Gedrags-en bewegingsapparaat metingen met behulp van een open veld Activity Monitoring Systeem voor Skeletal Muscle Ziekten
Summary
Open veld activiteit niveaus worden gebruikt om de locomotief en gedragsmatige activiteit beoordelen. Dit protocol voorziet in een goed ontworpen, gestandaardiseerd protocol te gebruiken in preklinische studies voor neuromusculaire aandoeningen.
Abstract
Het open veld activity monitoring systeem uitvoerig beoordeelt bewegingsapparaat en gedragsmatige activiteit van muizen. Het is een nuttig instrument voor de beoordeling locomotief impairment in diermodellen van neuromusculaire ziekte en de werkzaamheid van therapeutische geneesmiddelen die de motoriek en / of spierfunctie kunnen verbeteren. Het open veld activiteit meting geeft een andere maatregel dan spierkracht, die gewoonlijk wordt beoordeeld door grijpkracht metingen. Het kan ook laten zien hoe geneesmiddelen kunnen invloed hebben op andere systemen van het lichaam en in combinatie met aanvullende uitkomstmaten. Bovendien, maatregelen zoals de totale afgelegde afstand spiegel van de 6 minuten looptest, een klinische trial uitkomstmaat. Echter open veld activiteitenmonitoring eveneens gepaard met significante uitdagingen: Open veldactiviteit metingen verschillen per dier stam, leeftijd, geslacht en circadiane ritme. Bovendien kunnen kamertemperatuur, vochtigheid, licht, geluid en zelfs geur beïnvloeden assessmentuitkomsten. Over het algemeen, deze manuscript biedt een goed geteste en gestandaardiseerde open veld activiteit SOP voor preklinische studies in diermodellen van neuromusculaire ziekten. Wij bieden een bespreking van belangrijke overwegingen, typische resultaten, data-analyse, en het detail van de sterktes en zwaktes van open veld testen. Daarnaast bieden we aanbevelingen voor een optimale onderzoeksopzet bij gebruik van open veld activiteit in een preklinische studie.
Introduction
Diermodellen zijn nuttig voor het leren over de ziekte mechanismen, maar hun nut bij het voorspellen van werkzaamheid van de behandeling in klinische studies is vaak uitgedaagd 1-3. Talrijke "veelbelovende" preklinische studies worden elk jaar gepubliceerd; echter zeer weinig van de voorgestelde ingrepen tonen positieve resultaten bij verplaatsing van de klinische proef. Deze verschillen worden vaak toegeschreven aan publicatiebias, optimistische conclusies en slecht ontworpen en uitgevoerd pre-klinische studies die leiden tot reproduceerbare resultaten 1-3.
Met de huidige vooruitgang in de ontwikkeling van geneesmiddelen voor neuromusculaire aandoeningen, is er een toenemende behoefte aan goed ontworpen preklinische studies. In het bijzonder is er behoefte aan rigoureuze methodologieën die in een gestandaardiseerde en blinde wijze kunnen worden uitgevoerd, gevalideerde, reproduceerbare en vertaalbare meetinstrumenten. Als lid van de Aangeboren Muscle Disease Consortium, metde wens om meer rigoureuze preklinische studies uit te voeren, delen we hier onze Standard Operating Procedure (SOP) voor Open Gebied activiteit. Deze SOP is eerder gevalideerde 4 en gepubliceerd als een onderdeel van TREAT-NMD's SOP's voor Duchenne spierdystrofie (DMD) diermodellen 5. We hebben deze methodologie voor fenotypering en testen van de therapeutische werkzaamheid van talrijke geneesmiddelen in verschillende diermodellen van neuromusculaire ziekten, waaronder LAMA2 dy-2J / J (Dy2J) muizen, het diermodel voor aangeboren spierdystrofie (CMD) 6,7 . Op zijn beurt wordt dit artikel is gebaseerd op onze eerder gepubliceerde TREAT-NMD SOP 5.
