İskelet Kası Hastalıkları Açık Saha Aktivite İzleme Sisteminin Kullanılması Davranış ve Hareket Ölçümleri
Summary
Açık alan aktivite düzeyleri lokomotif ve davranışsal aktivite düzeylerini değerlendirmek için kullanılır. Bu protokol nöromüsküler bozuklukların klinik öncesi çalışmalarda kullanmak için iyi tasarlanmış, standart bir protokol sağlar.
Abstract
Açık alan etkinliği izleme sistemi kapsamlı lokomotor ve farelerin davranış aktivite düzeylerini değerlendirir. Bu nöromüsküler hastalığı ve hareket ve / veya kas fonksiyonunu artırabilir tedavi edici ilaçlar etkinliğinin hayvan modellerinde lokomotif değer düşüklüğünün değerlendirilmesi için yararlı bir araçtır. Açık alan etkinlik ölçümü yaygın kavrama gücü ölçümleri ile değerlendirilir kas gücü, farklı bir ölçü sağlar. Ayrıca ek sonuç ölçütleri ile kullanıldığında ilaçların yanı sıra diğer vücut sistemlerini etkileyebilir nasıl gösterebilir. Ayrıca, katedilen toplam mesafe gibi önlemler 6 dakika yürüme testi, klinik deneme sonuç ölçümlerini ayna. Ancak, açık alan etkinlik izleme de önemli zorluklar ile ilişkili: Açık alan etkinliği ölçümleri hayvan ırk, yaş, cinsiyet, ve sirkadiyen ritmine göre değişir. Ayrıca, oda sıcaklığı, nem, aydınlatma, gürültü, ve hatta koku değerlendirme sonuçlarını etkileyebilir. Genel olarak, bu manuscript nöromüsküler hastalıklar hayvan modellerinde klinik öncesi denemeler için iyi test edilmiş ve standartlaştırılmış açık alan aktivitesi SOP sağlar. Biz önemli hususlar, tipik sonuçları, veri analizi ve detay güçlü ve açık alan testi zayıflıkları bir tartışma sağlar. Bir klinik öncesi deneme açık alan aktivitesi kullanılarak Buna ek olarak, biz en uygun çalışma tasarımı için öneriler sağlamak.
Introduction
Hayvan modelleri hastalık mekanizmaları hakkında öğrenme için yararlı olmuştur, ancak klinik çalışmalarda tedavinin etkinliğini öngörmek kendi programı sıkça 1-3 öne sürülmüştür. Çok sayıda "umut verici" klinik öncesi çalışmalar, her yıl yayınlanmaktadır; Klinik araştırmanın taşındı ancak, önerilen müdahalelerin çok az olumlu sonuçlar göstermektedir. Bu uyumsuzluklar genellikle yayın yanlılığı, aşırı iyimser sonuçlara atfedilen ve kötü tasarlanmış ve tekrarı olmayan sonuçlara 1-3 yol pre-klinik çalışmalar yürütülür.
Nöromüsküler hastalıklar için ilaç geliştirme güncel gelişmeler ile, iyi tasarlanmış klinik öncesi çalışmalarda artan bir ihtiyaç vardır. Özellikle, valide, tekrarlanabilir ve çevrilebilir sonuç ölçümleri ile, bir standart ve kör bir biçimde gerçekleştirilebilir titiz yöntemleri için bir ihtiyaç vardır. Konjenital kas üyesi Hastalık Konsorsiyumu gibidaha titiz preklinik çalışmalar yapmak arzusu, biz burada paylaşmak bizim Standart Operating Procedure Açık Saha Aktivitesi (SOP). Bu SOP önce 4 doğrulanmış ve Duchenne müsküler distrofi (DMD) hayvan modellerinde 5 için TEDAVİ nmd en SOP'ların bir parçası olarak yayınlandı. Biz 6,7 fenotipik ve lama2 dy-2J / J (Dy2J) fareler, konjenital müsküler distrofi (CMD) için hayvan modeli de dahil olmak üzere, nöromüsküler hastalık hayvan modellerinde çeşitli çeşitli ilaçların terapötik etkinliğini test etmek için bu yöntemi kullandık . Buna karşılık, bu makalede daha önce yayınlanmış TEDAVİ NMD SOP 5 uyarlanmıştır.
