Zeer efficiënte transfectie van Human THP-1 macrofagen door Nucleofection
Summary
Dit protocol geeft een efficiënte en betrouwbare methode voor de menselijke THP-1 macrofagen met siRNA of plasmide-DNA te transfecteren door elektroporatie met hoge transfectie efficiëntie met behoud van hoge cel vitaliteit en volledige capaciteit macrofaag differentiatie en polarisatie.
Abstract
Macrofagen, als de belangrijkste spelers van de aangeboren immuunrespons, zijn bij de focus van het onderzoek te maken met weefselhomeostase of verschillende pathologieën. Transfectie met siRNA en plasmide-DNA is een efficiënt hulpmiddel voor de functie bestuderen, maar transfectie van macrofagen is geen triviale zaak. Hoewel veel verschillende benaderingen voor transfectie van eukaryote cellen zijn beschikbaar, maar weinig toe betrouwbare en efficiënte transfectie van macrofagen, maar verminderde cel vitaliteit en ernstig gestoorde cel gedrag zoals verminderde mogelijkheden voor differentiatie en polarisatie worden vaak waargenomen. Een transfectie protocol is daarom nodig dat in staat is om siRNA en plasmide DNA in macrofagen zonder ernstige bijwerkingen waardoor het onderzoek van het effect van siRNA of plasmide in het kader van normale celgedrag. De hier gepresenteerde protocol verschaft een werkwijze voor het betrouwbaar en efficiënt transfecteren van humane THP-1 macrofagen en monocytes met hoge cel vitaliteit, hoge transfectie-efficiëntie en minimale effecten op cel gedrag. Deze benadering is gebaseerd op Nucleofection en het protocol werd geoptimaliseerd om maximale capaciteit voor celactivering na transfectie handhaven. Het protocol is geschikt voor hechtende cellen na losmaken alsook cellen in suspensie en kan worden gebruikt voor kleine tot middelgrote aantallen monsters. Dus de gepresenteerde werkwijze nuttig voor het onderzoeken genregulerend effecten tijdens macrofaag differentiatie en polarisatie. Naast het presenteren van de resultaten karakteriseren macrofagen getransfecteerd volgens dit protocol in vergelijking met een alternatieve chemische methode, wordt de impact van celcultuurmedium selectie na transfectie op mobiele gedrag besproken. De gepresenteerde gegevens wijzen op het belang van het valideren van de selectie voor de verschillende experimentele instellingen.
Introduction
Van de cellulaire bestanddelen van het menselijke immuunsysteem, macrofagen van groot belang voor de aangeboren immuunrespons. Hun taken zijn divers; zij worden gebruikt voor fagocytose van pathogenen en necrotisch materiaal, spelen ze een belangrijke rol in weefsel homeostase en produceren en scheiden een groot aantal cytokinen te reguleren en orkestreren de immuunrespons 1. Daarom macrofagen integraal betrokken bij vele fysiologische processen en pathofysiologische omstandigheden. Door de diversiteit van hun taken, macrofagen zijn een zeer heterogene en veelzijdige celtype. Dit wordt bereikt door verschillende polarisaties; afhankelijk van externe stimuli macrofagen kunnen ontwikkelen tot verschillende fenotypes 2. Variabiliteit en de impact macrofagen 'op de immuunrespons maken ze een zeer interessant onderwerp. Om hun complexe metabolische en regulerende functies, nodig macrofaag ontrafelen in vitro modellen required die juist reflecteren macrofagen heterogeniteit en variabiliteit.
Transfectie van cellen met plasmide-DNA vectoren of kleine interfererende RNA's (siRNA's) teneinde cellulaire genexpressie veranderen is een veelgebruikt en krachtig instrument celbiologie voor het onderzoeken van zowel genregulatie en genfunctie. Momenteel is er een grote selectie van verschillende hulpmiddelen beschikbaar voor transfectie van eukaryote cellen. Deze hulpmiddelen omvatten de toepassing van virale vectoren, mechanische werkwijzen (bijvoorbeeld gen pistolen), chemische methoden (die berusten op polymeren of lipiden die complexen met nucleïnezuren kunnen vormen) en elektroporatie van cellen 3. Al deze benaderingen hebben hun voordelen en nadelen en het kiezen van de meest geschikte uit deze gemak voor een specifiek celtype en toepassing kan een moeilijk en tijdrovend proces.
