מדידות התנהגות ושל תנועה באמצעות מערכת ניטור פעילות שדה פתוחה למחלות שריר שלד
Summary
רמות פעילות השדה פתוחות נמצאות בשימוש על מנת להעריך את רמות פעילות קטר והתנהגותיים. פרוטוקול זה מספק פרוטוקול מעוצב היטב, סטנדרטי לשימוש בניסויים בבעלי הפרעות תוקפת.
Abstract
מערכת ניטור פעילות השדה הפתוחה באופן מקיף מעריכה של תנועה ורמות פעילות התנהגות של עכברים. זהו כלים שימושיים לבחינת ירידת ערך קטר במודלים של בעלי חיים למחלות ויעילות של סמי מרפא שעשוי לשפר את תפקוד תנועה ו / או שרירים תוקפת. מדידת פעילות השדה הפתוחה מספקת מדד שונה מכוח השרירים, אשר הוערך בדרך כלל על ידי מדידות כוח האחיזה. זה יכול גם להראות איך תרופות יכולות להשפיע על מערכות אחרות בגוף, כמו גם בעת שימוש במדדי תוצאה נוספות. בנוסף, צעדים כגון מרחק כולל נסע לשקף את מבחן הליכה 6 דקות, מדד תוצאת ניסוי קליני. עם זאת, ניטור פעילות שדה פתוח קשור גם אתגרים משמעותיים: מדידות פעילות שדה פתח משתנות בהתאם לזן בעלי חיים, גיל, מין, וקצב היממה. בנוסף, טמפרטורת חדר, לחות, תאורה, רעש, ואפילו ריח יכולים להשפיע על תוצאות הערכה. מ 'בסך הכל, זהanuscript מספק SOP פעילות שדה פתוח נבדק היטב וסטנדרטי לניסויים פרה קליניים במודלים של בעלי חיים למחלות תוקפת. אנו מספקים דיון בשיקולים חשובים, תוצאות טיפוסיות, ניתוח נתונים, ופירוט יתרונות וחסרונות של בדיקות שדה פתוחות. בנוסף, אנו מספקים המלצות לתכנון מחקר אופטימלי בעת השימוש בפעילות שטח פתוחה במשפט פרה קליני.
Introduction
מודלים של בעלי החיים היו מועילים ללמידה על מנגנוני מחלה, אבל השירות שלהם בניבוי יעילות טיפול בניסויים קליניים בתדירות גבוהה אותגר 1-3. מחקרים פרה "מבטיחים" רבים מתפרסמים בכל שנה; עם זאת, מעט מאוד מההתערבויות המוצעות להראות תוצאות חיוביות, כאשר עברו לניסוי קליני. פערים אלו לעתים קרובות מיוחסים להטיית פרסום, מסקנות אופטימיות מדי, ושלא תוכננו כראוי והוצאו להורג מחקרים טרום קליניים שיובילו לתוצאות irreproducible 1-3.
עם ההתקדמות הנוכחית בפיתוח תרופות לטיפול בהפרעות תוקפת, יש צורך הולך וגובר לניסויים פרה קליניים מתוכננים היטב. בפרט, יש צורך בשיטות קפדניות שיכול להתבצע באופן סטנדרטי והתעוור, עם תוקף ואמצעים, לשחזור, לתרגום תוצאה. כחבר השרירים מולדים מחלת Consortium, עםהרצון לבצע מחקרים פרה קליניים קפדניים יותר, שאנו חולקים כאן Standard Operating נוהל (SOP) לפתיחת שדה פעילות שלנו. SOP זו קיבל תוקף בעבר 4 ופורסם כחלק מהנהלים של TREAT-NMD למודלים של בעלי חיים דושן ניוון שרירים (DMD) 5. יש לנו להשתמש במתודולוגיה זו לפנוטיפ ולבדוק את היעילות הטיפולית של תרופות רבות במגוון רחב של מודלים של בעלי חיים למחלות תוקפת, כולל עכברי dy-י 2 Lama2 / J (Dy2J), מודל החיה בניוון שרירים מולדים (CMD) 6,7 . בתורו, מאמר זה הוא עיבוד SOP TREAT-NMD 5 שפורסם בעבר שלנו.