Açık alan etkinliği izleme sistemi kapsamlı lokomotor ve lokomotif fonksiyonu ile ilişkili olabilir farelerin davranış aktivite düzeylerinin, değerlendiriyor. Test da yaygın gibi anksiyete ve keşif davranışları 8-10 değerlendirmek için kullanılır. Özel olarak, açık alan eşek için yararlı bir araçtırlokomotif nöromüsküler hastalık 11,12 hayvan modellerinde bozukluğu ve hareket ve / veya motor fonksiyon 6,7,13,14 artırabilir tedavi edici ilaçlar etkinliğini essing. Açık alan faaliyet değerlendirme sık kavrama gücü ile ölçülür kas gücü, farklı bir ölçü sağlar ve ilaçların yanı sıra 5 (merkezi sinir sistemi) yani diğer vücut sistemlerini etkileyebilir nasıl gösterir. Ayrıca, açık alanda etkinlik ölçüsü, toplam katedilen mesafe, submaksimal egzersiz performansı ve yaşam 15,16 kalitesi üzerinde duruluyor 6 dakika yürüme testi, klinik deneme sonuç ölçümlerini aynalar. Genel olarak bu açık alan aktivitesi klinik öncesi çalışmalarda kullanmak için yararlı bir ikincil veya yardımcı sonuç ölçü testi yapar. Ancak, açık alan aktivitesi izleme sistemi de onunla ilişkili önemli zorlukları vardır. Test davranışsal ve harici bir çok etkilenir oldukça değişken olabilirfaktörler. Örneğin, bu davranış, motor çıkışı 10 ek olarak, araştırıcı sürücü (örneğin bilişsel), anksiyete, hastalık, sirkadyan ritim, çevre faktörleri, genetik yapı ile etkilenebilir. Sonuç olarak, kontrol edilen bir ortam olan standart bir şekilde, bu tedbire yapılması zorunludur. Burada sunulan protokol ayrıntılı olarak açık alanda faaliyet SOP açıklar. Bu adım adım prosedürleri ve çevre koşullarını kontrol etmek ve daha detaylı değişkenlik, tipik sonuçlar, veri analizi ve Ölçme değerlendirmenin güçlü ve zayıf yönlerini azaltmak için önemli hususlar daha fazla tartışma sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Açık alan etkinliği, ölçüm nöromüsküler hastalık 6,7,11-14 hayvan modellerinde hastalık ilerlemesi ve ilaç etkinliğinin değerlendirilmesi için yararlı bir in vivo deneydir. Şekil 2'de gösterildiği gibi, genel olarak lokomotif fonksiyonunu yansıtmaktadır aktivite seviyelerinin değerlendirilmesini içerir. Bu klinik öncesi bir ilaç çalışmasında gerçekleştirmek için ideal bir sekonder veya yardımcı sonuç ölçüsü yapmak kas gücü farklı bir ölçüsüdür. Buna ek olarak, bir çalışma süresi boyunca birden fazla kez yapılabilir klinik olarak anlamlı bir 15, invaziv olmayan ölçüsüdür. Ancak, davranışsal ve lokomotif aktivite de açık alanda faaliyet verilerinin varyasyon oluşturma (yani deneyci işleme, çevre koşulları, ve biliş) gibi ek faktörler tarafından etkilenmektedir. Bu yazının amacı değişimini azaltır ve sonuçları c olmasını sağlayan iyi test edilmiş ve standart bir protokol sağlamaktırBizim alanında çeviri geliştirilmesi umuduyla, birden laboratuarları karşısında ompared.
Bu yöntemin bir dezavantajı, büyük bir çok değişken ve çok sayıda dış faktörler tarafından etkilenir olmasıdır. Protokolünün geliştirilmesi Ancak, biz bu dikkate aldı. Veri toplama 1-5 gün süresi değişen test protokolleri çeşitli değerlendirildi. Sonunda, biz veri toplamadan önce enstrüman uyum saglanacagini performans test odası çevre ile hayvanları oldum ve veri toplama gerçekleştirmeden 4 gün anlamlı sonuç verileri 5 varyasyon miktarı azaltılmış olduğu tespit. Bu protokol başlangıçta mdx fare modelinde davranışsal ve lokomotif aktivite düzeylerini değerlendirmek için tasarlanmıştır; ancak, yakın zamanda bu protokol oyuk 6 olarak Dy2J hayvan modelinde doğrulandı. Bu protokol bir preklinik çalışmada kullanmadan önce her hayvan modeli için laboratuvar içinde standardize edilmesi önerilmektedir.
