Видео Протокол ретровирусной инфекции в начальной кишечника Органоид культуры

Все мыши, используемые в следующим протоколом содержались в конкретного патогена условиях, и все процедуры были выполнены в соответствии с правилами внутренних дел Великобритании. 1 Подготовка Подготовьте СМИ 1 час до начала использования (см таблицу 1 и перечень материалов для более подробной информации) и предварительно тепло в водяной бане при 37 °, по крайней мере 10 мин перед использованием. 2 Культивирование тонкой кишки (SI) органоиды Примечание: Если не указано иное, все инкубации проводили при 37 ° С, 5% СО 2 в увлажненном инкубаторе. Оборудование и реагенты, вступая в контакт с живыми клетками, должны быть стерильными. Предварительно нагревая планшета для культуры ткани является важной, поскольку она предотвращает подвал матрица (Матригель или BME) капли от разводя при посеве. Кроме того, подвал матрица должна быть на льду во все времена. Хранить при -20 ° С и оттепелина льду перед использованием. Изоляция гробницы Для выделения тонкой кишке пожертвовать мыши в соответствии с национальными правилами и положениями, а затем поместите животное на спину и мыть живота с 70% этанола. Выполните продольный срединный разрез от паха до грудины. Во-первых, порезать кожу, а затем подкожной ткани. Удалить тонкую кишку от слепой кишки в желудок. Crypts, выделенные из двенадцатиперстной кишки, тощей кишки и подвздошной кишки может быть использован для Органоид культуры. Вымойте изолированных тонкую кишку с предварительным охлаждением фосфатно-солевой буфер без кальция или магния (PBS0). Разрежьте ткань в 3-5 см длинные куски и использовать ножницы, чтобы вырезать его открытым в продольном направлении. Распределите ткани с помощью щипцов. Соскребите ворсинки, используя покровное. Осторожно, слишком много сил приведет к ткани, чтобы оторвать и снизить выход крипт в следующих шагов. Передача ткани в 50 мл пробирку, содержащую предварительно охлаждается PBS0 Usinг щипцы. Вымойте фрагментов ткани через энергичного встряхивания и изменить PBS0. Повторите 2-3 раза, или до тех пор, PBS0 не получается менее пасмурная погода. Инкубируйте ткани в 50 мл пробирку, содержащую 30 мл PBS0 с 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в течение 30 мин при 4 ° С на трубки валика. Энергично встряхните трубку и перенесите ткани в другую 50 мл пробирку, содержащую 30 мл PBS0 5 мМ ЭДТА. 1 мМ раствора ЭДТА (ранее, содержащий ткань) будет содержать смесь крипт и ворсинок. Эту фракцию не подходит для посева органоидам как это часто содержит высокий процент ворсинок. Инкубируйте ткани дополнительно в течение 1 часа при 4 ° С на трубки валика. Энергично встряхните пробирку и собрать решение в чистую пробирку 50 мл. Подтвердите наличие крипт и оценить количество, например, путем подсчета склепы в 50 мкл с помощью световой микроскопии. Рассчитать объем необходимого для получения 50-100 склепы и перенести его на 1,5 мл тУбе. Отжим при 300 мкг в течение 5 мин. Жидкость над осадком сливают, осадок ресуспендируют в 50 мкл базальной матрицы, а семена в предварительно нагретой пластине 24-луночного. Инкубируйте в культуре ткани инкубаторе в течение 5-15 мин, так подвал матрица полимеризуется. Наложение с 500 мкл ENR среды (таблица 1). Примерно 24 ч после посева органоиды покажет маленький круглый кистозный форму и еще через 2-3 дней начинающим структуры становятся видимыми. Изменение в свежей среде ENR каждые 3 дня. Прохождение Органоид культур каждые 7 дней. Пассирование и поддержание органоидов Поддерживать органоиды, обновив СМИ каждые 3 дня и прохождение 1: 3 или 1: 5 в просвет заполняется мертвых клеток, примерно каждые 7 дней. Перерыв матрицу купол подвал со средой, используя 1 мл Pipetman наконечник и перенести его из колодца на 1,5 мл трубки. Механически диссоциируют органоиды через пипеткойpproximately 50x с помощью штраф (например, 200 мкл) наконечника. Отжим при 300 мкг в течение 5 мин. Удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 150-250 мкл подвальном матрицы. Семя в предварительно нагревают 24-луночного планшета (50 мкл подвальном матрицы / а). Перед посевом пипетки подвал матрица вверх и вниз один раз, чтобы покрыть стенки наконечника. Пипетка медленно, чтобы избежать пузырьков и семена в середине скважины, чтобы предотвратить базальную матрицу из разводя. Желательно, чтобы получить купол базальной матрицы в центре скважины. Выдержите в культуре ткани инкубаторе в течение 5-15 мин, так подвал матрица полимеризуется. Наложение с 500 мкл ENR СМИ на лунку. 3 Pre-инфекция Лечение С.И. органоидов Примечание: Рисунок 1 иллюстрирует процедуру трансдукции. Обмен ENR в ENRWntNic (таблица 1) среду и выращивать органоиды в тего средний в течение как минимум 3 дней или до тех пор, приняли кистозный морфологию. Wnt3a увеличивает количество стволовых клеток, и Paneth а Никотинамид (NIC) повышает эффективность культуры. 