מערכת ניטור פעילות השדה הפתוחה באופן מקיף מעריכה של תנועה ורמות התנהגות פעילות של עכברים, שיכול להיות מתואמת עם פונקצית קטר. המבחן הוא גם בשימוש נרחב להערכת חרדה כמו והתנהגויות גישוש 8-10. בפרט, השטח הפתוח הוא כלי שימושי עבור התחתEssing ירידת ערך קטר במודלים של בעלי חיים למחלות neuromuscular 11,12 והיעילות של סמי מרפא שעשויה לשפר את התנועה ו / או מוטורי פונקצית 6,7,13,14. הערכת פעילות השדה הפתוחה מספקת מדד שונה מכוח השריר, הנמדד בדרך כלל עם כוח אחיזה, וזה מראה עד כמה תרופות עלולות להשפיע על מערכות אחרות בגוף (כלומר מערכת עצבים המרכזית), כמו גם 5. בנוסף, מידת פעילות השדה הפתוחה, מרחק כולל נסע, משקפת את מבחן 6 דקות הליכה, מדד תוצאת ניסוי קליני, המתמקד בביצועי פעילות גופני submaximal ואיכות החיים 15,16. בסך הכל זה הופך את פעילות השדה הפתוחה לבחון מדד תוצאה משנית או עזר מועיל לשימוש בניסויים בבעלים. עם זאת, מערכת ניטור פעילות השדה הפתוחה יש גם אתגרים משמעותיים הקשורים אליו. המבחן הוא התנהגותי ויכול להיות די משתנה כפי שהוא מושפע ממספר רב של חיצוניגורמים. לדוגמא, התנהגות זו יכולה להיות מושפעת על ידי כונן גישוש (כלומר הקוגניציה), חרדה, בחילה, קצב היממה, גורמים סביבתיים, רקע גנטי, בנוסף לתפוקת מנוע 10. כתוצאה מכך קיים הכרח לבצע צעד זה, באופן סטנדרטי עם סביבה מבוקרת. הפרוטוקול המובא כאן מתאר SOP פעילות השדה הפתוח שלנו בפירוט. הוא מספק נהלים ודיון נוספים בשיקולים חשובים לשלוט בתנאים סביבתיים ולסייע בהפחתת שונות, תוצאות טיפוסיות, ניתוח נתונים, ואת נקודות החוזק של ההערכה וחולשות ביתר פירוט צעד אחר צעד.
Protocol
Representative Results
Discussion
מדידת פעילות השדה הפתוחה היא assay in vivo שיכול להיות מועיל להערכת התקדמות מחלה ויעילות תרופה במודלים של בעלי חיים למחלות neuromuscular 6,7,11-14. כפי שניתן לראות באיור 2, שהוא מספק הערכה של רמת הפעילות שמשקפת בדרך כלל פונקצית קטר. זהו מדד שונה מכוח השרירים, מה שהופך את מדד תוצאה משנית או עזר אידיאלי לביצוע במחקר תרופה פרה קליני. בנוסף, זה 15, מידה לא פולשנית רלוונטית מבחינה קלינית, אשר יכול להתבצע מספר פעמים בכל משך הזמן של מחקר. עם זאת, פעילות התנהגותית וקטר מושפע גם מגורמים נוספים, כמו גם (כלומר טיפול הנסיין, תנאים סביבתיים, וקוגניציה) יצירת וריאציה בנתוני פעילות שדה פתוח. המטרה של מאמר זה היא לספק לפרוטוקול שנבדק היטב וסטנדרטי המפחית וריאציה ומאפשר תוצאות להיות גompared פני מעבדות מרובות, בתקווה לשפר את התרגום בתחום שלנו.