Açık alan etkinliği genetik arka plan 17, cinsiyet 18-20, 18 yaş ve sirkadiyen ritim 21 göre değişir. Bu, aynı zamanda değerlendirilecek aynı yaş, cinsiyet, ve genetik arka hayvanlar gerektirir. Planlama aşamalarında, dikkatli düşünce değerlendirilecektir açık ne yaş veya yaşları alan aktivite düzeyleri de karar içine konulmalıdır. Her hayvan modeli şiddeti ve yaş 6,15 (Şekil 2 ve Şekil 3) göre değişir kendi farklı hastalığın ilerlemesini ve lokomotif ve davranışsal fenotip vardır. Bu nedenle, açık alan aktivitesi tedbirleri değerlendirmek için klinik ve patolojik ilgili zaman noktalarını belirlemek önemlidir. Istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık tespit etmek için, her tedavi grubunda ihtiyaç duyulan hayvan sayısı hem de hayvan modellerinde, yaş ve cinsiyete göre değişir. Sonuç olarak, ilgili örneklem büyüklüğü hesaplamaları da belirler için planlama aşamalarında yapılmalıdırHer bir tedavi grubunda ihtiyaç duyulan hayvan sayısı ine istatistiksel olarak önemli farklar tespit etmek. Bu hesaplamalar da çalışmada kullanılan dikkate ek sonuç tedbirleri (örneğin, kavrama gücü ölçümleri veya histolojik analizler) dikkate almalıdır. Bizim güç hesapları dayanarak, biz genellikle tedavi grubu başına 10-12 hayvanları kullanmak. Buna ek olarak, özel bir dikkat çalışmada kullanılan ne kontrol suşu için dikkat edilmelidir. Klinik çalışmalarda kullanılmak üzere uygun olmayan kontrol suşları için bir eğilimi vardır. Örneğin, sık sık BL6 fareler MDX fareler için bir kontrol suşu olarak kullanılır; Ancak, mdx fare BL10 arka plan üzerinde. Şekil 3'te görüldüğü gibi, BL10 farenin çok daha aktif imkansız MDX ve BL6 verileri karşılaştırmak BL6 farelerinde, daha vardır. MDX fareler ile ilgili klinik öncesi çalışmalar yapılırken, BL10 farenin kontrol suşu olarak kullanılmalıdır. Bir çalışma Dy2J fareleri ile yürütülen Dahası, farenin BL6 Contr olarak kullanılmalıdırol süzün.
Küçük çevresel değişiklikler de önemli aktivite düzeylerini etkileyebilir. Bu aydınlatma, sıcaklık, nem, koku, gürültü, insan aktivite 4,15 bulunur. Bu nedenle, test, aynı zamanda, her gün 5 ile doğrudan olmayan aydınlatma sıcaklık ve nem kontrollü bir odada yapılması çok önemlidir. Test odaları eşit oda boyunca aralıklı ve doğrudan ışık altında ya da gölgeli veya karanlık köşelerde 5 yerleştirilir edilmelidir. Hayvanlar rastgele oda boyunca çevresel koşulları değişen etkilerini azaltmak için her gün kendi test odaları tahsis edilmelidir, ve onlar, veri toplamadan önce 10-30 dakika boyunca test odasına gelmesini izin verilmelidir. Kutu / çevre üzerinde bir etkisi eşit farklı tedavi grupları arasında dağıtılır sağlamak için çalışma süresi boyunca her bir hayvanın kutu atama izlemek için emin olun. Anima yükleme bireylerTest kapları ve bu çalışma süresi boyunca hayvanlar işleme içine mi kör tedavi grubuna ve hayvansal gerilme mümkün olmalıdır. Birçok durumda etkilendiğini genotipleri ilgili kontrollerden önemli ölçüde farklıdır ve kör mümkün değildir. Ancak, bireylerin her zaman tedavi edilen ve edilmeyen gruplar arasında kör olmalıdır. Ayrıca, tüm bireylerin oda içinde gürültü ve dikkat dağıtıcı unsurları azaltmak için veri toplama sırasında odayı terk etmeli ve tüm odaları iyice veri toplama Her oturumda aşağıdaki temizlenmelidir. Bu işlemler büyük ölçüde veri değişimini azaltacaktır. Bu hayvanlar da adaptasyon 15 derece duyarlı olduğunu not etmek önemlidir. Bu nedenle, hayvanların ayda bir defadan fazla değerlendirilebilir doğrudan veri toplama 60 dakika her gün ve açık alan etkinliği düzeyleri aşağıdaki test bölmesinden çıkarılır önerilmektedir.