Macrofagen zijn notoir moeilijk om als bijna alle gerenommeerde Transfe transfecterenctie benaderingen levensvatbaarheid macrofagen 'drastisch te verminderen of interfereren met hun gedrag, dwz differentiatie en in het bijzonder polarisatie. Daarom presenteren we hier een efficiënt, niet-virale protocol voor humane THP-1 macrofagen via de elektroporatie gebaseerde Nucleofector technologie die een optimale elektroporatie waarbij met verminderde hoeveelheden DNA vertegenwoordigt transfecteren. Nucleofection is zeer geschikt voor gevoelige cellen zoals monocyten en macrofagen. Dit protocol is een aanpassing van de eerder gepubliceerde versies 4,5.
In het kort, is forbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) toegepast om menselijke THP-1 monocyten differentiëren gedurende 48 uur in premature macrofagen voor transfectie met siRNA of plasmide DNA. Voor transfectie de predifferentiated macrofagen zijn enzymatisch losgemaakt door Accutase I behandeling. De transfectie wordt uitgevoerd met een Nucleofector 2b inrichting voor elektroporatie van de cellen. Na transfectie verschillenentiation wordt gedurende nog eens 24 tot 48 uur vereiste. Tenslotte worden getransfecteerd rijpe macrofagen geïncubeerd met verschillende soorten van verbindingen voor functionele studies.
Deze benadering maakt de transfectie van cellijnen zoals humane THP-1 monocyten en macrofagen met succes in het verleden 6-10 toegepast. In tegenstelling tot de meeste chemische transfectie methoden, onze gewijzigde Nucleofection procedure middels premature macrofagen levert hoge transfectie efficiëntie in combinatie met intacte cellevensvatbaarheid, zonder virale vectoren of nog extra dragende verbindingen met onbekende bijwerkingen. Bovendien, de macrofagen behouden hun mogelijkheden tot differentiatie en polarisatie waardoor ongehinderde functioneel onderzoek na transfectie 11.
Bovendien, het celkweekmedium aangebracht na Nucleofection beïnvloedt sterk functionele studies na transfection; Met name kan de capaciteit van de macrofagen "polarisatie worden beïnvloed afhankelijk van de toegepaste kweekmedium. Hier vier verschillende celkweekmedium (IMDM, X-VIVO 20, LGM3 en muis T-cellen Nucleofector medium) werden getest onder omstandigheden deactiveren middels interleukine (IL) 10 gebruiken THP-1 macrofagen, waargenomen dat celgevoeligheid naar IL10 is sterkst wanneer de muis T cel Nucleofector medium wordt gebruikt in vergelijking met de andere hierboven genoemde kweekmedium. Deze resultaten demonstreren dat geval optimalisatie van alle celkweekomstandigheden is essentieel voor een succesvolle transfectie und volgende functionele studies zoals deze aanzienlijk experimentele resultaten verbeteren.
Aangezien macrofagen betrokken zijn bij verschillende menselijke ziekten, is veel onderzoek gericht op het ophelderen macrofaag functie en regulerende mechanismen beïnvloeden macrofagen of beurt gecontroleerd door macrofagen. Daarom is dit protocol van belang is inveel verschillende onderzoeksgebieden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol hier beschreven presenteert een betrouwbare en efficiënte manier om THP-1 macrofagen die meestal nogal moeilijk te transfecteren transfecteren. Transfectie kan worden bereikt met transfectie efficiënties van meer dan 90% voor siRNA zonder significante reductie van cel vitaliteit. Efficiënties voor plasmiden minder vanwege hun grootte, maar transfectie efficiënties van ongeveer 70% kan meestal worden bereikt. De efficiëntie van siRNA-gemedieerde knockdown bereiken 80 tot 90% afhankelijk van het toegepaste siRNA. Een groot voordeel van dit protocol is dat het niet interfereert met celdifferentiatie. Na transfectie van de cellen nog steeds normaal reageert op de differentiatie middel PMA (Figuur 1A tot 1B en figuur 4) 12. Bovendien cellulaire polarisatie cytokine stimuli zoals IL10 of LPS / IFNy onaangetast 12, hoewel dit ook sterk afhankelijk van de voor kweken na transfectie mediums getoond in figuur 4.