חסרון עיקרי של צעד זה הוא שזה משתנה מאוד ומושפע מגורמים חיצוניים רבים. עם זאת, לקחנו את זה בחשבון בעת פיתוח הפרוטוקול. החוקרים הערכנו מגוון רחב של פרוטוקולי בדיקה הנעים בזמן 1-5 ימים של איסוף נתונים. בסופו של הדבר קבע כי ביצוע הסתגלות מכשיר לפני איסוף הנתונים לקראו בעלי החיים עם סביבת חדר הבדיקה וביצוע 4 ימים של איסוף נתונים צמצמו באופן משמעותי את כמות הווריאציה בנתונים התוצאה 5. פרוטוקול זה תוכנן במקור כדי להעריך את רמות פעילות התנהגותית וקטר במודל עכבר MDX; עם זאת, פרוטוקול זה קבל תוקף לאחרונה במודל של בעלי החיים Dy2J כמו גם 6. הוא הציע כי הפרוטוקול להיות אחיד בתוך המעבדה שלך עבור כל דגם של בעלי חיים לפני השימוש בו במשפט פרה קליני.
פעילות שטח פתוחה משתנית בהתאם לרקע גנטי 17, מין 18-20, גיל 18, וקצב היממה 21. זה דורש בעלי חיים הבנים אותו הגיל, המין, והרקע גנטי להיות מוערכים באותו הזמן. במהלך שלבי תכנון, מחשבה זהירה צריכה להכניס להחליט באיזה גיל או גילים פתוחים שדה פעילות רמות יוערך. לכל אחד יש מודל חיה התקדמות משלו מובחנת מחלה והפנוטיפ קטר והתנהגותיות, המשתנה בחומרה ועל ידי גיל 6,15 (איור 2 ואיור 3). לכן, חשוב לקבוע נקודות קליניות ורלוונטיות פתולוגית זמן כדי להעריך צעדי פעילות שדה פתוחים. המספר הכולל של בעלי חיים הנדרשים בכל קבוצת טיפול כדי לזהות הבדלים משמעותיים מבחינה סטטיסטית משתנה בהתאם לדגם של בעלי חיים, גיל, ומין, כמו גם. כתוצאה מכך, צריכים גם להתבצע חישובי גודל מדגם רלוונטיים בשלבי התכנון לdetermine המספר הכולל של בעלי חיים הנדרשים בכל קבוצת טיפול כדי לזהות הבדלים משמעותיים מבחינה סטטיסטית. החישובים האלה צריכים גם לקחת באמצעי תמורה נוספת תוצאה השתמשו במחקר (למשל, מדידות כוח האחיזה או היסטולוגית מנתח). בהתבסס על חישובי הכח שלנו, אנו משתמשים בדרך כלל 10-12 חיות לכל קבוצת טיפול. בנוסף, תשומת לב מיוחדת צריך להיות משולם על מה שליטת מתח משמש במחקר. יש נטייה לזני שליטה לא ראויים לשימוש במחקרים פרה. לדוגמא, עכברי BL6 משמשים לעתים קרובות כמתח שליטה לעכברי MDX; עם זאת, עכבר MDX הוא על רקע BL10. כפי שניתן לראות באיור 3, עכברי BL10 הם הרבה יותר פעיל מאשר עכברי BL6, אשר עושים את זה אי אפשר להשוות נתונים MDX וBL6. בעת ביצוע מחקרים פרה עם עכברי MDX, יש להשתמש בעכברי BL10 כזן שליטה. יתר על כן, אם מחקר נערך עם עכברי Dy2J, יש להשתמש בעכברי BL6 כcontrזן ol.