Toplam katedilen mesafe ve toplam hareketment zaman ölçümleri en hassas Açık alan etkinliği, 5 ölçümleri olma eğilimindedir. Dy2J modelde, dikey aktivite ölçümü en hassas Açık alan etkinliği ölçümü (Şekil 3) olmaktadır; Bununla birlikte, daha küçük hayvanlar doğru dikey etkinlik ölçümleri yakalamak zor olabilir. Örneğin, küçük bir hayvan besleme davranışı sergiler ve sensör, dikey sensörünün yüksekliğe yakalayamaz olanaklıdır. Sonuç olarak, biz erken yaşta 5 hafta daha test hayvanları öneririz. Bir hayvan, bir veri alma işleminin süresi boyunca uyku olması da mümkündür. Bu durumda, verilerin toplanması, bir gün daha eklenmesi tercih edilebilir. Son olarak, kutu içinde kadran bölücü veya sensörlerin blokaj yeterince düzgün yanı sıra doğru verilerin bulunmasına neden olabilir. Bu nedenle, sonuna aşağıdaki tüm verileri test öncesinde, bir sensör önceden kontrol gerçekleştirmek ve yorumlayan çok önemlidirHer veri toplama oturumu.
Açık alan aktivitesi veriler analiz edildiğinde Dikkat da alınmalıdır. Açık alan faaliyet verileri olmayan normal dağılım olabilir ve outliers 4 için bir eğilimi vardır. Istatistiksel analizler gerçekleştirerek öncesinde, bizim biyoistatistikçi derece normallik ve aykırı için verileri kontrol öneririz. Veri olmayan normal dağılım ise, bir aracı karşılaştırırken bir parametrik olmayan testi kullanılarak düşünmelisiniz. Buna ek olarak, tüm veriler Tedavi grupları ne kör bir birey tarafından analiz edilmelidir.
Genel olarak, açık alan aktivitesi ölçümü büyük avantajları vardır: a) güçlü, ama her zaman lokomotif işlevi ile korelasyon hem lokomotor ve davranışsal aktiviteleri, kapsamlı bir değerlendirmesidir; b) gerçekleştirmek için kolay bir ölçüdür; c) test sırasında hiçbir hayvan işleme gerektirir; d) bir Stu süresi boyunca bir defadan fazla uygulanabilir invazif olmayan bir ölçüsüdürdy; e) özel bir eğitim testi gerçekleştirmek için gerekli olan; f) Birden hayvanlar tek seferde test edilebilir; ve g) klinik olarak anlamlı bir sonuç ölçütü 5,16 olduğunu. Terapötikleri test Ancak, diğer faktörler bir hayvanın davranışlarını etkileyen ve sırayla açık alan aktivitesi ölçümleri aklınızda bulundurun. İlaçlar CNS ve veya diğer vücut geniş etkileri olabilir, ve davranış da stresli bir ortamda etkilenmiş olabilir. Bunun bir sonucu olarak, bu lokomotif ya da davranışsal etkinlik seviyelerinde değişiklikler, kas fonksiyonunda değişikliklere, kas gücü ile ilgili olarak veya ilaca bağlı yan etkilerin bir sonucu olup olmadığını ayırt etmek zor olabilir. Bu nedenle ek olarak, işlevsel ve histolojik ve moleküler deneyleri de yapılmalıdır. Bu standart bir protokol de başarıyla diğer kas hastalıklarında 4,17 kullanılmıştır; Şekil 3'te görüldüğü gibi, ancak, pilot çalışma hayvanda önlemin duyarlılığını değerlendirmek için, ilk yapılmalıdırmodeli.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu yayın Cure CMD, Fransız Atletik distrofi Derneği (AFM), Musküler Distrofi Derneği, Sağlık (1K26RR032082, 1P50AR060836-01, 1U54HD071601, 2R24HD050846-06) Ulusal Enstitüleri, Savunma Bakanlığı bir öteleme araştırma bursu (yoluyla finanse edilmektedir W81XWH-11-1-0330, W81XWH-11-1-0782, W81XWH-10-1-0659, W81XWH-11-1-0809, W81XWH-09-1-0599) ve Veli Projesi Musküler distrofi gelen bir pilot hibe ( PPMD).