Er zijn verschillende opties binnen de procedure die met het oog op het protocol specifieke eisen aan te passen kan worden gewijzigd. Zoals getoond in figuur 4 verschillend cellen reageren dezelfde IL10 stimulus afhankelijk van het geselecteerde kweekmedium na transfectie. Dit geeft aan dat het medium samenstelling sterke invloed op celgedrag. Aangezien de door het medium kunnen verschillen voor verschillende experimentele stimuli effect is het mogelijk dat de optimale medium kan veranderen en daarom is het nodig om de geschiktheid van het medium voor verschillende experimenten onafhankelijk te verifiëren. Maar het RPMI-1640 medium, wat de standaard medium voor kweken van THP-1 cellen, is gebleken ongeschikt voor kweken na transfectie worden als significant verlies in cel vitaliteit waargenomen. Ook het protocol kan ook worden toegepast op THP-1 monocyten zonder voorafgaande PMA geïnduceerde differentiatie dit,kennelijk neemt de noodzaak voor mobiele uitdraaien tijdens de procedure maar alle overige stappen niet te worden aangepast. De THP-1 monocyten achteraf te onderscheiden indien nodig.
De kritische elementen van het protocol zijn enerzijds het losmaken en anderzijds de tijd nodig voor transfectie. De onthechting moet zo voorzichtig mogelijk worden uitgevoerd, teneinde een hoge cellevensvatbaarheid handhaven. Daarom raden wij het relatief milde enzymatische onthechting door Accutase ik dan vrij agressief methoden, zoals behandeling met trypsine. Verdere onthechting werkwijzen zoals behandeling met lidocaïne of schrapen bleken nogal schadelijk zijn en mogen niet worden gebruikt. In het geval dat 30 min van Accutase I behandeling niet voldoende om alle cellen los worden Zo is meestal een indicatie van onjuist opgeslagen of verlopen Accutase I oplossing of teveel vries-dooi cycli. Wij hebben goede resultaten verkregen door het opslaan van kleine hoeveelheden van Accutase I bij -20 °C het aantal vries-dooi cycli verminderen. Maar als er onvoldoende detachement ofwel vervangen Accutase ik met verse Accutase of verhogen incubatietijd tot 1 uur. Daarnaast zachtjes te tikken of spoelen van de kolf of de plaat kan onthechting te helpen. Wat betreft de vereiste tijd voor transfectie de belichtingstijd van de cellen Nucleofector zuivere oplossing heeft een groot effect op celoverleving en dus moeten zo kort mogelijk zijn. De beste manier om dit te bereiken is elke transfectie voeren op een tijdstip (stap 2,10-2,15) en niet meerdere transfecties in parallel.
Als knockdown efficiëntie laag, deze meestal niet veroorzaakt door lage transfectie efficiëntie, maar dit kan gemakkelijk worden geverifieerd met flowcytometrie of fluorescentiemicroscopie en fluorescent gelabelde siRNA of GFP coderende plasmide. Meestal is de oorzaak een inefficiënte siRNA of plasmide DNA. Onder deze omstandigheden moeten worden beschouwd om de hoeveelheid siRNA verhogen (tot 2-3 ug) ofplasmide DNA (tot 1-2 ug) of een verschillende siRNA of expressievector gebruiken indien beschikbaar. Alternatief kunnen bevredigende resultaten worden verkregen door een pool van verschillende siRNAs gericht tegen hetzelfde doel. Bovendien zou tijdsverloop experimenten nodig om de periode van maximale effect wordt meestal bereikt na 24 tot 72 uur na transfectie nauwkeurig bepalen.
