بروتوكول الفيديو من عدوى فيروسات الرجعية في الابتدائية المعوية عضي الثقافة
Summary
هذا البروتوكول يفسر-Lgr5 POSITVE الثقافة عضي الأولية والأداء اللاحق للتنبيغ فيروسات. وهذا يتيح overexpression جنة المساواة العرقية، أو محرض ضربة قاضية من التحوير تسليمها ويسمح الدراسات الوظيفية التي يتعين الاضطلاع بها في الرواية في المختبر عضوي النمط نظام نموذجي.
Abstract
الخلايا الجذعية Lgr5 إيجابية يمكن أن تستكمل مع نمو أساسي العوامل صندوق تعديل العولمة الأوروبي، كوز صغير، وR-Spondin، والذي يسمح لنا أن ثقافة أي وقت مضى توسيع هياكل الظهارية 3D الأولية في المختبر. كل من الهندسة المعمارية والفسيولوجية خصائص هذه "الشجاعة-مصغرة"، كما دعا organoids، تشبه نظرائهم في الجسم الحي. وهذا يجعلها نظام نموذجا جذابا للظهارة الأمعاء الصغيرة. باستخدام تنبيغ فيروسات، وعلم الوراثة وظيفية ويمكن الآن أن يقوم بها overexpression الجين المشروط ضربة قاضية. يوضح هذا الفيديو الإجراء الثقافة عضي، وتوليد الفيروسات القهقرية، وتنبيغ فيروسات من organoids لمساعدة تحليل المظهري للظهارة المعوية صغيرة في المختبر. هذا النظام نموذج عضوي النمط رواية بالاشتراك مع فيروسات التعبير الجيني بوساطة يوفر أداة قيمة للتحليل السريع للوظيفة الجينات في المختبر دون الحاجة إلى costlجيل نعم وتستغرق وقتا طويلا للحيوانات المعدلة وراثيا.
Introduction
وهناك حاجة الإنتاجية العالية الوراثة وظيفية لزيادة التفاهم البيولوجي لدينا من الجسم، لتحسين العلوم الأساسية والطب الحالي. وكانت الوراثة الماوس معيار الذهب للتحقيق وظيفة الجينات في الجسم الحي، على الرغم من أنه يتطلب وقتا طويلا ومكلفا. خطوط الخلايا، ويجري اختيار المشتركة الأخرى، لديها قدرة إنتاجية أعلى بينما تكون أقل تكلفة. ومع ذلك، يتم عرقلة من قبل عدم قدرتهم على إنتاج المكروية المناسبة وبالتالي الاستجابات الفسيولوجية ينظر في الجسم الحي. وبالتالي، هناك حاجة لا لبس فيها لنظام نموذج سهل التعامل، والذي يسمح التكلفة / الوقت كفاءة إنتاجية عالية التحليل حين محاكاة الاستجابات الفسيولوجية في الجسم الحي لوحظ في التجارب المعدلة وراثيا (TG) الماوس.
لظهارة الأديم الباطن نظام واحد نموذج من هذا القبيل ظهر في عام 2009 1. بين المعرفة المكتسبة من اكتشاف الخلايا الجذعية المعوية Lgr5 إيجابية ومعلومات حول مكانة المقابلة لمصفوفة العوامل والنمو خارج الخلوية اللازمة لصيانة الخلايا الجذعية. استخدام هذه المعلومات أصبح من الممكن إنشاء "-الشجاعة الصغيرة" المعروف أيضا باسم organoids 2. مؤخرا تم اقتراح تسمية الإجماع عليها في المختبر الثقافات، حيث يشار إلى organoids باسم 'enteroids'، 3. مثل خطوط الخلايا، وorganoids تتوسع من نوعها وسهلة لعلاج بروابط مع ومثبطات. ومع ذلك، بدلا من أن تكون ثنائية الأبعاد هم هياكل ثلاثية الأبعاد التنظيم الذاتي التي تحتفظ المنظمة سرداب-زغابة وكذلك الخلايا الجذعية والأنساب خلية متمايزة من الأمعاء الدقيقة (SI). Organoids تتكون من طبقة واحدة من الخلايا الظهارية التي تحيط منطقة اللمعية. جاحظ الهياكل مهدها تتوافق مع الخبايا المعوية صغيرة تحتوي على مقصورة الخلايا الجذعية. بدءا من غيض من هيكل الناشئين الخلايا الاصلية تفرق لأنها ميلصر نحو بطانة الظهارية، حيث يتم تسليط خلايا متباينة عضال في التجويف. بالمقارنة مع خطوط الخلايا، وهذا النظام خارج الحي يلخص بشكل وثيق فسيولوجيا العادي وبالتالي فهو نظام نموذجي واعد للظهارة الأمعاء الصغيرة.