Bu kağıt doğuştan kas hastalığı alanında rutin olarak kullanılan metodolojiler için SOP'ların bir dizi birkaç biridir. Bu çabalar Washington, DC Nisan 2013'te yapılan son Doğuştan kas hastalığı Konsorsiyumu Atölyesi, doğuştan kas hastalığı alanında üzerinde 20 uzmanları tarafından tartışıldı ve kurulan yansıtır
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Equipment | |||
| VersaMax Open Field Activity Monitoring system with acrylic test chambers, and X, Y, Z axis sensors | AccuScan Instruments, Inc. Columbus Ohio, USA | Retired | |
| Fusion Open Field Activity Monitoring system with acrylic test chambers, and X, Y, Z axis sensors | Omnitech Electronics, Inc. Columbus Ohio, USA | Suggested system currently on the market | |
| Computer | Dell, Inc. | ||
| Materials | |||
| Virkon-S Broad spectrum disinfectant (Potassium Peroxymonosulfate/ Sodium Chloride) | Pharmacal Research Laboratories, Inc. | ||
| Mice | |||
| B6.WK-Lama2dy-2J/J (Dy2J) | Jackson Lab | 000524 | |
| C57BL/6J (BL6) | Jackson Lab | 000664 | |
| SJL/J (SJL) | Jackson Lab | 000686 | |
| C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J (mdx) | Jackson Lab | 001801 | |
| C57BL/10ScSnJ (BL10) | Jackson Lab | 000476 |
References
- Worp, H. B., Howells, D. W., Sena, E. S., Porritt, M. J., Rewell, S., O'Collins, V., Macleod, M. R. Can Animal Models of Disease Reliably Inform Human Studies?. PLoS Med. 7 (3), 1000245-10 (2010).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
- Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
- Spurney, C., et al. Preclinical drug trials in the mdx mouse: Assessment of reliable and sensitive outcome measures. Muscle Nerve. 39, 591-602 (2009).
- Nagaraju, K., Carlson, G., De Luca, A. Behavioral and locomotor measurements using open field animal activity monitoring system. TREAT-NMD SOP Number M2.1.002. 2, (2010).
- Yu, Q., et al. Omigapil treatment decreases fibrosis and improves respiratory rate in dy(2J) mouse model of congenital muscular dystrophy. PLoS One. 8 (6), e65468 (2013).
- Sali, A., et al. Glucocorticoid-treated mice are an inappropriate positive control for long-term preclinical studies in the mdx mouse. PLoS One. 7 (4), e34204 (2012).
- Belzung, C., Griebel, G. Measuring normal and pathological anxiety-like behaviour in mice: a review. Behav Brain Res. 125, 141-149 (2001).
- Prut, L., Belzung, C. The open field as a paradigm to measure the effects of drugs on anxiety-like behaviors: a review. Eur J Pharmacol. 463, 3-33 (2003).
- Walsh, R. N., Cummings, R. A. The open-field test: A critical Review. Psychological Bulletin. 83, 482-504 (1976).
- Raben, N., Nagaraju, K., Lee, E., Plotz, P. Modulation of disease severity in mice with targeted disruption of the acid alpha-glucosidase gene. Neuromuscul Disord. 10, 283-291 (2000).
- Nagaraju, K., et al. Conditional up-regulation of MHC call I in skeletal muscle leads to self-sustaining autoimmune myositis and myositis-specific autoimmune myositis and myositis-specific autoantibodies. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (16), 9209-9214 (2000).
- Erb, M., et al. Omigapil ameliorates the pathology of muscle dystrophy caused by laminin-alpha2 deficiency. J Pharmacol Exp Ther. 331 (3), 787-795 (2009).
- Malerba, A., et al. Chronic systemic therapy with low-dose morpholino oligomers ameliorates the pathology and normalizes locomotor behavior inmdxmice. Mol Ther 1. 9 (2), 345-354 (2011).
- Grounds, M. D., Radley, H. G., Lynch, G. S., Nagaraju, K., De Luca, A. Towards developing standard operating procedures for pre-clinical testing in the mdx mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Neurobiol Dis. 31 (1), 1-19 (2008).
- Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies. Neuromuscul Disord. 22 (1), 34-42 (2012).
- Rayavarapu, S., Van de meulen, J. H., Gordish-Dressman, H., Hoffman, E. P., Nagaraju, K., Knoblack, S. M. Characterization of Dysferlin Deficient SJL/J Mice to Assess Preclinical Drug Efficacy: Fasudil Exacerbates Muscle Disease Phenotype. PLoSOne. 5 (9), e12981 (2010).
- Valle, F. P. Effects of strain, sex, and illumination on open-field behavior of rats. Am J Psychol. 83, 103-111 (1970).
- Ramos, A., et al. Evaluation of Lewis and SHR rat strains as a genetic model for the study of anxiety and pain. Behav Brain Res. 129, 113-123 (2002).
- Bowman, R. E., Maclusky, N. J., Diaz, S. E., Zrull, M. C., Luine, V. N. Aged rats: sex differences and responses to chronic stress. Brain Res. 1126, 156-166 (2006).
- Sakai, K., Crochet, S. Differentiation of presumed serotonergic dorsal raphe neurons in relation to behavior and wake-sleep states. Neuroscience. 104, 1141-1155 (2001).