Naast transfectie door elektroporatie er meer gevestigde technieken voor transfectie van zoogdiercellen. Veel toegepaste systemen zijn chemische transfectieagentia die complexen met de lading nucleïnezuur kunnen vormen over de transport in de cellen vergemakkelijken. De meest gebruikte reagentia zijn ofwel gebaseerd op verschillende soorten lipiden of kunnen worden gekozen uit een aantal kationische polymeren 3. Voor beide benaderingen een gevarieerde selectie handel verkrijgbaar. Deze transfectie reagentia bieden het voordeel dat ze meestalmakkelijk te gebruiken, niet veel tijd vergen, en werken met hechtende cellen als goed, waardoor het verwijderen van de noodzaak tot onthechting. Helaas, macrofagen zijn nogal moeilijk te transfecteren met deze methoden niet wezenlijk prolifereren in vitro en bezitten afweermechanismen tegen buitenlandse cytosolische DNA 13-15. Zo chemische transfectie benaderingen vaak leiden tot een ernstige vermindering van de levensvatbaarheid van de cellen. Maar zoals getoond in figuur 2 zijn chemische transfectieagentia welke succesvol kunnen overdragen siRNA tot macrofagen, maar flowcytometrische (figuur 2A) en fluorescerende microscopische (figuur 2B) analyses geven ze niet dezelfde homogene verdeling van siRNA binnen de cellen te bereiken verkregen door Nucleofection. In feite is de flowcytometrische gegevens blijkt dat twee verschillende populaties van getransfecteerde cellen voordoen, eerst een populatie met gelijke fluorescentie als de cellen na Nucleofection wordt gedetecteerd en ten tweede is er een populatie met intensere fluorescentie. Definitieve bevestiging nog steeds nodig maar we veronderstellen dat de eerste populatie in de fluorescentiemicroscopie identiek aan die cellen die een homogene verdeling van fluorescent siRNA in het cytosol tonen terwijl de tweede bevolking die overeenkomt met de cellen met zeer heldere agglomeraten. De flowcytometrische uit figuur 2A blijkt dat nucleofection resulteert in minder siRNA per cel dan het alternatief lipofectie benadering. De gegevens in figuur 3 blijkt echter dat zelfs betrekkelijk kleine hoeveelheid siRNA opgenomen Nucleofection al voldoende voor 80 tot 90% knockdown van het doelwitgen. Daarom is het extra bedrag van siRNA opgenomen door de tweede populatie na chemische transfectie is zeer waarschijnlijk een overschot en dus meer kans op ongewenste bijwerkingen dan om verdere toename knockdown efficiëntie leiden. Daarnaastvorming van intracellulaire agglomeraten is al ongewenst op zich omdat deze siRNA moleculen zijn waarschijnlijk niet functioneel of in ieder geval minder efficiënt dan gratis siRNA moleculen en kunnen veroorzaken tussen de palen effecten. Verder is de ware aard van deze agglomeraten is nog niet duidelijk. Het is mogelijk dat deze heldere vlekken geven endosomen te geven dat de siRNA werd geïnternaliseerd door de cellen maar vervolgens los van de endosomen mislukt en siRNA gevangen blijft en derhalve niet effectief. Alternatief kan de spots agglomeraten die intracellulair worden gevormd. Functionele evaluatie van de chemische transfectie hangende derhalve geen definitieve uitspraken over knockdown efficiëntie kan nog worden gemaakt, nog steeds bestaan van twee verschillende populaties is ook ongunstig omdat dit betekent dat alle resultaten beschrijven gemiddelde van beide populaties, dit is derhalve niet overeen met een van de populaties. Daarom Nucleofection is de superieure benadering.
<p class = "jove_content"> Toch zijn er ook beperkingen aan de transfectie hier beschreven procedure. Aangezien de cellen moeten in suspensie Nucleofection hechtende cellen moeten worden losgemaakt, die een extra stressfactor aan de cellen weer. Verder is de gehele protocol is nogal tijdrovend. Aangezien transfecties niet gelijktijdig worden uitgevoerd, maar moeten snel worden uitgevoerd om celbeschadiging voorkomen, wordt het aantal monsters beperkt tot ongeveer 8 – 10 per experiment. Zo wordt dit protocol niet geschikt voor high throughput screening van projecten. Voor high throughput toepassingen verschillende Nucleofector systemen beschikbaar. Ten eerste is er de 4D-Nucleofector systeem dat een 16 goed strookformaat biedt. Voor nog grotere verwerkingscapaciteit Naast 96 goed Shuttle systeem en 384 en HT Nucleofector systeem. Maar als deze nieuwere systemen werken met geleidende polymeer elektroden in plaats van aluminium en daardoor elektrische voorwaarden, dat wil zeggen programma's en composvulle van Nucleofector oplossing dienovereenkomstig gewijzigd moet worden bepaald of ons protocol worden overgedragen hierin.Ondanks deze beperkingen het protocol hier gepresenteerde oplevert een betrouwbare en effectieve transfectie van THP-1 cellen die superieur is aan alle andere niet-virale benaderingen. Dit protocol maakt het onderzoek naar de effecten van veranderde genexpressie in THP-1-cellen die in alle andere aspecten onderscheiden en polariseren normaal en vertonen derhalve slechts bijwerkingen van transfectie mogelijk.