في هذا الفيديو من بروتوكول تنبيغ فيروسات، فإننا نقدم وسيلة تمكن فيفو السابقين دراسات وظائف الجينات في هذا النظام مشابه للعضو ثقافة الرواية. نبدأ بوصف عضي الثقافة بطريقة خطوة بخطوة، والاستمرار من خلال إظهار جيل من الفيروسات القهقرية تليها الإجراء ترنسدوكأيشن. وأخيرا، هناك قسم للمشورة إضافية لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. ميزة هذا الأسلوب هو أنه يمكن الجمع بين التصوير الحي أو فحص المخدرات لدراسة التوازن والقرارات مصير الخلية والتفاعلات خلية خلية في الظهارة المعوية. بسبب عمارتها البسيطة ومعدل دوران سريع، organoids تمثل نموذجا مثاليا قystem لدراسة بيولوجيا الخلايا الجذعية البالغة. وبالإضافة إلى ذلك يمكن تطبيق تنبيغ فيروسات لorganoids المستمدة من الفئران المعدلة وراثيا مقررة سلفا وكذلك عينات من المرضى الإنسان. مع اقتراب الضربة القاضية في واضعا التدريجي لا يمكن أن يمتد إلى البشر، وorganoids الإنسان SI يشكل بديلا جذابا.
وباختصار، من خلال التلاعب الجيني تنبيغ فيروسات يسمح تحليل المظهري في organoids الأمعاء الصغيرة المستمدة من الفئران أو عينات الأنسجة البشرية، وبالتالي استكمال الوراثة الماوس وخطوط الخلايا أثناء فتح آفاقا جديدة للدراسات في الأنسجة البشرية المستمدة. تنبيغ فيروسات يمكن gain- والدراسات الخسارة من وظيفة التي يتعين القيام بها في نظام الثقافة عضوي الشكل 4. هذا يجعله مصدرا قيما للتحقيق وظيفة الجين، الكبار بيولوجيا الخلايا الجذعية والمرض في حين يجري وفقا لثلاثة روبية (تخفيض، والصقل، واستبدال).
Protocol
Representative Results
Discussion
لتحقيق كفاءة عالية التنبيغ جوانب معينة حاسمة. واحد هو المعالجة المسبقة لorganoids ENRWntNic مع وسائل الإعلام إلى أن اعتماد شكل جولة الكيسي. وهذا يزيد من عدد الخلايا الجذعية، وبالتالي فرصة الحصول على التكامل مستقر من التحوير، وكذلك زيادة معدل بقاء organoids SI في جميع أنحاء الداخلي ترنسدوكأيشن. معلمة أخرى هي فترة حضانة التالية spinoculation. النتائج حضانة قصيرة جدا أو طويلة جدا في ضعف كفاءة ترنسدوكأيشن وبقاء الفقراء من organoids، على التوالي. الخطوة spinoculation ليست ضرورية على الرغم من أنها زيادة كبيرة في نسبة organoids transduced. أخيرا، فيروس عالية عيار هو المفتاح لالتنبيغ ناجحة. هذا يعتمد على نوع من التعبئة والتغليف خط الخلية والفيروسات. مزيج من البلاتين-E خط الخلية والفئران الفيروس الخلايا الجذعية (MSCV)، وجد لإنتاج عيار مرتفع بما يكفي لتنبيغ organoids.
