פרוטוקול וידאו של זיהום retroviral ביסודי מעיים Organoid תרבות
Summary
פרוטוקול זה מסביר תרבות העיקרית Lgr5-positve organoid והביצועים הבאים של התמרה retroviral. זה מאפשר ביטוי יתר או מציאה Cre-מושרה של transgene נמסר ומאפשר מחקרים פונקציונליים להתבצע ברומן בorganotypic המבחנה מערכת מודל.
Abstract
יכולים להיות בתוספת תאי גזע Lgr5 החיובי עם הצמיחה חיונית גורמי EGF, Noggin, וR-Spondin, אשר מאפשר לנו התרבות המתרחבת מבני אפיתל 3D ראשוניים במבחנה. שני מאפייני הארכיטקטורה ופיזיולוגי של אלה "מיני אומץ", המכונה גם organoids, דומים מאוד למקביליהם בגוף חי. זה גורם להם מערכת מודל אטרקטיבית לאפיתל של המעי הדק. באמצעות התמרה retroviral, יכול כעת להתבצע גנטיקה תפקודית על ידי ביטוי יתר של גן מותנה או מציאה. וידאו זה מדגים את ההליך של תרבות organoid, הדור של רטרווירוסים, ותמרת retroviral של organoids לסייע בתהליכי ניתוח פנוטיפי של אפיתל במעי הקטן במבחנה. מערכת זו רומן מודל organotypic בשילוב עם ביטוי גנים בתיווך retroviral מספקת כלי רב ערך לניתוח מהיר של תפקוד גן במבחנה ללא הצורך של costlדור y ונדרש זמן רב לבעלי חיים מהונדסים.
Introduction
יש צורך בגנטיקה תפקודית תפוקה גבוהה כדי להגדיל את ההבנה הביולוגית שלנו בגוף, כדי לשפר את המדע בסיסי נוכחי ורפואה. גנטיקה עכבר כבר תקן הזהב לחקירת תפקוד גן in vivo, למרות שזה גם זמן רב ויקר. שורות תאים, להיות הבחירה הנפוצה אחרת, יש להם יכולת תפוקה גבוהה יותר בעת היותו פחות יקר. עם זאת, הם הקשו על ידי חוסר היכולת שלהם להתרבות microenvironment הנכון ובכך התגובות הפיזיולוגיות ראה in vivo. לפיכך, יש צורך חד משמעי למערכת מודל קל לידית, המאפשר עלות / תוך ניתוח תפוקה גבוהה בזמן יעיל מחקת את התגובות הפיזיולוגיות שנצפו בin vivo מהונדס ניסויי עכבר (TG).
לאפיתל endodermal מערכת מודל אחד כזה הופיעה ב2009 1. בין הידע שנצבר מהגילוי של תאי גזע במעי Lgr5-חיובימידע על הנישה המתאימה לגורמים הכרחיים לתחזוקת תאי גזע נוסף הסלולר המטריצה וצמיחה. ניצול מידע זה ניתן היה להקים "מיני אומץ" המכונה גם organoids 2. לאחרונה מינוח קונסנסוס למבחנת תרבויות ב, בי organoids מכונות 'enteroids', הוצע 3. כמו שורות תאים, organoids הם המתרחב וקל לטיפול עם הליגנדים ומעכבים. עם זאת, במקום להיות דו ממדים הם מבנים תלת ממדיים ארגון עצמי שישמרו ארגון קריפטה-סיסי, כמו גם תאי גזע ושושלות תאים מובחנים של המעי דק (SI). Organoids מורכב משכבה אחת של תאי האפיתל המקיפים את אזור luminal. מבני ניצנים בולטים מתאים למאורות מעיים קטנים המכילים את התא בתאי גזע. החל מקצה מבנה הניצנים ותאים להבחין כפי שהם miלגרר לכיוון בטנת אפיתל, שבו תאי סופני הבדיל מופרשים בלומן. בהשוואה לשורות תאים, מערכת זו vivo לשעבר משחזרת באופן הדוק יותר את הפיסיולוגיה הנורמלית ולכן מערכת מודל מבטיחה לאפיתל של המעי הדק.
בסרטון פרוטוקול זה של התמרה retroviral, אנו מציגים שיטה המאפשרת לשעבר מחקרי תפקוד גן vivo במערכת זו תרבות רומן organoid. אנחנו מתחילים בתיאור organoid התרבות באופן צעד אחר צעד, ולהמשיך על ידי הוכחת הדור של רטרווירוסים ואחרי הליך התמרה. לבסוף, יש קטע לקבלת ייעוץ נוסף לפתרון בעיות. יתרון של שיטה זו הוא שהיא יכולה להיות בשילוב עם הדמיה חיה או הקרנת סמים ללמוד הומאוסטזיס, החלטות גורל תא ואינטראקציות תאי תאים באפיתל המעי. בשל הארכיטקטורה הפשוטה שלהם ותחלופה מהירה, organoids לייצג של מודל אידיאליystem ללימוד ביולוגיה של תא גזע בוגרים. בנוסף התמרה retroviral יכולה להיות מיושמת על organoids שנלקח מעכברים מהונדסים שנקבע מראש, כמו גם דגימות מטופל אנושיות. לא ניתן להאריך גישות לדפוק ובעקומים החוצה לבני אדם, organoids האנושי SI מהווה חלופה אטרקטיבית.
