制的なメカニズムの解明に焦点を当てています。したがって、このプロトコルは、で関連性がある多くの異なった研究分野。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで概説したプロトコルは、通常、トランスフェクションがかなり困難であるTHP-1マクロファージをトランスフェクトする信頼性の高い効率的な方法を提示します。トランスフェクションは、細胞の生命力の有意な減少なしにsiRNAの90％を超えるトランスフェクション効率を達成することができる。プラスミドについて効率は、そのサイズが少ないためであり得るが、70％程度のトランスフェクション効率は、通常、達成することができる。 siRNA媒介ノックダウンの効率は適用されたsiRNAに応じて百分の80から90まで到達することができます。このプロトコルの主な利点は、細胞分化を妨害しないことである。トランスフェクション後、細胞は、依然として12分化剤PMA（1Bと図4に図1A）に正常に応答。これはまた、トランスフェクションA後の培養のために選択された媒体に強く依存するが、加えて、そのようなIL10またはLPS /IFNγなどのサイトカインの刺激による細胞分極は、12影響を受けません図4に示す。■。
特定の要件にプロトコルを適合させるために修飾することができるプロシージャ内のいくつかのオプションがあります。 図4に示すように細胞をトランスフェクションした後、選択培地に応じて、同じIL10刺激に異なって反応する。これは培地組成が細胞挙動に強い影響を持っていることを示している。媒体によって課される効果は、さまざまな実験的な刺激のために異なるかもしれないので、それは最適な媒体が変更される可能性があることが可能であり、したがって、独立して、異なる実験のために培地の適合性を検証する必要がある。しかしながら、THP-1細胞の培養に使用されるデフォルトの媒体であるRPMI-1640培地は、細胞活力の有意な損失が観察されたように、トランスフェクション後の培養には不向きであることが証明された。さらに、プロトコルはまた、前のPMA誘導性分化せずにTHP-1単球に適用することができ、これを明らかに手順の間の細胞剥離の必要性を除去するが、残りのすべての手順を調整する必要はありません。必要に応じて、THP-1単球を、その後分化させることができる。
プロトコルの最も重要な要素は、まず、剥離および第二に、トランスフェクションのために必要な時間である。剥離が高い細胞生存率を維持するために、できるだけ穏やか行わなければならない。そこで私たちは、私のAccutaseオーバーなど、トリプシン処理として非常に攻撃的な方法によって、比較的温和な酵素脱離することをお勧めします。そのようなリドカインまたはスクレーピングによる治療などのさらなる剥離法は、むしろ有害であることが判明したため、使用しないでください。のAccutase I治療の30分すべての細胞を剥離するのに十分であるべきではない場合に正しく、これは通常、誤って格納されている、または期限切れのAccutase I溶液またはあまりにも多くの凍結融解サイクルの指標である。私たちは、-20°でのAccutase私の小さなアリコートを格納することにより、良好な結果を得たCは、凍結融解サイクルの回数を減少させる。しかし不十分な剥離新鮮なのAccutaseでのAccutase私を交換するか、1時間までのインキュベーション時間を増やすのいずれかがある場合もございます。加えて、フラスコまたはプレートを穏やかにタッピングやリンスを脱離を支援することができます。トランスフェクションのための必要な時間に関する純粋なヌクレオ溶液への細胞の曝露時間は、できるだけ短くする必要があり、したがって細胞の生存に大きな影響を持っている。これを達成する最良の方法は、時間並行して（ステップ2.10から2.15）ではなく、複数のトランスフェクションでのそれぞれのトランスフェクションを行うことである。
ノックダウン効率が低い場合、これは通常、低いトランスフェクション効率によるものではないが、これは容易にフローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡使用して検証し、蛍光標識siRNAまたはGFPをコードするプラスミドを標識することができる。大部分の原因は、非効率的なsiRNA又はプラスミドDNAである。これらの状況下では、（2-3μgのまで）siRNAの量を増加させるために考慮されるべきであるか（1-2μgのまで）プラスミドDNAまたは利用可能な場合は、別のsiRNAまたは発現ベクターを使用します。代替的に、満足な結果は、同じターゲットに対して向け複数の異なるsiRNAのプールを使用することによって達成され得る。さらに、経時変化実験は、正確には、通常、トランスフェクション後24〜72時間後に達した最大効果の期間を決定するために必要とされる場合があります。
別にトランスフェクションからのエレクトロポレーションによって哺乳動物細胞のトランスフェクションのための更なる十分に確立された技術がある。頻繁に適用されるシステムは、貨物核酸と複合体を形成した後、細胞内への輸送を容易にすることができる化学的トランスフェクション剤である。最も一般的に使用される試薬は、異なる脂質種に基づいているか、カチオン性ポリマー3の数から選択することができる。両方が多様な選択に近づくために市販されている。これらのトランスフェクション試薬は、それらが通常であるという利点を提供使いやすく、多くの時間を必要としないため、剥離の必要性を取り除くだけでなく、接着細胞を扱う。残念ながら、マクロファージは、それらがインビトロで有意に増殖し、外来DNAの細胞質ゾル13-15に対して向けられた防御機構を持たないように、これらの方法によってトランスフェクトすることがかなり困難である。したがって、化学的トランスフェクションアプローチは、しばしば、細胞生存率の著しい減少をもたらす。しかしながら、図2に示すようにそこに成功マクロファージへのsiRNAを転送することができ、化学的トランスフェクション剤があるが、フローサイトメトリー（ 図2A）および蛍光顕微鏡（ 図2B）の分析は、それらが細胞内のsiRNAの同一の均一な分布を達成することができない示すようヌクレオにより得られた。実際には、フローサイトメトリーデータは、トランスフェクトされた細胞の二つの異なる集団がNucleofecti後の細胞と同様の蛍光を有する集団まず、起こることを示しているオンが検出され、第二に、より強い蛍光を持つ人口があります。明確な確認がまだ必要であるが、私たちは、第一集団は、蛍光顕微鏡で第二集団は、おそらく非常に明るい凝集体を持つ細胞に相当する細胞質ゾル内の蛍光siRNAの均一な分布を示し、これらの細胞と同一であると仮定します。 図2Aに示すフローサイトメトリーのデータは、代替リポフェクション法よりも細胞あたりの少ないsiRNA中のヌクレオ結果。しかし、図3のデータは、ヌクレオとして援用するsiRNAであっても、比較的少量既に標的遺伝子の80〜90％のノックダウンのために十分であることを示している。