La transfection très efficace des droits de THP-1 par les macrophages nucléofection
Summary
Ce protocole présente une méthode efficace et fiable pour la transfection humains THP-1 macrophages avec siRNA ou de l'ADN plasmidique par électroporation à haut rendement de transfection tout en maintenant la vitalité des cellules haute capacité et des macrophages plein de différenciation et polarisation.
Abstract
Macrophages, comme des acteurs clés de la réponse immunitaire innée, sont au centre de recherche portant sur l'homéostasie tissulaire ou diverses pathologies. Transfection avec le siRNA et l'ADN plasmidique est un outil efficace pour l'étude de leur fonction, mais transfection des macrophages n'est pas une mince affaire. Bien que de nombreuses approches différentes pour la transfection de cellules eucaryotes sont disponibles, seuls quelques-uns permettent la transfection efficace et fiable des macrophages, mais la vitalité des cellules et réduit le comportement des cellules sévèrement altérée comme une diminution de la capacité de différenciation ou de la polarisation sont fréquemment observées. Par conséquent, un protocole de transfection est nécessaire, qui est capable de transférer les siRNA et de l'ADN plasmidique dans les macrophages sans provoquer d'effets secondaires graves, permettant ainsi l'investigation de l'effet de l'ARNsi ou plasmide dans le cadre du comportement normal de la cellule. Le protocole présenté ici fournit un procédé fiable et efficace pour transfecter des humains THP-1 et des macrophages monocytes avec vitalité cellulaire élevée, une haute efficacité de la transfection, et des effets minimes sur le comportement des cellules. Cette approche est basée sur nucléofection et le protocole a été optimisé pour maintenir une capacité maximale pour l'activation des cellules après transfection. Le protocole est suffisant pour les cellules adhérentes après détachement ainsi que des cellules en suspension, et peut être utilisée pour de petits nombres d'échantillons de taille moyenne. Ainsi, le procédé présenté est utile pour étudier les effets de régulation de gènes au cours de la différenciation des macrophages et de la polarisation. Outre la présentation des résultats caractérisant les macrophages transfectées selon ce protocole par rapport à une méthode chimique de remplacement, l'impact de la culture cellulaire milieu de sélection après transfection sur le comportement des cellules est également discutée. Les données présentées indiquent l'importance de valider la sélection pour les différents paramètres expérimentaux.
Introduction
Parmi les composants cellulaires du système immunitaire humain, les macrophages sont d'une grande importance pour la réponse immunitaire innée. Leurs tâches sont diverses; elles sont impliquées dans la phagocytose des agents pathogènes et des tissus nécrotiques, ils jouent un rôle important dans l'homéostasie tissulaire et produisent et sécrètent un grand nombre de cytokines et de réguler orchestrer la réponse immunitaire 1. Par conséquent macrophages sont intégralement impliqués dans de nombreux processus physiologiques et physiopathologiques conditions. En raison de la diversité de leurs tâches, les macrophages sont un type de cellule très hétérogène et multiforme. Ce résultat est obtenu par des polarisations différentes; selon les macrophages de stimuli externes peut se développer en différents phénotypes 2. La variabilité et de l'impact de macrophages sur la réponse immunitaire en font un très intéressant sujet de recherche. Afin d'élucider leur métabolique complexe et les fonctions de réglementation, de macrophages approprié dans des modèles in vitro sont required qui reflètent correctement macrophages hétérogénéité et la variabilité.
La transfection de cellules avec des vecteurs d'ADN plasmidique ou de petits ARN interférents (siRNA) afin de modifier l'expression des gènes cellulaire est devenu un outil largement utilisé et puissant en biologie cellulaire pour étudier la fois la régulation des gènes et la fonction des gènes. Actuellement, il ya un grand choix de différents outils disponibles pour la transfection de cellules eucaryotes. Ces outils comprennent l'application des vecteurs viraux, des procédés mécaniques (telles que canons à gènes), les approches chimiques (qui dépendent de polymères ou de lipides qui peuvent former des complexes avec les acides nucléiques), et l'électroporation de cellules 3. Toutes ces approches ont leurs avantages et inconvénients et le choix les mieux adaptés à partir de ce large éventail pour un type cellulaire spécifique et de l'application peut être un processus long et difficile.
Les macrophages sont notoirement difficiles à transfecter transfe comme presque tous bien établieapproches ction de réduire considérablement la viabilité de macrophages ou interférer avec leur comportement, c'est à dire la différenciation et polarisation particulière. Par conséquent, nous présentons ici, un protocole non-viral efficace pour transfecter humains THP-1 macrophages en utilisant la technologie Nucleofector base électroporation, qui représente une approche d'électroporation optimisé exigeant la réduction des quantités d'ADN. Nucléofection est bien adapté pour des cellules sensibles, telles que les monocytes et les macrophages. Ce protocole est une adaptation de versions précédemment publiées 4,5.
