Een video Protocol van retrovirale infectie in het jeugdwerk Intestinale organoïde Cultuur
Summary
Dit protocol legt de primaire Lgr5-positve organoïde cultuur en de daaropvolgende prestaties van retrovirale transductie. Dit maakt Cre-induceerbare overexpressie of knock-down van de geleverde transgen en maakt de functionele studies die in de roman worden uitgevoerd in vitro organotypisch modelsysteem.
Abstract
Lgr5-positieve stamcellen kan worden aangevuld met de essentiële groeifactoren EFG Noggin, en R-Spondin, die ons in staat om de cultuur steeds groeiende primaire 3D-epitheliale structuren in vitro. Zowel de architectuur en de fysiologische eigenschappen van deze 'mini-guts', ook wel organoids, sterk lijken op hun in vivo tegenhangers. Dit maakt hen een aantrekkelijk model voor de kleine darm epitheel. Met behulp van retrovirale transductie, kan functionele genetica nu worden uitgevoerd door conditionele gen overexpressie of knock-down. Deze video toont de procedure van organoïde cultuur, het genereren van retrovirussen en de retrovirale transductie van organoids tot fenotypische analyse van de dunne darm epitheel in vitro ondersteunen. Deze nieuwe organotypische modelsysteem in combinatie met retrovirale gemedieerde genexpressie verschaft een waardevol instrument voor snelle analyse van genfunctie in vitro zonder van costly en tijdrovend generatie van transgene dieren.
Introduction
High-throughput functionele genetica is nodig om onze biologische kennis van het lichaam te verhogen, om de huidige fundamentele wetenschap en de geneeskunde te verbeteren. Muisgenetica is de gouden standaard voor het onderzoek van genfunctie in vivo, hoewel het zowel tijdrovend en kostbaar. Cellijnen, die andere zijn voorkomende keuze, een hogere doorvoercapaciteit terwijl goedkoper. Ze worden echter gehinderd door hun onvermogen om de juiste micro en daardoor de fysiologische responsen waargenomen in vivo reproduceren. Daarom is er een duidelijke behoefte aan een gemakkelijk te hanteren modelsysteem dat de kosten / tijd-efficiënte high throughput analyse terwijl toelaat nabootsen van de fysiologische responsen waargenomen in in vivo transgene (tg) muisexperimenten.
Voor de endodermal epitheel een dergelijk modelsysteem verscheen in 2009 1. Onder de opgedane kennis uit de ontdekking van Lgr5-positieve intestinale stamcellen werdinformaties niche overeenkomt met de extracellulaire matrix en groeifactoren nodig voor stamceltransplantatie onderhoud. Gebruik makend van deze informatie het mogelijk om 'mini-guts' ook wel bekend als organoids 2 vast geworden. Onlangs consensus nomenclatuur in vitro culturen waar organoids worden aangeduid als "enteroids ', werd gesuggereerd 3. Net als cellijnen, de organoids zijn steeds groeiende en gemakkelijk te behandelen met liganden en remmers. Echter, in plaats van tweedimensionale ze driedimensionale zelforganiserende structuren die de crypte-villus houdsorganisatie en stamcellen en gedifferentieerde cellijnen van de dunne darm (SI). Organoids bestaan uit een enkele laag van epitheelcellen die een luminale gebied omringen. Vooruitstekende ontluikende structuren komen overeen met de dunne darm crypten waarin de stamcel compartiment. Vanaf de top van de ontluikende structuur stamcellen differentiëren ze miRasp de richting van de epitheel, waar terminaal gedifferentieerde cellen worden afgeworpen in het lumen. Vergeleken met cellijnen Deze ex vivo systeem beter recapituleert de normale fysiologie en is daarom een veelbelovend modelsysteem voor de kleine darm epitheel.
In deze video protocol van retrovirale transductie, presenteren we een methode die ex vivo gen-functie studies stelt in deze roman organoïde kweeksysteem. We beginnen met een beschrijving organoïde cultuur in een stap voor stap manier en verder door het aantonen van de vorming van retrovirussen gevolgd door de transductie procedure. Ten slotte is er een sectie voor bijkomend advies voor het oplossen van problemen. Een voordeel van deze techniek is dat het kan worden gecombineerd met live imaging of drug screening homeostase, lot van de cel beslissingen en cel-cel interacties te bestuderen in het darmepitheel. Door hun eenvoudige architectuur en snelle omloopsnelheid, organoids vertegenwoordigen een ideaal model systeem voor het bestuderen van volwassen stamcellen biologie. Bovendien kunnen retrovirale transductie worden toegepast organoids afgeleid van vooraf vastgestelde transgene muizen en humane patiënt monsters. Zoals knock-in en knock-out benadering niet kan worden uitgebreid tot de mens, de menselijke SI organoids vormen een aantrekkelijk alternatief.