4 Вирус Производство Один 150 мм блюдо Платина-E клеток необходимо на инфекции. Семя примерно 5 × 10 6 клеток с 15-18 мл среды (DMEM + 10% FBS) в присутствии пуромицина (1 мкг / мл) и бластицидин (10 мкг / мл). Трансфекции клеток после 2-3 дней, когда они достигли 70-80% слияния. Изменение среды к DMEM + 10% FBS без пуромицином и бластицидин до трансфекции. Добавить 30 мкг ретровирусной конструкцией ДНК, и 240 мкл полиэтиленимина (PEI), чтобы отдельные пробирки, содержащие 1 мл OPTI-MEM. Смешать, инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин. Бассейн двух растворов и инкубируют при комнатной температуре в течение 20-30 мин. Добавить полную смесь в среде Платина-E клеток и тщательно встряхнуть Platэ обеспечить равномерное распределение комплексов ДНК-PEI. Инкубируйте клетки Платина-E с трансфекции смеси в течение ночи и обновить среды на следующий день. Хранить клеток в новой среде в течение 2 дней. Собирают только среды в 50 мл сокола трубки, передать его через фильтр и центрифуги 0,45 мкм при 8000 х г при 4 ° С в течение 12-16 часов. Удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 250 мкл Transduction среды (таблица 1). 5 Органоид Фрагмент Подготовка Для одного инфекцией одна скважина из 24-луночного планшета не требуется. Перерыв матрицу купол подвал со средой, используя 1 мл Pipetman наконечник и перенести его на 1,5 мл трубки. Используйте кончик громкости тоньше (например, 200 советы мкл), чтобы механически разрушить органоиды через пипетки (30-50x). Решение станет облачно и не целые органоиды не должны быть видны. Центрифуга при комнатной температуре, 900 мкг в течение 5 мин . Удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 500 мкл класса культуре клеток рекомбинантного протеазы (например, TrypLE). Инкубируют при 37 ° С в течение 5 мин. После инкубации проверить размер Органоид фрагментов с использованием световой микроскопии, подсчета количества клеток на фрагменте. Фрагменты, содержащие 5-10 клеток идеальны. Если большинство фрагментов содержат большее количество клеток, время инкубации может быть увеличена на 2 мин за один раз. Завершить процесс диссоциации путем добавления 500 мкл ENR среды. Центрифуга при комнатной температуре, 900 мкг в течение 5 мин. Удалить супернатант и осадок держать на льду или 4 ° С. 6 Ретровирусная Трансдукция Объединение Органоид фрагменты с 250 мкл раствора ретровирусной (из раздела 4.5) в одну лунку 48-луночного планшета. Осторожно перемешать медленно пипетки с использованием 1 мл Pipetman наконечника. Печать тарелку с парафильмом. е "> 7. Spinoculation и покрытия Центрифуга пластину при 32 ° С, 600 мкг, в течение 1 часа. Осторожно снимите парафильмом и инкубировать пластины в культуре ткани инкубаторе в течение 6 часов. 8 посев зараженных Органоид Фрагменты Перенесите зараженные Органоид фрагменты и трансдукции СМИ от скважины до 1,5 мл пробирку, и спина при 900 мкг в течение 5 мин. Удалите супернатант и поставить пробирки, содержащей осадок на льду в течение 5 мин, чтобы охладить. Добавить 100 мкл подвальном матрицы и ресуспендируют осадок с помощью пипетки медленно вверх и вниз. Семенной капли "подвальной матрицы -клетка смешивать '50 мкл в новом 24-луночного планшета. Инкубируйте планшет при 37 ° С в течение 5-15 мин, пока подвал матричных затвердевает. Добавить трансдукции СМИ без полибрена в лунки и инкубировать пластину в инкубаторе для тканевых культур. Изменение СМИ каждые 2-3 дня. 9 Выбор Начните себелекция после 2-3 дней, добавляя пуромицина (1 мкг / мл) в средствах массовой информации. Когда фрагменты начинают образовывать органоиды заменить трансдукции носитель с ENR среде с пуромицин (1 мкг / мл). 10. после заражения Лечение СИ органоидов Культура трансдуцировали органоиды в соответствии с "пассажей и поддержание органоиды" протокола (раздел 2.2.1). Через 1-2 недель органоиды SI вернет себе свои зарождающиеся структуры. После появления подающих надежды структур индуцируют экспрессию микроРНК или кДНК путем добавления 4-гидрокситамоксифен (4-OHT) в рабочей концентрации 1 мкМ. Обратите внимание, что этот шаг является действительным только при использовании ретровирусных векторов из Addgene (pMSCV-LoxP-DsRed-LoxP-EGFP-Puro-WPRE (32702), pMSCV-LoxP-DsRed-LoxP-3xHA-Пуро-WPRE (32703), и pMSCV -flip-Puro-DsRed-GFP-микроРНК (32704)) и органоиды, выражающие CRE-ERT2. 11. подтверждения инфекции и Expression / Подавление интересующего гена При использовании ретровирусных векторов из Addgene (32702, 32703 и 32704) эффективность трансдукции может быть подтверждена путем наблюдения выражения DsRed. Кроме того, выражение или подавление интересующего гена может быть подтверждена с помощью Вестерн-блоттинга, с использованием GFP или 3xHA эпитоп (для сверхэкспрессии гена) и КПЦР (для нокдауна генов), как проиллюстрировано в Ку и соавт 4.