En bref, le phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) est utilisé pour différencier les droits de monocytes THP-1 pendant 48 heures dans les macrophages prématurée avant la transfection avec le siRNA ou d'ADN plasmidique. Pour la transfection, les macrophages predifferentiated sont détachés par voie enzymatique par traitement Accutase I. La transfection est réalisée en utilisant un dispositif d'électroporation 2b Nucleofector pour des cellules. Après transfection, différerciation est poursuivi pour une autre de 24 à 48 heures selon les besoins. Enfin, les macrophages matures transfectées sont incubées avec différents types de composés pour des études fonctionnelles.
Cette approche permet la transfection de lignées cellulaires telles que les humains THP-1 et les monocytes et les macrophages a été appliquée avec succès dans le passé de 6 à 10. Contrairement à la plupart des méthodes de transfection chimique, notre procédure nucléofection modifié en utilisant des macrophages prématurés donne de hauts rendements de transfection, en combinaison avec la viabilité de la cellule intacte, sans avoir besoin d'utiliser des vecteurs viraux ou d'ajouter d'autres composés porteurs d'effets secondaires inconnus. En outre, les macrophages conservent leur plein potentiel de différenciation ainsi que la polarisation permettant ainsi explorations fonctionnelles sans entrave après transfection 11.
En outre, le milieu de culture cellulaire appliqué après nucléofection influe fortement sur les études fonctionnelles suivant transfection; en particulier, la capacité des macrophages de polarisation peut être influencée en fonction du milieu de culture appliquées. Voici quatre différents types de milieux de culture cellulaire (IMDM, X-VIVO 20, LGM3 et de la souris des cellules T moyen Nucleofector) ont été testés dans des conditions de désactivation utilisant l'interleukine (IL) 10 Utilisation de THP-1 macrophages, nous avons observé que la cellule de réaction à l'IL10 est la plus forte lorsque le milieu cellulaire de souris Nucleofector T est utilisée par rapport à l'autre milieu de culture mentionné ci-dessus. Ces résultats montrent que l'optimisation de l'ensemble des conditions appropriées de culture cellulaire est essentielle pour la transfection réussie des études fonctionnelles suivantes und car ils peuvent améliorer de manière significative les résultats expérimentaux.
Que les macrophages sont impliqués dans diverses maladies humaines, beaucoup de recherches se concentre sur l'élucidation comportement des macrophages ainsi que des mécanismes régulateurs qui influent sur les macrophages ou, à son tour contrôlée par les macrophages. Par conséquent, ce protocole est de pertinence dansnombreux domaines de recherche différents.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici présente un moyen fiable et efficace pour la transfection de cellules THP-1 macrophages qui sont généralement assez difficiles à transfecter. La transfection peut être réalisée avec des efficacités de transfection supérieures à 90% pour les siRNA sans réduction significative de la vitalité des cellules. Efficacité de plasmides peuvent être moins en raison de leur taille, mais transfection efficacité de l'ordre de 70% peuvent être généralement obtenus. L'efficacité de l'effet de choc induite par le siRNA peut atteindre 80 à 90% en fonction du siRNA appliqué. Un avantage majeur de ce protocole est que cela n'interfère pas avec la différenciation cellulaire. Après transfection, les cellules répondent toujours normalement à l'agent de différenciation PMA (Figure 1A à 1B et figure 4) 12. De plus la polarisation cellulaire par des stimuli tels que des cytokines IL-10 ou LPS / IFN 12 n'est pas affectée, même si cela dépend également fortement sur le support sélectionné pour une culture après transfections indique la figure 4.
Il ya plusieurs options dans la procédure qui peut être modifié afin d'adapter le protocole à des exigences spécifiques. Les cellules Comme le montre la Figure 4 réagissent différemment au même stimulus IL10 selon le milieu de culture choisi après la transfection. Ceci indique que la composition du milieu a une forte influence sur le comportement cellulaire. Comme l'effet imposée par le milieu peut être différente pour différents stimuli expérimentaux, il est possible que le milieu optimal peut changer et par conséquent il est nécessaire de vérifier l'aptitude du moyen de différentes expériences de façon indépendante. Toutefois, le milieu RPMI-1640, qui est le moyen par défaut utilisé pour la culture de cellules THP-1, s'est avérée peu adaptée à la culture après la transfection par une perte significative de la vitalité des cellules a été observée. En outre, le protocole peut également être appliqué à des monocytes THP-1 sans la différenciation induite par le PMA-avant, cettesupprime évidemment la nécessité pour le détachement des cellules au cours de la procédure, mais les étapes restantes ne doivent pas être ajustés. Les monocytes THP-1 peuvent être différenciés par la suite si nécessaire.