Het open veld activiteit controlesysteem volledig beoordeelt bewegingsactiviteit en gedragsmatige activiteit van muizen, die kunnen worden gecorreleerd met loc functie. De test wordt ook veel gebruikt om angst uit en verkennende gedrag 8-10 beoordelen. In het bijzonder, het open veld is een handig hulpmiddel voor kontessing locomotief impairment in diermodellen van neuromusculaire aandoening 11,12 en de werkzaamheid van therapeutische geneesmiddelen die de motoriek en / of motorische functie 6,7,13,14 kunnen verbeteren. Het open veld activiteit assessment biedt een andere maatregel dan spierkracht, die gewoonlijk wordt gemeten met de grijpkracht, en het laat zien hoe medicijnen kunnen invloed hebben op andere systemen van het lichaam (het centrale zenuwstelsel) en 5. Daarnaast is het open veld activiteit maatregel, totaal afgelegde afstand, een afspiegeling van de 6 minuten looptest, een klinische trial uitkomstmaat, die zich richt op submaximale inspanningsvermogen en kwaliteit van leven 15,16. Algemeen is dit maakt het open veld activiteit testen een gunstige secundaire of ondersteunende uitkomstmaat te gebruiken in preklinische studies. Echter, het open veld activity monitoring systeem heeft ook grote problemen die ermee verbonden zijn. De test is gedrags en kan heel variabel omdat het wordt beïnvloed door een veelheid van externefactoren. Bijvoorbeeld kan dit gedrag worden beïnvloed door experimentele omvormer (dwz cognitie), angst, ziekte, circadiane ritme, omgevingsfactoren, genetische achtergrond, naast motorvermogen 10. Hierdoor is het noodzakelijk om deze maatregel te verrichten in een gestandaardiseerde vorm met een gecontroleerde omgeving. De hier gepresenteerde protocol beschrijft onze open veld activiteit SOP in detail. Het biedt stap-voor-stap procedures en verdere bespreking van belangrijke overwegingen bij milieu-omstandigheden te beheersen en te verminderen variabiliteit, typische resultaten, data-analyse, en de sterke punten van de beoordeling en de zwakke punten in meer detail.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het open veld activiteitsmeting een in vivo analyse die nuttig zijn voor het beoordelen ziekteprogressie en geneesmiddelefficiëntie in diermodellen van neuromusculaire ziekte 6,7,11-14 zijn. Zoals getoond in figuur 2, het biedt een overzicht van activiteit die weerspiegelen loc functie. Dit is een andere maatregel dan spierkracht, waardoor het een ideale secundaire of ondersteunende uitkomstmaat te presteren in een preklinische studie drug. Bovendien is een klinisch relevant 15, invasieve handeling, die meerdere malen gedurende de duur van het onderzoek kan worden uitgevoerd. Echter, gedrags-en locomotief activiteit ook beïnvloed door andere factoren, alsmede (dwz experimentator handling, milieu-omstandigheden, en cognitie) het creëren van variatie in open veld activiteit gegevens. Het doel van deze paper is om een goed geteste en gestandaardiseerd protocol dat de variatie vermindert en maakt het mogelijk de resultaten te c zijn voorzienompared over meerdere laboratoria, in de hoop van het verbeteren van vertalingen binnen ons vakgebied.
Een belangrijk nadeel van deze maatregel is dat het zeer variabel en van talrijke externe factoren. Echter, hebben we hiermee rekening bij het ontwikkelen van het protocol. Wij hebben verschillende testprotocollen variërend in tijdsduur van 1-5 dagen van gegevensverzameling. Op het einde hebben we vastgesteld dat het uitvoeren van instrument adaptatie voor het verzamelen van gegevens om de dieren wennen aan de testkamer milieu en het uitvoeren van 4 dagen van het verzamelen van gegevens aanzienlijk verminderd de hoeveelheid variatie in de uitkomsten van gegevens 5. Dit protocol werd oorspronkelijk ontworpen om gedrags-en locomotief activiteit in het mdx muismodel te beoordelen; echter, werd dit protocol onlangs gevalideerd in de Dy2J diermodel en 6. Er wordt gesuggereerd dat het protocol worden gestandaardiseerd binnen uw laboratorium voor elk dier model voorafgaand aan het gebruik ervan in een preklinische studie.
