İlköğretim Bağırsak organoid Kültür Retrovirütik Enfeksiyon Bir Video Protokolü

Aşağıdaki protokole kullanılan farelerin belirli bir patojenden bağımsız koşullarda tutuldu ve tüm işlemler Birleşik Krallık Ofis düzenlemelerine uygun olarak yapıldı. 1. Hazırlık Kullanılmadan önce 1 saat süreyle ortam hazırlama en az 10 dakika kullanılmadan önce 37 ° C su banyosu içinde ön ısıtma işlemi (Tablo 1 ve Malzeme Listesi daha fazla bilgi için bkz.) 2. Kültürleme Küçük Bağırsak (SI) Organoids NOT: Aksi belirtilmedikçe, tüm inkübasyonlar nemli bir inkübatör içinde 37 ° C'de,% 5 CO2 ile gerçekleştirilir. Canlı hücreler ile temas eden aletler ve tepkime maddeleri steril olması gerekmektedir. Ön ısınma o bodrum matris (Matrıgel veya BME) Yayımlarken dışarı yayılmasını engeller damla gibi doku kültürü plaka önemlidir. Ayrıca, taban matris her zaman buz üzerinde tutulmalıdır. -20 ° C ve çözülme Mağazasıkullanımdan önce buz üzerinde. Kriptler Yalıtımlı Ince bağırsak izolasyonu için daha sonra, ulusal kurallar ve düzenlemelere göre fare kurban sırtında hayvan koyun ve% 70 etanol ile karın yıkayın. Sternum kasıktan bir uzunlamasına orta hat kesi gerçekleştirin. İlk olarak, deri ve deri altı doku daha sonra kesilir. Mideye çekumdan ince bağırsağı çıkarın. Duodenum, jejunum ve ileumdan izole kript organoid kültürü için de kullanılabilir. Kalsiyum ya da magnezyum (PBS0) olmaksızın önceden soğutulmuş fosfat tamponlu serum fizyolojik ile, izole edilen ince bağırsağı yıkayın. 3-5 cm uzunluğunda parçalar halinde doku kesmek ve uzunlamasına açık kesmek için makas kullanın. Forseps kullanarak doku yayıldı. Lamel kullanarak villus kazımak. Dikkat, çok fazla kuvvet gözyaşı doku neden olur ve aşağıdaki adımları izleyerek kriptalarının verimini azaltacaktır. Önceden soğutulmuş bir PBS0 usin içeren 50 ml'lik bir tüpe transfer dokug forseps. Kuvvetli çalkalama ile doku parçaları yıkayıp PBS0 değiştirin. 2-3 x tekrarlayın veya PBS0 az bulutlu dönene kadar. Bir tüp silindiri üzerindeki 4 ° C'de 30 dakika boyunca 1 mM etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) ile PBS0 30 ml içeren 50 ml'lik bir tüp içinde doku inkübe edin. Kuvvetlice çalkalanır tüp ve 5 mM EDTA ile PBS0 30 ml ihtiva eden bir 50 ml tüp doku aktarın. (Daha önce doku ihtiva etmektedir), 1 mM EDTA çözeltisi ve kript villi bir karışımını içerecektir. Genellikle villi yüksek bir oranda içerir, Bu fraksiyon organoids bir tohumlama için uygun değildir. Bir tüp silindiri üzerindeki 4 ° C'de 1 saat boyunca doku daha inkübe edin. Kuvvetlice tüp sarsıntı ve temiz bir 50 ml tüp içinde çözeltisinin toplanması. Kript varlığını doğrulamak ve ışık mikroskopisi ile 50 ul crypts sayarak, örneğin sayısını tahmin ediyoruz. 50-100 kriptaları almak ve 1.5 ml t aktarmak için gerekli hacmi hesaplayınube. 