Les éléments les plus critiques du protocole sont d'une part le détachement et d'autre part le temps nécessaire pour la transfection. Le détachement doit être effectuée le plus doucement possible, afin de maintenir la viabilité des cellules haute. Par conséquent, nous vous recommandons le détachement enzymatique relativement doux par Accutase je cours Méthodes très agressifs tels que la trypsine. D'autres procédés tels que le traitement de détachement de lidocaïne ou de raclage sont avérées plutôt nuisible et ne doivent pas être utilisés. Dans le cas que de 30 min de traitement Accutase je ne devrait pas être suffisante pour détacher les cellules correctement ce qui est généralement une indication de la solution a été mal enregistré ou expiré Accutase I ou de trop nombreux cycles de gel-dégel. Nous avons obtenu de bons résultats par le stockage de petites fractions de Accutase je à -20 °C pour réduire le nombre de cycles de gel-dégel. Cependant, quand il ya détachement insuffisante soit remplacer Accutase I avec Accutase frais ou augmenter le temps d'incubation allant jusqu'à 1 h. En outre tapotant doucement ou de rinçage de la fiole ou de la plaque peut aider détachement. En ce qui concerne le temps nécessaire à la transfection, le temps d'exposition des cellules à la solution pure Nucleofector a obtenu fort impact sur la survie des cellules et par conséquent doit être aussi courte que possible. La meilleure façon d'y parvenir est d'effectuer chaque transfection à la fois (étapes 2.10 à 2.15) et non plusieurs transfections en parallèle.
Si knockdown efficacité est faible, ce n'est pas habituellement causée par une faible efficacité de transfection, mais ceci peut être facilement vérifiée en utilisant la cytométrie en flux ou microscopie à fluorescence et siRNA marqué par fluorescence ou un plasmide codant pour la GFP. La plupart du temps la cause est un ADN plasmidique siRNA ou inefficace. Dans ces conditions, il doit être considéré pour augmenter la quantité de siRNA (jusqu'à 3.2 pg) oul'ADN plasmidique (jusqu'à 1-2 pg) ou d'utiliser un siRNA ou vecteur d'expression différente si disponible. En variante, des résultats satisfaisants peuvent également être obtenus en utilisant un pool de plusieurs ARNsi différents dirigés contre la même cible. En outre, des expériences de cours à temps pourraient être nécessaires pour déterminer avec précision la durée de l'effet maximal, qui est généralement atteint après 24 à 72 heures après transfection.
En dehors de la transfection par électroporation il existe en outre des techniques bien établies pour la transfection de cellules de mammifères. Fréquemment les systèmes utilisés sont des agents de transfection chimiques qui peuvent former des complexes avec l'acide nucléique de la cargaison et de faciliter le transport dans les cellules. Les réactifs les plus fréquemment utilisés sont soit basés sur différentes espèces lipidiques ou peuvent être choisis parmi un certain nombre de polymères cationiques 3. Pour les deux approches, une sélection variée est disponible dans le commerce. Ces réactifs de transfection ont l'avantage qu'ils sont habituellementfacile à utiliser, ne nécessitent pas beaucoup de temps, et de travailler avec des cellules adhérentes ainsi, éliminant ainsi la nécessité de détachement. Malheureusement, les macrophages sont plutôt difficiles à transfecter par ces méthodes car elles ne prolifèrent pas de manière significative in vitro et possèdent des mécanismes de défense à l'encontre de l'ADN étranger cytosolique de 13 à 15. Ainsi, les méthodes de transfection chimique ont souvent pour résultat une forte réduction de la viabilité des cellules. Toutefois, comme indiqué sur la figure 2 il existe des agents de transfection chimiques qui peuvent transférer avec succès siRNA dans les macrophages, mais aussi par cytométrie de flux (Figure 2A) et au microscope à fluorescence (Figure 2B), les analyses indiquent qu'ils ne parviennent pas à atteindre la même répartition homogène de siRNA dans les cellules en tant que obtenu par nucléofection. En fait, les données de cytométrie en flux, indiquent que deux populations différentes de cellules transfectées produisent tout d'abord une population de fluorescence similaire à celle des cellules après Nucleofectisur la détection et d'autre part il ya une population avec une fluorescence plus intense. Confirmation définitive est toujours nécessaire, mais nous supposons que la première population est dans la microscopie à fluorescence identique à ces cellules qui présentent une répartition homogène des siRNA fluorescent dans le cytosol tandis que la seconde population correspond probablement à des cellules avec des agglomérats très lumineux. Les données de cytométrie en flux de la Figure 2A suggèrent que les résultats de nucléofection en moins siRNA par cellule que l'approche de lipofection alternative. Cependant, les données de la figure 3 montre que la même quantité relativement faible de siRNA constituée par nucléofection est déjà suffisant pour 80 à 90% de l'effet de choc gène cible. Par conséquent, le montant supplémentaire de siRNA constituée par la deuxième population après transfection chimique est très probable excédent et est donc plus susceptible de causer des effets secondaires indésirables que d'accroître encore l'efficacité de knockdown. En dehors de celaformation d'agglomérats intracellulaires est déjà en soi indésirable puisque ces molécules de siARN sont susceptibles de ne pas fonctionnelle ou au moins moins efficace que les molécules de siARN libres et peuvent provoquer des effets ponctuels de cibles. En outre, la vraie nature de ces agglomérats n'est pas encore clair. Il est possible que ces points lumineux représentent endosomes indiquant que le siRNA a été internalisée par les cellules, mais par la suite libérer des endosomes et n'ont pas le siRNA reste piégé et donc inefficace. En variante, les points peuvent être des agglomérats qui sont formés de manière intracellulaire. Évaluations fonctionnelles de la transfection chimique sont en cours, donc pas de conclusions définitives sur l'efficacité knockdown peuvent être encore faites, encore l'existence de deux populations distinctes est déjà défavorable, cela signifie que tous les résultats décrivent la moyenne des deux populations, cela ne correspond donc pas à ou l'autre des populations. Pour cette raison nucléofection est la meilleure approche.
