Misure comportamentali e locomotore Utilizzo di un campo aperto Sistema di Monitoraggio Attività per le Malattie muscolo scheletrico

La misurazione di attività in campo aperto è un test in vivo che può essere utile per valutare la progressione della malattia e l'efficacia dei farmaci in modelli animali di malattie neuromuscolari ^6,7,11-14. Come mostrato in figura 2, si fornisce una valutazione dei livelli di attività che rispecchiano funzione locomotiva. Questa è una misura diversa da quella forza muscolare, che lo rende una misura ideale outcome secondario o ausiliario ad esibirsi in uno studio preclinico di droga. Inoltre, è un clinicamente rilevante ^15, misura non invasiva, che può essere eseguita più volte per tutta la durata dello studio. Tuttavia, l'attività comportamentale e locomotiva è influenzata anche da altri fattori, come pure (cioè la manipolazione sperimentatore, le condizioni ambientali, e cognizione), la creazione di variazione dei dati di attività in campo aperto. L'obiettivo di questo documento è quello di fornire un protocollo ben collaudato e standardizzato che riduce la variazione e permette risultati di essere compared su più laboratori, nella speranza di migliorare la traduzione all'interno del nostro campo.

Uno dei principali svantaggi di questa misura è che è altamente variabile e influenzato da numerosi fattori esterni. Tuttavia, abbiamo preso questo in considerazione durante lo sviluppo del protocollo. Abbiamo valutato una serie di protocolli di sperimentazione che vanno in durata da 1-5 giorni di raccolta dei dati. Alla fine, abbiamo stabilito che l'esecuzione di strumento acclimatazione prima della raccolta dei dati per familiarizzare gli animali con l'ambiente camera di prova e performanti 4 giorni di raccolta dei dati ha ridotto significativamente la quantità di variazione dei dati di outcome ^5. Questo protocollo è stato originariamente progettato per valutare i livelli comportamentali e locomotiva di attività nel modello di topo mdx; Tuttavia, questo protocollo è stato recentemente validato nel modello animale Dy2J pure ^6. Si suggerisce che il protocollo essere standardizzato nel vostro laboratorio per ciascun modello animale prima di usarlo in uno studio preclinico.

Attività sul campo aperto varia in base al background genetico ^{17, 18-20} sesso, di ¹⁸ anni, e il ritmo circadiano ^21. Ciò richiede di animali della stessa età, sesso e background genetico da valutare allo stesso tempo. Durante le fasi di pianificazione, un'attenta riflessione dovrebbe essere messo a decidere a quale età o età aperto campo di attività di livello saranno valutati. Ogni modello animale ha una sua progressione della malattia distinta e fenotipo locomotiva e comportamentale, che variano in gravità e da ^6,15 anni (Figura 2 e Figura 3). Pertanto, è importante determinare punti di tempo clinicamente e patologicamente rilevanti per valutare le misure di attività in campo aperto. Il numero totale di animali necessari in ciascun gruppo di trattamento per rilevare differenze statisticamente significative varia a seconda del modello animale, l'età, il sesso e pure. Di conseguenza, i calcoli di dimensione del campione pertinenti dovrebbero essere eseguite durante le fasi di pianificazione per determine il numero totale di animali necessari in ciascun gruppo di trattamento per rilevare differenze statisticamente significative. Questi calcoli dovrebbero anche prendere in considerazione ulteriori misure di esito utilizzate nello studio (ad esempio, misure di forza di presa o istologica analisi). Sulla base dei nostri calcoli di potenza, di solito utilizziamo 10-12 animali per gruppo di trattamento. Inoltre, particolare attenzione deve essere rivolta a ciò che il controllo ceppo viene utilizzato nello studio. C'è una tendenza per i ceppi di controllo inadeguate per essere utilizzato in studi preclinici. Ad esempio, i topi BL6 sono spesso usati come un ceppo di controllo per topi mdx; Tuttavia, il topo mdx è su uno sfondo BL10. Come si vede nella figura 3, i topi BL10 sono molto più attivi rispetto ai topi BL6, che rendono impossibile il confronto dei dati mdx e BL6. Quando la conduzione di studi preclinici sui topi mdx, topi BL10 dovrebbero essere usati come ceppo di controllo. Inoltre, se uno studio è stato condotto con i topi Dy2J, topi BL6 devono essere utilizzati come il contrceppo olo.