したがって、化学的トランスフェクション後の第二の集団として援用siRNAの追加の量は非常に可能性が余剰であり、従って、更なる増加ノックダウン効率よりも望ましくない副作用を引き起こす可能性が高くなる。それとは別にこれらのsiRNA分子は、機能または遊離siRNA分子よりも少なくとも効率が低い可能性があり、オフターゲット効果を引き起こす可能性があるため、細胞内凝集体の形成は、それ自体が既に望ましくない。さらに、これらの凝集物の真の性質はまだ明らかではない。それは、これらの明るいスポットがsiRNAが細胞によって内部が、その後エンドソームからの放出されたことを示すエンドソームに失敗し、siRNAは、閉じ込められたため、効果がないまま表現している可能性があります。あるいは、スポットは、細胞内で形成される凝集体である可能性があります。化学トランスフェクションの機能評価は、したがって、ノックダウン効率に決定的な文はまだ二つの異なる集団の存在が、これはすべての結果は両集団の平均を記載していることを意味する、既に好ましくない、まだ作ることができない、保留されている、これはそのために対応していない集団のいずれか。そのためヌクレオは、優れたアプローチである。
<p clお尻は= "jove_content">それにもかかわらず、ここで説明トランスフェクション法には限界もあります。細胞は、ヌクレオ接着細胞が細胞に追加の応力係数を提示する、脱着する必要が懸濁液である必要があるからである。さらにプロトコル全体はかなり時間がかかります。 10実験当たり – トランスフェクションを同時に行うが、細胞の損傷を避けるために迅速に実行する必要はできないので、サンプル数は約8に制限されている。したがって、このプロトコルは、ハイスループットスクリーニングプロジェクトには適していない。高スループットのアプリケーションでは異なるヌクレオシステムが用意されています。まず、16ウェルストリップ·フォーマットを提供しています4D-ヌクレオシステムがあります。さらに大きなスループットを得るため、96ウェルシャトルシステムと384ウェルのHTヌクレオシステムがあります。しかし、これらの新しいシステムは、アルミニウム、したがって電気的条件、 すなわちプログラムやcomposの代わりに導電性ポリマー電極を用いて作業するヌクレオソリューションのitionは、それが私たちのプロトコルは、それらのシステムに転送することができるかどうかを決定する必要がある、それに応じて変更されています。しかし、これらの制限にもかかわらず、ここに提示プロトコルは、すべての他の非ウイルス的アプローチよりも優れているTHP-1細胞の信頼性のある効果的なトランスフェクションを生じない。このプロトコルは、他のすべての面で差別化し、普通に偏光するため、可能な限りトランスフェクションの少ない副作用として表示THP-1細胞における遺伝子発現の変化の影響の調査を可能にします。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、出版物のコストをカバーすることで、この出版を後援するためのロンザ·グループ·リミテッドに感謝しています。私たちは、SLに財政支援のためウントKULTUR WissenschaftドイツInfarktforschungshilfe、ヴィルヘルム·ヴァイヨン-財団、アーネスト·ソルベイ·財団、およびテゥーリンガーMinisteriumエリーゼBildungに感謝。
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Accutase I | Sigma-Aldrich | A6964 | |
| Amino acids, nonessential | PAA | M11-003 | |
| Centrifuge tubes (15 ml) | TPP | TPP91015 | |
| Fetal calf serum (FCS gold) | PAA | A15-151 | |
| Human Monocyte Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1007 | Contains Nucleofector Solution, cuvettes and Pasteur pipettes |
| Human serum off the clot | Lonza | C11-020 | |
| Isove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) with 25 mM HEPES and 25 mM L-glutamine | Lonza | 12-722F | |
| Lymphocyte Growth Medium 3 (LGM3) | Lonza | CC-3211 | |
| Mouse T Cell Nucleofector Medium | Lonza | VZB-1001 | |
| Nucleofector 2b | Lonza | AAD-1001 | |
| Penicillin / Streptomycin / L-glutamine (100×) | Sigma-Aldrich | G1146 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Fisher Scientific | BP685 | |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI 1640) | PAA | E15-840 | |
| siRNA / plasmid | |||
| Sodium pyruvate (100 mM) | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| THP-1 human leukemia monocytes | CLS | 300356 | |
| Tissue culture flasks (75 cm²; 150 cm²) | TPP | TPP90076/TPP90151 | |
| Tissue culture plates (6-well; 12-well) | TPP | TPP92406/TPP92012 | |
| Tubes (1.5 ml) | StarLab | S 1615-5500 | |
| Water (nuclease-free) or appropriate siRNA/plasmid buffer | |||
| X-Vivo 20 with Gentamycin | Lonza | BE04-448Q | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 |
References
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