ve_content "> وفيما يلي نصائح لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها التي قد تساعد على تحقيق التنبيغ ناجحة. أولا، إذا كان ترنسفكأيشن خط خلية التعبئة والتغليف والفقراء، تأكد من أن confluency من الخلايا ما بين 70-80٪ وأن فترة حضانة لل خليط مجمع PEI الحمض النووي بين 20-30 دقيقة. إن بقاء organoids خلال التنبيغ يعتمد إلى حد كبير على حجم قطعة. يسبب trypsinization طويل جدا معظم أجزاء تتألف من أقل من 3 خلايا وبالتالي يقلل البقاء مشابه للعضو. عامل آخر هو نشاط WNT المتوسطة مكيفة، إذا كان النشاط منخفضة جدا يعزز ذلك من خلال إضافة CHIR99021 في تركيز العمل من 5 ميكرومتر يمكن أن تزيد من البقاء على قيد الحياة. يمنع CHIR99021 GSK3، مما أدى إلى زيادة الإشارات WNT. وعلاوة على ذلك، Y-27362، والذي يمنع يضاف anoikis إلى وسائل الإعلام التنبيغ لتحسين البقاء على قيد الحياة عضوي الشكل، منذ تتعطل وorganoids إلى شظايا (1-10 تحتوي على خلايا) قبل ترنسدوكأيشن. و60، المذكورة أعلاه، ينبغي أن فترة حضانة بعد spinoculation لا تتجاوز 6 ساعة. وأخيرا، إذا لوحظ ضعف التنبيغ ينبغي النظر في العوامل المذكورة أعلاه التأثير على عيار الفيروسي والحد من حجم إدراج لناقلات فيروسات. كفاءة ضربة قاضية تعتمد بشكل كبير على ميرنا. منذ كفاءة يختلف مع مزيج من الجينات المستهدفة وميرنا يجدر أداء شاشة الكفاءة لتحديد تلك التي تعمل على أفضل وجه.وتقتصر هذه التقنية على الظواهر الظهارية للنظام مشابه للعضو. في المستقبل قد يكون من الممكن لدراسة الأمراض المعدية أو بوساطة جهاز المناعة من خلال ثقافة مشتركة من مسببات الأمراض أو إعادة مع مكونات مشتقة من الجهاز المناعي، على التوالي. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تحمل الفيروسات القهقرية فقط إدراج من حجم صغير نسبيا. بالتالي، لا بد من استبعاد المناطق التنظيمية التي تحدث بشكل طبيعي، وبالتالي التعبير عن التحوير لا يمكن أن تحاكي منالجين الذاتية. كما ذكر أعلاه، وكفاءة ضربة قاضية تعتمد على الجينات المستهدفة وميرنا. إذا لم يكن هناك ميرنا بكفاءة ضربة قاضية مناسبة يمكن العثور عليه قد تحد من استخدام هذه التقنية لهذا الجين المستهدف معين.
نظريا، organoids متوافقة مع جميع تقنيات التلاعب موحدة تستخدم في خطوط الخلايا. كان تنبيغ فيروسات الأسلوب الأول ورود أنباء عن 4، ومؤخرا أصبح BAC (كروموسوم اصطناعي البكتيرية) -transgenesis المتاحة 5. يبلغ مجموع الوقت جيل من 2-3 أسابيع، وبعد ترنسفكأيشن من البلازميد الفيروسي في خط خلية التعبئة والتغليف، وهو أسرع بكثير من جيل لالمعدلة وراثيا (TG) الماوس. من خلال الحفاظ على الجسم الحي في سرداب-زغابة العمارة في حين تحتوي الخلايا الجذعية وكذلك جميع الأنساب الخلايا المتمايزة للظهارة المعوية، ونظام الثقافة عضوي الشكل يسد الفجوة بين الحيوان TG وزراعة الخلايا المستخدمة سابقا.