Piccoli cambiamenti ambientali possono influenzare in modo significativo i livelli di attività. Questi includono l'illuminazione, la temperatura, l'umidità, l'odore, il rumore, e ^4,15 l'attività umana. Pertanto, è molto importante che il test viene eseguito in una stanza a temperatura ed umidità controllata con illuminazione non diretta allo stesso tempo ogni giorno ^5. Le camere di prova devono essere equamente distanziati in tutta la stanza e non posti sotto illuminazione diretta o in ombra o oscuri angoli ^5. Gli animali devono essere assegnati in modo casuale a loro camere di prova ogni giorno per ridurre gli effetti delle diverse condizioni ambientali in tutta la stanza, e dovrebbero avere la possibilità di acclimatarsi alla sala prove per 10-30 min prima della raccolta dei dati. Assicurati di seguire l'assegnazione scatola di ogni animale per tutta la durata dello studio al fine di garantire che ogni influenza di scatola / ambiente è equamente distribuito tra i diversi gruppi di trattamento. Gli individui carico l'animals nelle camere di prova e la manipolazione degli animali per tutta la durata dello studio dovrebbero essere accecati al gruppo di trattamento, e il ceppo animale quando possibile. In molti casi i genotipi colpite sono notevolmente diverse da quelle dei relativi controlli e accecante non è possibile. Tuttavia, gli individui devono sempre essere accecati tra i gruppi trattati e non trattati. Inoltre, tutti gli individui dovrebbero lasciare la stanza durante la raccolta dei dati per ridurre il rumore e le distrazioni all'interno della stanza, e tutte le camere devono essere puliti con cura dopo ogni sessione di raccolta dati. Queste azioni saranno ridurre significativamente variazione dei dati. E 'importante notare che gli animali sono anche molto sensibili all'adattamento ^15. Pertanto, si suggerisce che gli animali siano rimossi dalla camera di prova subito dopo l'60 min di raccolta dei dati ogni giorno e che i livelli di attività in campo aperto da valutare non più di una volta al mese.

La distanza totale percorsa e movimento totalemisure di tempo mento tendono ad essere campo aperto più sensibili misure di attività ^5. Nel modello Dy2J, la misurazione dell'attività verticale tende ad essere la misura dell'attività campo aperto più sensibile (Figura 3); Tuttavia, può essere difficile per catturare misurazione dell'attività verticali accurati animali più piccoli. Ad esempio, è possibile che un animale più piccolo esporrà comportamento allevamento e il sensore non catturare causa dell'altezza del sensore verticale. Come risultato, si consiglia di animali di prova non più di 5 settimane di età. E 'anche possibile che un animale dormirà tutta la durata di una sessione di raccolta dati. Se questo è il caso, è opportuno aggiungere un ulteriore giorno di raccolta dei dati. Infine, povero allineamento del divisore quadrante o il blocco dei sensori all'interno della scatola può provocare dati inesatti pure. Pertanto, è molto importante effettuare un controllo preliminare sensore, prima del test, e rivedere tutti i dati successivi al termine delogni sessione di raccolta dati.

L'attenzione dovrebbe anche essere presa quando si analizzano i dati di attività in campo aperto. Aperto dati attività sul campo ha la tendenza ad essere normalmente non distribuiti e hanno valori anomali ^4. Prima di eseguire eventuali analisi statistiche, i nostri biostatistici consiglio vivamente la verifica dei dati di normalità e di valori anomali. Se i dati non sono distribuiti normalmente, si dovrebbe considerare l'utilizzo di un test non parametrico quando si confrontano i mezzi. Inoltre, tutti i dati devono essere analizzati da un individuo cieco a ciò che i gruppi di trattamento sono.

Nel complesso, l'attività di misura in campo aperto ha importanti vantaggi: a) si tratta di una valutazione complessiva di entrambi locomotoria e l'attività comportamentale, che è forte, ma non sempre correlata con la funzione di locomotiva; b) si tratta di una misura facile da eseguire; c) non richiede la manipolazione degli animali durante la prova; d) è una misura non invasiva che può essere eseguita più di una volta per tutta la durata di una study; e) nessun addestramento speciale è necessario per eseguire il test; f) più gli animali possono essere testati in una sola volta; e g), si tratta di una misura di esito clinicamente rilevante ^5,16. Tuttavia, quando si prova terapeutica, tenere presente che altri fattori possono influenzare il comportamento di un animale, e, a sua volta misure di attività in campo aperto. I farmaci possono avere SNC e o altri effetti a livello del corpo, e il comportamento può anche essere influenzato da un ambiente stressante. Di conseguenza, può essere difficile distinguere se i cambiamenti nei livelli di attività di locomotive o comportamentali sono legati a cambiamenti nella funzione muscolare, la forza muscolare, o sono il risultato di effetti collaterali del farmaco. Pertanto, ulteriori saggi funzionali, istologiche e molecolari o dovrebbero essere condotte pure. Questo protocollo standardizzato è stato anche utilizzato con successo in altre malattie muscolari ^4,17; Tuttavia, come visibile in figura 3, gli studi pilota dovrebbero essere eseguiti inizialmente per valutare la sensibilità della misura nell'animalemodello.