Open veld activiteit varieert door genetische achtergrond 17, geslacht 18-20, leeftijd 18, en circadiane ritme 21. Dit vereist dieren van dezelfde leeftijd, geslacht en genetische achtergrond worden beoordeeld tegelijk. Tijdens de planningsfase, moet goed nadenken in het bepalen op welke leeftijd of leeftijden open veld activiteit zal worden beoordeeld worden. Elk dier model heeft zijn eigen specifieke progressie van de ziekte en de locomotief en gedragsmatige fenotype, die variëren in ernst en naar leeftijd 6,15 (figuur 2 en figuur 3). Daarom is het belangrijk klinisch en pathologisch relevante tijdstippen bepalen openen veldactiviteit maatregelen zijn. Het totale aantal dieren dat nodig is in elke behandelingsgroep om statistisch significante verschillen te detecteren varieert per dier model, leeftijd en geslacht ook. Daarom moet relevante steekproefgrootte ook worden uitgevoerd tijdens de planningsfase tot de toonhoogte vanine het totale aantal benodigde dieren in elke behandelingsgroep om statistisch significante verschillen te detecteren. Deze berekeningen moeten ook rekening houden met aanvullende uitkomstmaten gebruikt in de studie (bijvoorbeeld, grijpkracht metingen of histologische analyses). Op basis van onze macht berekeningen, gebruiken we meestal 10-12 dieren per behandelingsgroep. Daarnaast moet bijzondere aandacht worden besteed aan wat controle stam wordt gebruikt in het onderzoek. Er is een tendens voor ongepast controlestammen gebruik in preklinische studies. Zo worden BL6 muizen vaak als controlestam voor mdx muizen; De mdx muis op een BL10 achtergrond. Zoals gezien in figuur 3, BL10 muizen veel actiever dan BL6 muizen, die het onmogelijk mdx en BL6 gegevens te vergelijken. Bij het uitvoeren van preklinische studies met mdx muizen moet BL10 muizen worden gebruikt als controlestam. Bovendien, als een studie uitgevoerd met Dy2J muizen, BL6 muizen worden gebruikt als control stam.
Kleine veranderingen in het milieu kan ook significante invloed op de activiteit niveaus. Deze omvatten licht, temperatuur, vochtigheid, geur, geluid en menselijke activiteiten 4,15. Daarom is het erg belangrijk dat tests worden uitgevoerd in een op temperatuur en vochtigheid ruimte met niet-directe verlichting op hetzelfde tijdstip elke dag 5. De testkamers wordt gelijkmatig verdeeld over de ruimte en niet in direct licht of in de schaduw gesteld of donkere hoeken 5 geplaatst. De dieren worden willekeurig toegewezen aan hun testkamers elke dag naar de effecten van verschillende milieu-omstandigheden in de ruimte te verminderen, en ze moeten worden toegestaan om te acclimatiseren aan de testkamer voor 10-30 min voorafgaand aan het verzamelen van gegevens. Zorg ervoor dat u de doos toewijzing van elk dier te volgen tijdens de gehele duur van het onderzoek om ervoor te zorgen dat elke invloed van de doos / milieu gelijk wordt verdeeld over de verschillende behandelingsgroepen. De individuen het laden van de animals in de testkamers en het hanteren van de dieren tijdens de gehele duur van de studie moet worden blind voor de behandelde groep en dier stam waar mogelijk. In veel gevallen beïnvloed genotypes aanzienlijk verschillen van de bedieningselementen en verblindend is niet mogelijk. Toch moeten individuen altijd verblind tussen behandelde en onbehandelde groepen. Bovendien moeten alle personen de zaal te verlaten tijdens het verzamelen van gegevens om ruis en afleiding in de kamer te verminderen, en alle kamers moeten grondig worden gereinigd na elke zitting van het verzamelen van gegevens. Deze acties zullen variatie aanzienlijk verminderen in de gegevens. Het is belangrijk op te merken dat dieren zijn ook zeer gevoelig voor aanpassing 15. Daarom wordt voorgesteld dat de dieren worden verwijderd uit de testkamer direct na de 60 min van het verzamelen van gegevens elke dag en dat open veld activiteit niveaus worden niet meer dan een keer per maand beoordeeld.