לסיכום, מניפולציה גנטית דרך התמרה retroviral מאפשרת ניתוח פנוטיפי בorganoids מעיים הקטן שנלקח מעכברים או דגימות רקמה אנושיות, ובכך משלימים את הגנטיקה עכבר ושורות תאים בעת פתיחת אפיקים חדשים ללימודים ברקמות אנושיות נגזר. התמרה retroviral מאפשרת gain- והאובדן של פונקצית מחקרים שיבוצע במערכת תרבות organoid 4. זה עושה את זה משאב יקר ערך לחקירת תפקוד גן, ביולוגיה של תא גזע בוגר ומחלה בעת היותו בהתאם לשלושה Rs (הפחתה, עידון, והחלפה).
Protocol
Representative Results
Discussion
כדי להשיג היבטים מסוימים יעילות התמרה גבוהה הם קריטיים. אחת מהן הוא הטיפול המקדים של organoids עם תקשורת ENRWntNic עד שהם לאמץ צורת פיברוזיס עגולה. זה מגדיל את מספר תאי גזע ובכך את הסיכוי להשגת אינטגרציה יציבה של transgene, כמו גם להגדיל את שיעור ההישרדות של organoids SI לאורך כל הליך התמרה. פרמטר נוסף הוא זמן הדגירה הבא spinoculation. תוצאות דגירה קצרות מדי או ארוכות מדי ביעילות ירודה התמרה והישרדות נמוכה של organoids, בהתאמה. צעד spinoculation הוא לא חיוני למרות שזה מגדיל את אחוז organoids transduced באופן משמעותי. לבסוף, וירוס גבוה כייל הוא מפתח לתמרה מוצלחת. זה תלוי בסוג של שורת תאי אריזה ווירוס. השילוב של שורת תאי הפלטינה-E ווירוס בתאי גזע עכברי (MSCV), נמצא לייצר כייל גבוה מספיק עבור התמרה של organoids.
ve_content "> להלן טיפים לפתרון בעיות אשר עשוי לסייע להשגת התמרה מוצלחת. ראשית, אם transfection של שורת תאי אריזה הוא עני, לוודא כי confluency של התאים הוא בין 70-80% וכי זמן הדגירה של התערובת נקווה PEI-DNA היא בין 20-30 דקות. ההישרדות של organoids במהלך התמרה מאוד תלויה בגודל שבר. trypsinization הארוך מדי גורם לרוב שברים מורכב מפחות מ -3 תאים, ובכך מקטין את שרידות organoid. גורם נוסף הוא הפעילות של המדיום המותנה Wnt, אם הפעילות היא נמוכה מדי לחיזוקו באמצעות תוספת של CHIR99021 בריכוז עבודה של 5 מיקרומטר יכול להגדיל את ההישרדות. CHIR99021 מעכבת GSK3, וכתוצאה מכך גם סיגנלים של Wnt מוגברים. יתר על כן, Y-27362, המונע anoikis מתווסף לתקשורת התמרה כדי לשפר את שרידות organoid, מאז organoids הם שיבשו לברים (המכיל 1-10 תאים) לפני התמרה. כ60; שהוזכרו לעיל, זמן הדגירה לאחר spinoculation לא יעלה על 6 שעות. לבסוף, אם התמרה עניה הוא ציין הגורמים האמורים להשפיע על כייל הנגיף ואת מגבלת הגודל של להכניס לוקטור retroviral צריכים להיחשב. היעילות של מציאה תלויה מאוד במירנה. מאז היעילות משתנה עם השילוב של גן המטרה ומירנה זה שווה ביצוע מסך יעילות לזהות את אלה שעובדים הכי טובים.הטכניקה מוגבלת לתופעות האפיתל של מערכת organoid. בעתיד אפשר יהיה ללמוד במחלות זיהומיות או בתיווך חיסוני באמצעות שיתוף התרבות של מחוללי מחלה או הכינון מחדש עם רכיבים שמקורם במערכת החיסון, בהתאמה. יתר על כן, רטרווירוסים יכולים לשאת רק מוסיף של גודל קטן יחסית. כתוצאה מכך, אזורי רגולציה מתרחשים באופן טבעי יש לי כדי להיות שליליים ולכן הביטוי של transgene לא יכול לחקות את זה שלגן אנדוגני. כפי שצוין לעיל, את יעילות מציאה תלויה בגן המטרה ומירנה. אם לא ניתן למצוא מירנה עם יעילות מציאה מתאימה, הוא יכול להגביל את השימוש בטכניקה לגן מטרה מסוים.