Samengevat, genetische manipulatie door retrovirale transductie laat fenotypische analyse in de dunne darm organoids afgeleid van muizen of menselijk weefsel monsters, waardoor aanvulling muis genetica en cellijnen tijdens het openen van nieuwe wegen voor onderzoek bij mensen afgeleide weefsels. Retrovirale transductie maakt gain en verlies-van-functie studies in het organoïde kweeksysteem 4 uit te voeren. Dit maakt het een waardevolle bron voor onderzoek van genfunctie, volwassen stamcellen biologie en ziekte terwijl volgens de drie V (vermindering, verfijning en vervanging).
Protocol
Representative Results
Discussion
Om tot een hoog transductierendement bepaalde aspecten kritisch. Een daarvan is de voorbehandeling van organoids met ENRWntNic media totdat ze een ronde cystische vorm aannemen. Dit verhoogt het aantal stamcellen en daarmee de kans op een stabiele integratie van het transgen, evenals het verhogen van de overlevingskans van de SI organoids gedurende de transductie procedure. Een andere parameter is de incubatietijd volgende spinoculation. Een te kort of te lang incubatie resulteert in een slechte transductie efficiëntie en slechte overleving van de organoids respectievelijk. De spinoculation stap is niet essentieel maar het verhoogt het percentage van getransduceerde organoids. Tenslotte hoge titer virus is essentieel voor een succesvolle transductie. Dit is afhankelijk van het soort verpakking cellijn en virus. De combinatie van platina-E cellijn van muis stamcellen virus (MSCV), bleek een titer hoog genoeg transductie van organoids produceren.
ve_content "> Hieronder zijn tips voor probleemoplossing die kunnen bijdragen tot succesvolle transductie te bereiken. eerste, als de transfectie van de verpakkingscellijn is slecht, ervoor zorgen dat de confluentie van de cellen tussen 70-80% en de incubatietijd van de gepoolde PEI-DNA mengsel 20-30 min. Het overleven van de organoids tijdens transductie sterk afhankelijk van de fragmentgrootte. Te lange trypsinisatie veroorzaakt de meeste fragmenten uit minder dan 3 cellen en daardoor vermindert organoïde overlevingskansen. Een andere factor is de activiteit van de Wnt geconditioneerde medium, indien de activiteit te laag gehalte opvoeren door toevoeging van CHIR99021 in een werkende concentratie van 5 uM kan de overlevingskans te vergroten. CHIR99021 remt GSK3, resulterend in verhoogde Wnt signalering. Bovendien Y-27362, die voorkomt anoikis wordt toegevoegd aan de transductie media organoïde overlevingskansen verbeteren doordat de organoids verstoord fragmenten (bevattende 1-10 cellen) voorafgaand aan transductie. Al60, hierboven vermeld, dient de incubatietijd na spinoculation niet meer dan 6 uur. Ten slotte, als slechte transductie wordt waargenomen de bovengenoemde factoren die de virale titer en de maximale grootte van het inzetstuk voor de retrovirale vector moet worden beschouwd. De efficiëntie van de knockdown is sterk afhankelijk van de miRNA. Aangezien de efficiëntie varieert met de combinatie van het doelgen en miRNA is het goed uitvoeren van een efficiency scherm die het best werken identificeren.De techniek is beperkt tot de epitheliale verschijnselen van het organoïde systeem. In de toekomst zal het mogelijk zijn om infectieuze of immuungemedieerde ziekten door co-kweek van pathogenen of reconstitutie studie met componenten afgeleid van het immuunsysteem, respectievelijk. Bovendien kunnen retrovirussen enkel dragen inserts van betrekkelijk geringe omvang. Bijgevolg nature voorkomende regulerende gebieden moeten worden uitgesloten en derhalve de expressie van het transgen kan nabootsen die vanhet endogene gen. Zoals hierboven vermeld, de knockdown efficiëntie afhankelijk van het doelgen en miRNA. Wanneer geen miRNA met geschikte knockdown efficiëntie vindt kan het gebruik van de techniek voor die doelwitgen beperken.