De totale afgelegde afstand en de totale verhuizingment tijd metingen hebben de neiging om de meest gevoelige open veld activiteit metingen 5 zijn. In de Dy2J model, de verticale activiteitsmeting neigt de gevoeligste open veld te meten (figuur 3) zijn; nochtans, kan het moeilijk zijn om nauwkeurige verticale activiteitsmetingen maakt bij kleinere dieren. Zo is het mogelijk dat een kleinere veeteelt gedrag vertonen en de sensor niet vangen door de hoogte van de verticale sensor. Als gevolg hiervan, raden we testen dieren niet eerder dan 5 weken oud. Het is ook mogelijk dat een dier slaapt gedurende de duur van een gegevensverzameling sessie. Als dit het geval is, is het aangewezen om een extra dag van het verzamelen van gegevens toe te voegen. Tenslotte kan een slechte uitlijning van de kwadrantdeler of blokkade van sensoren binnen het vak resulteren in onjuiste gegevens ook. Daarom is het erg belangrijk om een sensor CONTROLE VOORAF na afloop van voeren voorafgaand aan het testen en beoordelen alle gegevenselke dataverzameling sessie.
Voorzichtigheid dient te worden gehouden bij de analyse van het open veld activiteit gegevens. Open veld activiteit gegevens heeft de neiging om niet-normaal verdeeld en hebben uitschieters 4. Voorafgaand aan het uitvoeren van een statistische analyses, onze biostatistici raden het controleren van de gegevens voor normaliteit en uitschieters. Als data niet normaal verdeeld zijn, moet men overwegen gebruik te maken van een niet-parametrische testen bij het vergelijken van middelen. Bovendien moeten alle gegevens worden geanalyseerd door een persoon blind dan de behandelingsgroepen zijn.
Over het algemeen, het open veld activiteit maatregel heeft grote voordelen: a) het is een uitgebreide beoordeling van zowel de motorische en gedragsmatige activiteit, die sterk is, maar niet altijd gecorreleerd met locomotief functie; b) het is een makkelijke maatregel uit te voeren; c) het vereist geen behandeling van dieren tijdens het testen; d) het een invasieve maatregel die meer dan eens kan worden uitgevoerd tijdens de duur van een study; e) geen speciale training nodig is om de test uit te voeren; f) meerdere dieren worden getest in een keer; en g), het is een klinisch relevante uitkomstmaat 5,16. Echter, bij het testen van geneesmiddelen, in gedachten houden dat ook andere factoren die het gedrag van een dier kan van invloed zijn, en op zijn beurt open veld activiteit metingen. Drugs kunnen CNS en of andere lichaamsdelen breed effecten en probleem kan ook worden beïnvloed door een stressvolle omgeving. Hierdoor kan het moeilijk zijn om te onderscheiden of veranderingen in locomotieven of gedragsproblemen activiteit gerelateerd aan veranderingen in spierfunctie, spierkracht, of een gevolg van bijwerkingen van het geneesmiddel. Daarom dient extra functionele, histologische en moleculaire assays of ook worden uitgevoerd. Deze gestandaardiseerde protocol is ook met succes toegepast in andere spierziekten 4,17; Zoals gezien in figuur 3, proefstudies worden eerst uitgevoerd om de gevoeligheid van de maatregel te beoordelen in het diermodel.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze publicatie wordt gefinancierd door Cure CMD, Frans spierdistrofie Association (AFM), een translationeel onderzoek subsidie van de spierdystrofie Association, de National Institutes of Health (1K26RR032082, 1P50AR060836-01, 1U54HD071601, 2R24HD050846-06), het Ministerie van Defensie ( W81XWH-11-1-0330, W81XWH-11-1-0782, W81XWH-10-1-0659, W81XWH-11-1-0809, W81XWH-09-1-0599) en een pilot subsidie van Parent Project spierdistrofie ( PPMD).
Dit document is een van de vele in een reeks van SOP's voor routinematig gebruikt methodieken op het gebied aangeboren spierziekte. Het weerspiegelt de inspanningen besproken en vastgesteld bij meer dan 20 deskundigen op het gebied van aangeboren spierziekte bij de recente Aangeboren Muscle Disease Consortium Workshop, gehouden in april 2013 in Washington, DC
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Equipment | |||
| VersaMax Open Field Activity Monitoring system with acrylic test chambers, and X, Y, Z axis sensors | AccuScan Instruments, Inc. Columbus Ohio, USA | Retired | |
| Fusion Open Field Activity Monitoring system with acrylic test chambers, and X, Y, Z axis sensors | Omnitech Electronics, Inc. Columbus Ohio, USA | Suggested system currently on the market | |
| Computer | Dell, Inc. | ||
| Materials | |||
| Virkon-S Broad spectrum disinfectant (Potassium Peroxymonosulfate/ Sodium Chloride) | Pharmacal Research Laboratories, Inc. | ||
| Mice | |||
| B6.WK-Lama2dy-2J/J (Dy2J) | Jackson Lab | 000524 | |
| C57BL/6J (BL6) | Jackson Lab | 000664 | |
| SJL/J (SJL) | Jackson Lab | 000686 | |
| C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J (mdx) | Jackson Lab | 001801 | |
| C57BL/10ScSnJ (BL10) | Jackson Lab | 000476 |
References
- Worp, H. B., Howells, D. W., Sena, E. S., Porritt, M. J., Rewell, S., O'Collins, V., Macleod, M. R. Can Animal Models of Disease Reliably Inform Human Studies?. PLoS Med. 7 (3), 1000245-10 (2010).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
- Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
- Spurney, C., et al. Preclinical drug trials in the mdx mouse: Assessment of reliable and sensitive outcome measures. Muscle Nerve. 39, 591-602 (2009).