שינויים סביבתיים קטנים יכולים גם להשפיע באופן משמעותי את רמות פעילות. אלה כוללים תאורה, טמפרטורה, לחות, ריח, רעש, ו4,15 פעילות אנושיות. לכן, זה מאוד חשוב שהבדיקה תבוצע בחדר מבוקר לטמפרטורה ולחות עם תאורה שאינה ישירה באותו זמן בכל יום 5. תאי הבדיקה צריכים להיות מחולק באופן שווה על פני החדר ולא תחת תאורה ישירה או בפינות מוצלות או כהה 5. בעלי חיים צריכים להיות באופן אקראי לתאי הבדיקה שלהם בכל יום כדי להפחית את ההשפעות של משתנה תנאים סביבתיים ברחבי החדר, והם צריכים להיות מותר להסתגל לחדר הבדיקות ל10-30 דקות לפני איסוף הנתונים. הקפד לעקוב אחר משימת התיבה של כל חיה בכל משך הזמן של המחקר כדי להבטיח כי כל השפעה של תיבה / סביבה מופצת באופן שווה בין קבוצות הטיפול השונות. האנשים טוענים האנימהls לתאי הבדיקה וטיפול בבעלי החיים בכל משך הזמן של המחקר צריך להיות עיוור לקבוצת הטיפול, ומתח בבעלי חיים במידת האפשר. במקרים רבים גנוטיפים מושפעים הם שונים במידה ניכרת מפקדים קשורים ומסנוור לא ניתן. עם זאת, תמיד צריכים להיות עיוורים אנשים בין קבוצות שטופלו ולא טופלו. יתר על כן, כל האדם צריך לצאת מהחדר במהלך איסוף הנתונים כדי להפחית את הרעש וסח דעת בתוך החדר, וכל התאים יש לנקות ביסודיות אחרי כל פגישה של איסוף נתונים. פעולות אלה יצמצמו משמעותי את השונות בנתונים. חשוב לציין כי בעלי חיים הם גם רגישים מאוד להסתגלות 15. לכן, הוא הציע שבעלי החיים יוסרו מחדר הבדיקה ישירות הבא 60 דקות של איסוף נתונים בכל יום ורמות פעילות שדה פתוח שיוערכו לא יותר מפעם בחודש.
המרחק הכולל נסע ומהלך כוללמדידות זמן ment נוטות להיות מדידות פעילות שטח פתוח הרגישים ביותר 5. במודל Dy2J, מדידת הפעילות האנכית נוטה להיות מידת פעילות שטח פתוח רגישה ביותר (איור 3); עם זאת, זה יכול להיות קשה כדי ללכוד מדידות פעילות אנכיות מדויקות בבעלי חיים קטנים יותר. לדוגמא, ייתכן שבעלי חיים קטנים יותר יפגינו התנהגות גידול והחיישן לא ללכוד אותו בשל הגובה של החיישן האנכי. כתוצאה מכך, אנו ממליצים בעלי חיים בדיקה לא לפני 5 שבועות של גיל. אפשר גם שבעלי חיים יוכלו לישון בכל משך הזמן של הפעלת איסוף הנתונים. אם זה המקרה, מן ראוי להוסיף יום נוסף של איסוף נתונים. לבסוף, יישור לקוי של המחיצה או חסימה של חיישני רבע בתוך התיבה יכול לגרום לנתונים לא מדויקים, כמו גם. לכן, זה מאוד חשוב לבצע precheck חיישן, לפני הבדיקה, ולסקור את כל הנתונים הבאים לסוףכל פגישת איסוף נתונים.
כמו כן יש לקחת בזהירות בעת ניתוח נתוני פעילות שדה פתוח. יש נתונים פעילות השדה פתוחים נטייה להיות לא מתפלג נורמלי ויש לי חריגים 4. לפני ביצוע כל ניתוחים סטטיסטיים, biostatisticians שלנו ממליץ בחום לבדוק את הנתונים לנורמליות וחריגות. אם הנתונים אינם מתפלגים נורמלי, יש לשקול שימוש בבדיקה פרמטרית כאשר משווים אמצעים. בנוסף, יש לנתח את כל הנתונים על ידי אדם העיוור כדי מה הן קבוצות הטיפול.