<pالطبقة = "jove_content"> بروتوكول الموصوفة هنا يوفر طريقة لإجراء تحليل المظهري من الأديم الباطن ظهارة في المختبر من خلال gain- وloss- الدراسات ظيفة. وهذا يجعل من الممكن لمعالجة المسائل ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية في البالغين بيولوجيا الخلايا الجذعية، مع ضرورة الحد الأدنى من الفئران TG. على سبيل المثال، جيل من الفئران خروج المغلوب الشرطية يمكن تجنبها باستخدام organoids المستمدة من المسوخ حديثي الولادة مع الفتك فترة ما حول الولادة 6. بالإضافة إلى ذلك، هذه التقنية يمكن تطبيقها على organoids المستمدة من الفئران خروج المغلوب المحددة سابقا لدراسة دور paralogues عن طريق أداء 7،8 ضربة قاضية إضافية.بعد إنشاء organoids الأمعاء الصغيرة، والتكيف البروتوكول الثقافة الأصلي سمح لزراعة البنكرياس والكبد والقولون والمعدة ظهائر 9-11. وعلاوة على ذلك، تم اشتقاق organoids الأمعاء البشرية وorganoids الورم الخزعات الإنسان العادي، عدن الأساسيOMA وسرطان القولون والمستقيم الخزعات 10. يمكن تمديدها بسهولة بالغة بروتوكول عدوى فيروسية لهذه الأنواع من organoids ويوفر وسيلة غير مسبوقة من إجراء دراسات وظيفية في الأنسجة البشرية المستمدة.
أخذت معا، تنبيغ فيروسات من organoids الأمعاء الصغيرة مصدرا قيما للتحقيق في صيانة الخلايا الجذعية، والتمايز، وقرار مصير الخلية، وكذلك إشارات الخلية والخلية الخلوي التفاعلات.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
معتمدة كو BK وموستاتا RC من قبل هنري ديل زمالة السير من ويلكوم ترست وأندرسون، رولف ويدعمه مجلس البحوث الطبية (MRC). ويدعم فينك J من قبل ويلكوم ترست برنامج الدكتوراه لمدة 4 سنوات.
Materials
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-034 | |
| Glutamax 100x | Invitrogen | 35050-068 | |
| Hepes 1M | Invitrogen | 15630-056 | |
| Penicillin- Streptomycin 100x | Invitrogen | 15140-122 | |
| B27 supplement 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| N2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
| n-Acetylcysteine 500 mM | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| mouse EGF 500 µg/ml | Invitrogen Biosource | PMG8043 | |
| mouse Noggin 100 µg/ml | Peprotech | 250-38 | |
| R-Spondin conditioned medium | The conditioned media is generated from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013 | ||
| Wnt conditioned medium | The conditioned media is generated from L cells, for details see Sato and Clevers 2013 | ||
| Nicotinamide 1 M | Sigma | N0636 | |
| Y-27632 10 µM | Sigma | Y0503-1MG | |
| Polybrene 8 µg/ml) | Sigma | H9268-5G | |
| Standard BD Matrigel matrix | BD Biosciences | 356231 | Basement Matrix Extract (Cultrex PathClear BME Reduced Growth Factor Type 2, 3533-005-02 ) supplied by AMSBIO can be used as an alterntive. |
| 24 well plate | Greiner Bio One | 662960 | |
| 48 well plate | Greiner Bio One | 677980 | |
| CHIR99021 | Sigma | A3734-1MG | |
| Platinum- E cells | Cell biolabs | RV-102 | |
| Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
| Blasticidin | Invitrogen | A1113902 | |
| Polyethyleneimine (PEI) | Polysciences | 23966 | |
| opti-MEM | Life Technologies | 51985-034 | |
| TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
| Parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
| 4-OHT | Sigma | H7904 |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340, 1190-1194 (2013).
- Stelzner, M., et al. A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 302, G1359-G1363 (2012).
- Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature. 9, 81-83 (2012).
- Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids. PloS one. 8, e76871 (2013).
- Mustata, R. C., et al. Lgr4 is required for Paneth cell differentiation and maintenance of intestinal stem cells ex vivo. EMBO reports. 12, 558-564 (2011).
- Lau, W., et al. Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling. Nature. 476, 293-297 (2011).
- Koo, B. K., et al. Tumour suppressor RNF43 is a stem-cell E3 ligase that induces endocytosis of Wnt receptors. Nature. 488, 665-669 (2012).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. The EMBO journal. 32, 2708-2721 (2013).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494, 247-250 (2013).