- Nagaraju, K., Carlson, G., De Luca, A. Behavioral and locomotor measurements using open field animal activity monitoring system. TREAT-NMD SOP Number M2.1.002. 2, (2010).
- Yu, Q., et al. Omigapil treatment decreases fibrosis and improves respiratory rate in dy(2J) mouse model of congenital muscular dystrophy. PLoS One. 8 (6), e65468 (2013).
- Sali, A., et al. Glucocorticoid-treated mice are an inappropriate positive control for long-term preclinical studies in the mdx mouse. PLoS One. 7 (4), e34204 (2012).
- Belzung, C., Griebel, G. Measuring normal and pathological anxiety-like behaviour in mice: a review. Behav Brain Res. 125, 141-149 (2001).
- Prut, L., Belzung, C. The open field as a paradigm to measure the effects of drugs on anxiety-like behaviors: a review. Eur J Pharmacol. 463, 3-33 (2003).
- Walsh, R. N., Cummings, R. A. The open-field test: A critical Review. Psychological Bulletin. 83, 482-504 (1976).
- Raben, N., Nagaraju, K., Lee, E., Plotz, P. Modulation of disease severity in mice with targeted disruption of the acid alpha-glucosidase gene. Neuromuscul Disord. 10, 283-291 (2000).
- Nagaraju, K., et al. Conditional up-regulation of MHC call I in skeletal muscle leads to self-sustaining autoimmune myositis and myositis-specific autoimmune myositis and myositis-specific autoantibodies. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (16), 9209-9214 (2000).
- Erb, M., et al. Omigapil ameliorates the pathology of muscle dystrophy caused by laminin-alpha2 deficiency. J Pharmacol Exp Ther. 331 (3), 787-795 (2009).
- Malerba, A., et al. Chronic systemic therapy with low-dose morpholino oligomers ameliorates the pathology and normalizes locomotor behavior inmdxmice. Mol Ther 1. 9 (2), 345-354 (2011).
- Grounds, M. D., Radley, H. G., Lynch, G. S., Nagaraju, K., De Luca, A. Towards developing standard operating procedures for pre-clinical testing in the mdx mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Neurobiol Dis. 31 (1), 1-19 (2008).
- Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies. Neuromuscul Disord. 22 (1), 34-42 (2012).
- Rayavarapu, S., Van de meulen, J. H., Gordish-Dressman, H., Hoffman, E. P., Nagaraju, K., Knoblack, S. M. Characterization of Dysferlin Deficient SJL/J Mice to Assess Preclinical Drug Efficacy: Fasudil Exacerbates Muscle Disease Phenotype. PLoSOne. 5 (9), e12981 (2010).
- Valle, F. P. Effects of strain, sex, and illumination on open-field behavior of rats. Am J Psychol. 83, 103-111 (1970).
- Ramos, A., et al. Evaluation of Lewis and SHR rat strains as a genetic model for the study of anxiety and pain. Behav Brain Res. 129, 113-123 (2002).
- Bowman, R. E., Maclusky, N. J., Diaz, S. E., Zrull, M. C., Luine, V. N. Aged rats: sex differences and responses to chronic stress. Brain Res. 1126, 156-166 (2006).
- Sakai, K., Crochet, S. Differentiation of presumed serotonergic dorsal raphe neurons in relation to behavior and wake-sleep states. Neuroscience. 104, 1141-1155 (2001).