באופן תיאורטי, organoids תואם את כל הטכניקות מניפולטיביות הסטנדרטיות המשמשות לשורות תאים. התמרה retroviral הייתה השיטה הראשונה שדיווחה על 4, ולאחרונה BAC -transgenesis (כרומוזום בקטריאלי המלאכותי) הפך זמין 5. עם זמן דור כולל של 2-3 שבועות, לאחר transfection של פלסמיד הנגיפי אל תוך תא קו אריזה, הוא מהיר יותר באופן משמעותי מהדור של מהונדס עכבר (TG). על ידי שמירה על ארכיטקטורת קריפטה-סיסי in vivo בעוד המכיל תאי גזע, כמו גם את כל שושלות התאים מובחנות של האפיתל במעיים, מערכת תרבות organoid מגשרת על הפער בין בעלי החיים TG ותרבית תאים ששימשו בעבר.
<pclass = "jove_content"> הפרוטוקול המתואר כאן מספק שיטה לביצוע ניתוח פנוטיפי של האפיתל endodermal במבחנה באמצעות gain- וצוברים הפסדים של מחקרים לתפקד. זה עושה את זה אפשרי כדי לענות על שאלות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית בביולוגיה של תא גזע בוגר, עם צורך מינימאלי של עכברי TG. לדוגמא, את הדור של עכברי נוקאאוט מותנים יכול להימנע על ידי השימוש בorganoids נגזר ממוטציות שזה עתה נולדו עם הקטלניות סביב הלידה 6. בנוסף, הטכניקה יכולה להיות מיושמת על organoids שנלקח מעכברי נוקאאוט הוקמו בעבר כדי ללמוד את התפקיד של paralogues על ידי ביצוע 7,8 מציאה נוסף.לאחר הקמת organoids המעי הדק, עיבוד של פרוטוקול התרבות המקורי אפשר culturing האפיתלים לבלב, כבד, מעי גס והקיבה 9-11. יתר על כן, organoids מעיים האנושי וorganoids גידול כבר נגזרו מביופסיות אנושיות נורמליות, עדן הראשוניסבתא וסרטן מעי גס ביופסיות 10. פרוטוקול זיהום ויראלי ניתן להרחיב בקלות לסוגים אלה של organoids ומספק דרך חסרת תקדים של ביצוע מחקרים תפקודיים ברקמות אנושיות נגזר.
יחדיו, התמרה retroviral של organoids המעי הדק היא משאב יקר ערך לחקירת תחזוקת תאי גזע, בידול, והחלטת גורל תא, כמו גם יחסי גומלין איתות תא ותא תאי ד'.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Koo BK וMustata RC נתמך על ידי סר הנרי דייל המלגה מקרן Wellcome ואנדרסון-רולף נתמך על ידי המועצה למחקר הרפואי (MRC). פינק J נתמך על ידי הדוקטור-התכנית של 4 שנות Wellcome Trust.
Materials
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-034 | |
| Glutamax 100x | Invitrogen | 35050-068 | |
| Hepes 1M | Invitrogen | 15630-056 | |
| Penicillin- Streptomycin 100x | Invitrogen | 15140-122 | |
| B27 supplement 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| N2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
| n-Acetylcysteine 500 mM | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| mouse EGF 500 µg/ml | Invitrogen Biosource | PMG8043 | |
| mouse Noggin 100 µg/ml | Peprotech | 250-38 | |
| R-Spondin conditioned medium | The conditioned media is generated from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013 | ||
| Wnt conditioned medium | The conditioned media is generated from L cells, for details see Sato and Clevers 2013 | ||
| Nicotinamide 1 M | Sigma | N0636 | |
| Y-27632 10 µM | Sigma | Y0503-1MG | |
| Polybrene 8 µg/ml) | Sigma | H9268-5G | |
| Standard BD Matrigel matrix | BD Biosciences | 356231 | Basement Matrix Extract (Cultrex PathClear BME Reduced Growth Factor Type 2, 3533-005-02 ) supplied by AMSBIO can be used as an alterntive. |
| 24 well plate | Greiner Bio One | 662960 | |
| 48 well plate | Greiner Bio One | 677980 | |
| CHIR99021 | Sigma | A3734-1MG | |
| Platinum- E cells | Cell biolabs | RV-102 | |
| Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
| Blasticidin | Invitrogen | A1113902 | |
| Polyethyleneimine (PEI) | Polysciences | 23966 | |
| opti-MEM | Life Technologies | 51985-034 | |
| TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
| Parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
| 4-OHT | Sigma | H7904 |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340, 1190-1194 (2013).
- Stelzner, M., et al. A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 302, G1359-G1363 (2012).
- Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature. 9, 81-83 (2012).
- Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids. PloS one. 8, e76871 (2013).
- Mustata, R. C., et al. Lgr4 is required for Paneth cell differentiation and maintenance of intestinal stem cells ex vivo. EMBO reports. 12, 558-564 (2011).
- Lau, W., et al. Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling. Nature. 476, 293-297 (2011).
- Koo, B. K., et al. Tumour suppressor RNF43 is a stem-cell E3 ligase that induces endocytosis of Wnt receptors. Nature. 488, 665-669 (2012).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. The EMBO journal. 32, 2708-2721 (2013).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494, 247-250 (2013).