<p class = "jove_content"> Mais il ya aussi des limites à la procédure de transfection décrit ici. Etant donné que les cellules doivent être en suspension pour les cellules adhérentes nucléofection doivent être détaché, qui présente un facteur de stress supplémentaire pour les cellules. En outre, l'ensemble du protocole est plutôt chronophage. Depuis transfections ne peuvent pas être réalisées simultanément, mais devra être réalisée rapidement afin d'éviter d'endommager la cellule, le nombre d'échantillons est limitée à environ 8 – 10 par expérience. Ainsi, ce protocole n'est pas adapté pour les projets de criblage à haut débit. Pour les applications à haut débit des systèmes de Nucleofector différents sont disponibles. Tout d'abord, il ya le système 4D-Nucleofector qui offre un format de bande 16 de bien. Pour encore plus le débit, il ya le système de navette à 96 puits et 384 puits système HT Nucleofector. Cependant, comme ces nouveaux systèmes fonctionnent avec des électrodes conductrices de polymère à la place de l'aluminium et donc des conditions électriques, à savoir les programmes et les composition de solution Nucleofector, ont évolué en conséquence, il doit être déterminé si notre protocole peut être transféré à ces systèmes.Cependant, malgré ces limitations du protocole présenté ici ne donne une transfection fiable et efficace des cellules THP-1 qui est supérieure à toutes les autres approches non virales. Ce protocole permet à l'enquête sur les effets de l'expression du gène altéré dans cellules THP-1 qui, dans tous les autres aspects de différencier et de polariser normalement et ainsi montrer que peu d'effets secondaires de transfection que possible.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants à Lonza Group Ltd pour le parrainage de cette publication en couvrant les frais de publication. Nous remercions la Deutsche Infarktforschungshilfe, Wilhelm-Vaillant-Stiftung, Ernest-Solvay-Stiftung, et la Thüringer Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Kultur soutien financier pour SL.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Accutase I | Sigma-Aldrich | A6964 | |
| Amino acids, nonessential | PAA | M11-003 | |
| Centrifuge tubes (15 ml) | TPP | TPP91015 | |
| Fetal calf serum (FCS gold) | PAA | A15-151 | |
| Human Monocyte Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1007 | Contains Nucleofector Solution, cuvettes and Pasteur pipettes |
| Human serum off the clot | Lonza | C11-020 | |
| Isove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) with 25 mM HEPES and 25 mM L-glutamine | Lonza | 12-722F | |
| Lymphocyte Growth Medium 3 (LGM3) | Lonza | CC-3211 | |
| Mouse T Cell Nucleofector Medium | Lonza | VZB-1001 | |
| Nucleofector 2b | Lonza | AAD-1001 | |
| Penicillin / Streptomycin / L-glutamine (100×) | Sigma-Aldrich | G1146 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Fisher Scientific | BP685 | |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI 1640) | PAA | E15-840 | |
| siRNA / plasmid | |||
| Sodium pyruvate (100 mM) | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| THP-1 human leukemia monocytes | CLS | 300356 | |
| Tissue culture flasks (75 cm²; 150 cm²) | TPP | TPP90076/TPP90151 | |
| Tissue culture plates (6-well; 12-well) | TPP | TPP92406/TPP92012 | |
| Tubes (1.5 ml) | StarLab | S 1615-5500 | |
| Water (nuclease-free) or appropriate siRNA/plasmid buffer | |||
| X-Vivo 20 with Gentamycin | Lonza | BE04-448Q | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 |
References
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