בסך הכל, יש לו את מידת פעילות השדה הפתוחה יתרונות עיקריים: א) היא הערכה מקיפה של שניהם של תנועה והפעילות התנהגותית, שהוא חזק, אבל לא תמיד מתואם עם פונקצית קטר; ב) זה צעד קל לביצוע; ג) זה לא דורש טיפול בבעלי חיים במהלך בדיקה; ד) מדובר באמצעי בלתי פולשני שניתן לבצע יותר מפעם אחת בכל משך הזמן של סטוdy; ה) אין צורך בהכשרה מיוחדת כדי לבצע את הבדיקה; ו) ניתן לבדוק בעלי חיים מרובים בבת אחת; וז) הוא מדד תוצאה רלוונטי מבחינה קלינית 5,16. עם זאת, כאשר בודקים תרופות, יש לזכור כי גורמים אחרים יכולים להשפיע על ההתנהגות של בעל חיים, והוא בתור מדידות פעילות שדה פתוח. תרופות יכולות להיות במערכת העצבים המרכזית ואו השפעות רחבות גוף אחרים, והתנהגות יכולה גם להיות מושפעות על ידי סביבה מלחיצה. כתוצאה מכך, זה יכול להיות קשה להבחין אם שינויים ברמות פעילות קטר והתנהגותיים הקשורים לשינויים בתפקוד שרירים, כוח שרירים, או הם תוצאה של תופעות לוואי מהתרופה. לכן, צריכים להתנהל מבחני פונקציונליים, היסטולוגית ואו מולקולריים נוספים גם כן. פרוטוקול סטנדרטי זה גם נוצל בהצלחה במחלות שריר אחרות 4,17; עם זאת, כפי שניתן לראות באיור 3, יש לבצע מחקרי טייס בתחילה להעריך את הרגישות של המדד בבעלי החייםמודל.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרסום זה ממומן באמצעות התרופה CMD, צרפתית שרירים Distrophy אגודה (AFM), מענק מחקר translational מניוון השרירים האגודה, המכונים הלאומיים לבריאות (1K26RR032082, 1P50AR060836-01, 1U54HD071601, 2R24HD050846-06), משרד הגנה ( W81XWH-11-1-0330, W81XWH-11-1-0782, W81XWH-10-1-0659, W81XWH-11-1-0809, W81XWH-09-1-0599) ומענק טייס מפרויקט ההורים השרירים Distrophy ( PPMd).
מאמר זה הוא אחד מכמה בסדרה לכתיבת נהלים למתודולוגיות המשמשת באופן שגרתי בתחום מחלת השריר המולדת. הוא משקף את המאמצים שנדונו והוקמו על ידי למעלה מ 20 מומחים בתחום של מחלת שריר מולדת בשריר מולדים מחלת Consortium הסדנה האחרונה, שנערכה בחודש אפריל 2013 בוושינגטון, DC
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Equipment | |||
| VersaMax Open Field Activity Monitoring system with acrylic test chambers, and X, Y, Z axis sensors | AccuScan Instruments, Inc. Columbus Ohio, USA | Retired | |
| Fusion Open Field Activity Monitoring system with acrylic test chambers, and X, Y, Z axis sensors | Omnitech Electronics, Inc. Columbus Ohio, USA | Suggested system currently on the market | |
| Computer | Dell, Inc. | ||
| Materials | |||
| Virkon-S Broad spectrum disinfectant (Potassium Peroxymonosulfate/ Sodium Chloride) | Pharmacal Research Laboratories, Inc. | ||
| Mice | |||
| B6.WK-Lama2dy-2J/J (Dy2J) | Jackson Lab | 000524 | |
| C57BL/6J (BL6) | Jackson Lab | 000664 | |
| SJL/J (SJL) | Jackson Lab | 000686 | |
| C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J (mdx) | Jackson Lab | 001801 | |
| C57BL/10ScSnJ (BL10) | Jackson Lab | 000476 |
References
- Worp, H. B., Howells, D. W., Sena, E. S., Porritt, M. J., Rewell, S., O'Collins, V., Macleod, M. R. Can Animal Models of Disease Reliably Inform Human Studies?. PLoS Med. 7 (3), 1000245-10 (2010).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
- Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
- Spurney, C., et al. Preclinical drug trials in the mdx mouse: Assessment of reliable and sensitive outcome measures. Muscle Nerve. 39, 591-602 (2009).