5 dakika boyunca 300 xg'de Spin. , Supernatant Önceden ısıtılmış, 24 oyuklu bir plaka içerisinde temel matrisin 50 ul pelet ve tohum yeniden süspanse edin. Matris taban polimerize kadar 5-15 dakika boyunca bir doku kültür inkübatörü içinde inkübe edin. 500 ul ENR ortamı ile Yerleşimi (bakınız Tablo 1). Küçük, yuvarlak bir şekil gösterir kistik organoids tohumlama sonra filizlenen ve yapıları 2-3 gün sonra yaklaşık 24 saat görünür hale gelir. Her 3 günde bir, taze ENR medya değiştirin. Geçiş 7 günde kültürler organoid. Pasajlanması ve bakımı Organoids Her 3 gün ve geçiş 1 medyayı tazeleyerek organoids koruyun: lümen ölü hücreler, yaklaşık her 7 gün ile dolu olur 5: 3 veya 1. 1 ml pipetman ucu kullanarak ortamı ile bodrum matris kubbeyi kırmak ve 1.5 ml tüp kuyudan aktarın. Mekanik pipetleme ile a organoids ayırmakpproximately 50x cezası (örneğin, 200 ul) ucu kullanarak. 5 dakika boyunca 300 xg'de Spin. Süpernatantı atın ve bodrum matris 150-250 ul pelletini. Bir tohum 24-kaynaklı plaka (/ oyuk taban matris 50 ul) önceden ısıtılmış. Kaplamak için bir kez bodrum matris yukarı ve aşağı ucunun duvar pipet ekim önce. Pipet yavaşça yayılmasını önlemek için matris temel kuyunun orta kabarcıkları ve tohum önlemek için. Bu iyi merkezinde taban kalıbının bir kubbe almak için arzu edilir. Matris taban polimerize kadar 5-15 dakika boyunca bir doku kültür inkübatörü içinde inkübe edin. Kuyu başına 500 ul ENR medya ile Yerleşimi. 3. Ön enfeksiyon SI Organoids Tedavisi NOT: Şekil 1, iletim prosedürü görüntülemektedir. ENRWntNic Exchange, ENR ortamı (Tablo 1 e bakınız) ve t organoids büyür3 gün veya bir kistik morfoloji kabul kadar en az onun orta. Nikotinamid (Nic) kültür etkinliğini iyileştirir Wnt3a kök ve Paneth hücrelerinin sayısını artırır. 4. Virüs Üretimi Platin-E hücreleri bir 150 mm tabak başına enfeksiyona gereklidir. Tohum yaklaşık puromycin (1 ug / ml) ve blasticidin (10 ug / ml) varlığında, 15-18 ml'lik ortam (DMEM +% 10 FBS) ile 5 x 10 6 hücre. Bunlar% 70-80 ulaştığı zaman, 2-3 gün sonra hücrelerin transfekte. Puromisin olmayan ve de transfeksiyon önce blastisidin, DEM +% 10 FBS ile orta değiştirin. Opti-MEM 1 ml içeren tüpler ayırmak için polietilenimin (PEI) retroviral DNA yapısının, 30 ug ve 240 ul ilave edin. Karıştırın ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Iki çözeltinin havuzu ve 20-30 dakika için oda sıcaklığında inkübe edin. Platin-E hücrelerinin ortamına tam karışımı ilave edilip dikkatle plat sallamake DNA PEI komplekslerinin eşit dağılımını sağlamak için. Gece boyunca transfeksiyon karışımı ile platin-E hücreleri inkübe ve ortam ertesi gün yenileyin. 2 gün boyunca, yeni bir ortam içinde hücrelerin tutun. , 50 ml'lik bir Falcon tüpüne sadece orta toplamak 12-16 saat boyunca 4 ° C'de 8000 x g'de, bir 0.45 um filtre ve santrifüj geçirin. Süpernatantı atın ve İletimi orta 250 ul pelet (bakınız Tablo 1). 5. organoid Fragman hazırlanması Bir enfeksiyonu için bir 24 oyuklu plaka bir de gereklidir. 1 ml pipetman ucu kullanarak ortamı ile bodrum matris kubbeyi kırmak ve 1.5 ml tüp aktarın. Ince bir ses ipucu (örneğin, 200 ul ipuçları) pipetle (30-50x) aracılığıyla organoids mekanik bozmaya kullanın. Çözelti bulanık hale ve herhangi bir tam organoids görünür olmalıdır. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında santrifüje, 900 x g . Süpernatantı atın ve hücre kültürü dereceli rekombinant proteaz (örneğin, TrypLE) 500 ul pelletini. 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilir. İnkübasyondan sonra fragmanının başına hücre sayısının sayılması, ışık mikroskopisi kullanılarak organoid fragmanlarının boyutunu kontrol edin. 5-10 hücreleri içeren fragmanlar idealdir. Parçalarının çoğunluğu hücrelerinin daha yüksek bir sayı içeriyorsa inkübasyon süresi, aynı anda 2 dakika süre ile arttırılabilir. ENR ortamının 500 ul ekleyerek ayrışma süreci sonlandırmak. Oda sıcaklığında santrifüj, 5 dakika boyunca 900 x g. Süpernatantı ve buz ya da 4 ° C pelet tutmak. 6. retroviral İletimi Bir 48-yuvalı plakanın bir çukuruna (bölüm 4.5 'dan itibaren) retroviral çözeltisi 250 ul organoid parçaları birleştirin. 1 ml pipetman ucu kullanarak yavaş pipetle hafifçe karıştırın. Parafilm plaka mühür. e "> 7. Spinoculation ve Kaplama 1 saat boyunca, 32 ° C, 600 x g'de santrifüje plaka. Parafilm dikkatlice çıkarın ve 6 saat boyunca bir doku kültür inkübatörü içinde inkübe edin. Enfekte organoid Fragments 8. Tohumculuk 5 dakika boyunca 900 xg'de 1.5 ml tüp, ve spin kuyudan enfekte organoid fragmanlarını ve iletim ortamı aktarın. Süpernatantı atın ve serin 5 dakika buz üzerinde pelet içeren tüp koymak. Bodrum matris 100 ul ekleyin ve yukarı ve aşağı yavaşça pipetleme pelletini. Yeni 24-oyuklu bir plaka içerisinde 50 uL 'karışımı cell temel matris "Tohum düşer. Matris taban katılaşıncaya kadar 5-15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Oyuklara polibren olmayan iletim ortamı ilave edin ve bir doku kültürü inkübatörü içinde inkübe edin. 2-3 gün medya değiştirin. 9. Seçim Başlangıç ​​seortama puromisin (1 ug / ml) ilave edilerek 2-3 gün sonra lection. Fragmanlar oluşturan organoids puromycin (1 mcg / ml) ile desteklenmiş, ENR medya ile İletimi ortamı değiştirmek için ne zaman başlıyor. 10. post-enfeksiyon SI Organoids Tedavisi Kültür göre, "Pasajlanması ve organoids muhafaza" protokolü (bölüm 2.2.1) organoids transdük. 1-2 hafta sonra SI organoids yeni kurdukları yapıları geri kazanacak. 1 uM'lik bir konsantrasyonda çalışma 4-OH (4-OHT) eklenerek miRNA ya da DNA ekspresyonunu tomurcuklanan yapıların görünüşünü ardından. Bu aşama Addgene (pMSCV-loxP-DsRed-loxP-EGFP-Puro-WPRE (32702), pMSCV-loxP-DsRed-loxP-3xHA-Puro-WPRE (32703) ve ikinci pMSCV, retroviral vektörler kullanılarak halinde geçerli olduğuna dikkat ediniz -Flip-puro-DsRed-GFP-miRNA (32704)) ve kre-ERT2 ifade organoids. Enfeksiyon ve Expr 11. Onayıİlgi geninin salgılamanın ardından / bastırılması Addgene (32702, 32703 ve 32704) için, retroviral vektörler kullanılarak Eğer iletim verimliliği DsRed ifade gözlemi ile teyid edilebilir. Koo ve arkadaşlarına 4 de örneklendiği gibi Buna ilaveten, ilgi konusu genin ifade veya bastırılması, GFP veya (gen demonte için) 3xHA (gen aşırı ifadesi için) epitopu ve QPCR kullanılarak, Western Blot ile teyit edilebilir.