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn dankbaar dat Lonza Group Ltd voor sponsoren deze publicatie door het bedekken van de publicatiekosten. Wij danken de Deutsche Infarktforschungshilfe, Wilhelm-Vaillant-Stiftung, Ernest-Solvay-Stiftung, en de Thüringer Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Kultur voor financiële steun aan SL.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Accutase I | Sigma-Aldrich | A6964 | |
| Amino acids, nonessential | PAA | M11-003 | |
| Centrifuge tubes (15 ml) | TPP | TPP91015 | |
| Fetal calf serum (FCS gold) | PAA | A15-151 | |
| Human Monocyte Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1007 | Contains Nucleofector Solution, cuvettes and Pasteur pipettes |
| Human serum off the clot | Lonza | C11-020 | |
| Isove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) with 25 mM HEPES and 25 mM L-glutamine | Lonza | 12-722F | |
| Lymphocyte Growth Medium 3 (LGM3) | Lonza | CC-3211 | |
| Mouse T Cell Nucleofector Medium | Lonza | VZB-1001 | |
| Nucleofector 2b | Lonza | AAD-1001 | |
| Penicillin / Streptomycin / L-glutamine (100×) | Sigma-Aldrich | G1146 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Fisher Scientific | BP685 | |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI 1640) | PAA | E15-840 | |
| siRNA / plasmid | |||
| Sodium pyruvate (100 mM) | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| THP-1 human leukemia monocytes | CLS | 300356 | |
| Tissue culture flasks (75 cm²; 150 cm²) | TPP | TPP90076/TPP90151 | |
| Tissue culture plates (6-well; 12-well) | TPP | TPP92406/TPP92012 | |
| Tubes (1.5 ml) | StarLab | S 1615-5500 | |
| Water (nuclease-free) or appropriate siRNA/plasmid buffer | |||
| X-Vivo 20 with Gentamycin | Lonza | BE04-448Q | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 |
References
- Ricardo, S. D., van Goor, H., Eddy, A. A. Macrophage diversity in renal injury and repair. J Clin Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
- Morille, M., Passirani, C., Vonarbourg, A., Clavreul, A., Benoit, J. P. Progress in developing cationic vectors for non-viral systemic gene therapy against cancer. Biomaterials. (24-25), 3477-3496 (2008).
- Schnoor, M., et al. Efficient non-viral transfection of THP-1 cells. J Immunol Methods. 344 (2), 109-115 (2009).
- Maeß, M. B., Buers, I., Robenek, H., Lorkowski, S. Improved protocol for efficient nonviral transfection of premature THP-1 macrophages. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (5), (2011).
- Ma, W., Liu, Y., Ellison, N., Shen, J. Induction of C-X-C chemokine receptor type 7 (CXCR7) switches stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling and phagocytic activity in macrophages linked to atherosclerosis. J Biol Chem. 288 (22), 15481-15494 (2013).
- Xie, Q., et al. Cell surface localization of ABCG1 does not require LXR activation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26 (11), 143-144 (2006).
- Buers, I., Robenek, H., Lorkowski, S., Nitschke, Y., Severs, N. J., Hofnagel, O. TIP47, a lipid cargo protein involved in macrophage triglyceride metabolism. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (5), 767-773 (2009).
- Robenek, H., Buers, I., Hofnagel, O., Lorkowski, S., Severs, N. J. GFP-tagged proteins visualized by freeze-fracture immuno-electron microscopy: A new tool in cellular and molecular medicine. J Cell Mol Med. 13 (7), 1381-1390 (2009).
- Guh, J. H., et al. Development of novel adenosine monophosphate-activated protein kinase activators. J Med Chem. 53 (6), 2552-2561 (2010).
- Park, E. K., Jung, H. S., Yang, H. I., Yoo, M. C., Kim, C., Kim, K. S. Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli. Inflamm Res. 56 (1), 45-50 (2007).
- Maeß, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli. J Immunol Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).
- Angosto, D., et al. Evolution of inflammasome functions in vertebrates: Inflammasome and caspase-1 trigger fish macrophage cell death but are dispensable for the processing of IL-1b. Innate Immun. 18 (6), 815-824 (2012).
- Latz, E., Xiao, T. S., Stutz, A. Activation and regulation of the inflammasomes. Nat Rev Immunol. 13 (6), 397-411 (2013).
- Muruve, D. A., et al. The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response. Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).