- Nagaraju, K., Carlson, G., De Luca, A. Behavioral and locomotor measurements using open field animal activity monitoring system. TREAT-NMD SOP Number M2.1.002. 2, (2010).
- Yu, Q., et al. Omigapil treatment decreases fibrosis and improves respiratory rate in dy(2J) mouse model of congenital muscular dystrophy. PLoS One. 8 (6), e65468 (2013).
- Sali, A., et al. Glucocorticoid-treated mice are an inappropriate positive control for long-term preclinical studies in the mdx mouse. PLoS One. 7 (4), e34204 (2012).
- Belzung, C., Griebel, G. Measuring normal and pathological anxiety-like behaviour in mice: a review. Behav Brain Res. 125, 141-149 (2001).
- Prut, L., Belzung, C. The open field as a paradigm to measure the effects of drugs on anxiety-like behaviors: a review. Eur J Pharmacol. 463, 3-33 (2003).
- Walsh, R. N., Cummings, R. A. The open-field test: A critical Review. Psychological Bulletin. 83, 482-504 (1976).
- Raben, N., Nagaraju, K., Lee, E., Plotz, P. Modulation of disease severity in mice with targeted disruption of the acid alpha-glucosidase gene. Neuromuscul Disord. 10, 283-291 (2000).
- Nagaraju, K., et al. Conditional up-regulation of MHC call I in skeletal muscle leads to self-sustaining autoimmune myositis and myositis-specific autoimmune myositis and myositis-specific autoantibodies. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (16), 9209-9214 (2000).
- Erb, M., et al. Omigapil ameliorates the pathology of muscle dystrophy caused by laminin-alpha2 deficiency. J Pharmacol Exp Ther. 331 (3), 787-795 (2009).
- Malerba, A., et al. Chronic systemic therapy with low-dose morpholino oligomers ameliorates the pathology and normalizes locomotor behavior inmdxmice. Mol Ther 1. 9 (2), 345-354 (2011).
- Grounds, M. D., Radley, H. G., Lynch, G. S., Nagaraju, K., De Luca, A. Towards developing standard operating procedures for pre-clinical testing in the mdx mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Neurobiol Dis. 31 (1), 1-19 (2008).
- Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies. Neuromuscul Disord. 22 (1), 34-42 (2012).
- Rayavarapu, S., Van de meulen, J. H., Gordish-Dressman, H., Hoffman, E. P., Nagaraju, K., Knoblack, S. M. Characterization of Dysferlin Deficient SJL/J Mice to Assess Preclinical Drug Efficacy: Fasudil Exacerbates Muscle Disease Phenotype. PLoSOne. 5 (9), e12981 (2010).
- Valle, F. P. Effects of strain, sex, and illumination on open-field behavior of rats. Am J Psychol. 83, 103-111 (1970).
- Ramos, A., et al. Evaluation of Lewis and SHR rat strains as a genetic model for the study of anxiety and pain. Behav Brain Res. 129, 113-123 (2002).
- Bowman, R. E., Maclusky, N. J., Diaz, S. E., Zrull, M. C., Luine, V. N. Aged rats: sex differences and responses to chronic stress. Brain Res. 1126, 156-166 (2006).
- Sakai, K., Crochet, S. Differentiation of presumed serotonergic dorsal raphe neurons in relation to behavior and wake-sleep states. Neuroscience. 104, 1141-1155 (2001).