Theoretisch organoids zijn compatibel met alle gestandaardiseerde manipulatieve technieken die worden gebruikt voor de cellijnen. Retrovirale transductie was de eerste methode worden gemeld 4, en recent BAC (kunstmatig bacterieel chromosoom) -transgenesis is beschikbaar 5 geworden. Met een totale productie van 2-3 weken na transfectie van de virale plasmide in de verpakkingscellijn is aanzienlijk sneller dan het genereren van een transgene (tg) muizen. Door het handhaven van de in vivo crypte-villus architectuur tegelijkertijd de stamcellen en alle gedifferentieerde cellijnen van het darmepitheel, het organoïde kweeksysteem brug tussen tg dier en voorheen gebruikte celkweek.
<pclass = "jove_content"> De hier beschreven protocol voorziet in een methode om fenotypische analyse van endodermale epitheel presteren in vitro door gain en verlieslatende van functie studies. Dit maakt het mogelijk om fysiologisch relevante vragen bij volwassen stamcel biologie aan te pakken, met een minimale behoefte van tg muizen. Zo kan de vorming van conditionele knockout muizen te vermijden door organoids afgeleid van pasgeboren mutanten perinatale letaliteit 6. Bovendien kan de techniek worden toegepast organoids afgeleid van eerder vastgestelde knockout muizen om de rol van paralogen bestuderen door extra knockdown 7,8.Na de oprichting van de dunne darm organoids, heeft aanpassing van de oorspronkelijke cultuur protocol stond het kweken van de alvleesklier, lever, dikke darm en maag epitheel 9-11. Bovendien hebben de menselijke darm organoids en tumor organoids afgeleid van normale menselijke biopten, primaire Adenoma en colorectale kanker biopsieën 10. De virale infectie protocol kan gemakkelijk worden uitgebreid om dit soort organoids en biedt ongekende wijze het functioneel studies in mensen afgeleide weefsels.
Tezamen retrovirale transductie dunne darm organoids is een waardevolle bron voor onderzoek stamcellen onderhoud, differentiatie en Celgedrag, alsmede celsignalen en cel-cel interacties.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Koo BK en Mustata RC worden ondersteund door de Sir Henry Dale Fellowship van de Wellcome Trust en Andersson-Rolf A wordt ondersteund door de Medical Research Council (MRC). Fink J wordt ondersteund door de Wellcome Trust 4-jarige PhD-programma.
Materials
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-034 | |
| Glutamax 100x | Invitrogen | 35050-068 | |
| Hepes 1M | Invitrogen | 15630-056 | |
| Penicillin- Streptomycin 100x | Invitrogen | 15140-122 | |
| B27 supplement 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| N2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
| n-Acetylcysteine 500 mM | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| mouse EGF 500 µg/ml | Invitrogen Biosource | PMG8043 | |
| mouse Noggin 100 µg/ml | Peprotech | 250-38 | |
| R-Spondin conditioned medium | The conditioned media is generated from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013 | ||
| Wnt conditioned medium | The conditioned media is generated from L cells, for details see Sato and Clevers 2013 | ||
| Nicotinamide 1 M | Sigma | N0636 | |
| Y-27632 10 µM | Sigma | Y0503-1MG | |
| Polybrene 8 µg/ml) | Sigma | H9268-5G | |
| Standard BD Matrigel matrix | BD Biosciences | 356231 | Basement Matrix Extract (Cultrex PathClear BME Reduced Growth Factor Type 2, 3533-005-02 ) supplied by AMSBIO can be used as an alterntive. |
| 24 well plate | Greiner Bio One | 662960 | |
| 48 well plate | Greiner Bio One | 677980 | |
| CHIR99021 | Sigma | A3734-1MG | |
| Platinum- E cells | Cell biolabs | RV-102 | |
| Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
| Blasticidin | Invitrogen | A1113902 | |
| Polyethyleneimine (PEI) | Polysciences | 23966 | |
| opti-MEM | Life Technologies | 51985-034 | |
| TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
| Parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
| 4-OHT | Sigma | H7904 |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340, 1190-1194 (2013).
- Stelzner, M., et al. A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 302, G1359-G1363 (2012).
- Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature. 9, 81-83 (2012).
- Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids. PloS one. 8, e76871 (2013).
- Mustata, R. C., et al. Lgr4 is required for Paneth cell differentiation and maintenance of intestinal stem cells ex vivo. EMBO reports. 12, 558-564 (2011).
- Lau, W., et al. Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling. Nature. 476, 293-297 (2011).
- Koo, B. K., et al. Tumour suppressor RNF43 is a stem-cell E3 ligase that induces endocytosis of Wnt receptors. Nature. 488, 665-669 (2012).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. The EMBO journal. 32, 2708-2721 (2013).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494, 247-250 (2013).
