الثقافة الابتدائية من الخلايا العصبية الدوبامين ماوس
Summary
Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson’s disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.
Abstract
الخلايا العصبية الدوبامين تمثل أقل من 1٪ من إجمالي عدد الخلايا العصبية في الدماغ. هذه كمية قليلة من الخلايا العصبية في الدماغ وينظم وظائف مهمة مثل التحكم في المحركات، والدافع، والذاكرة العاملة. الخلايا العصبية الدوبامين السوداوي المخططي تتدهور بشكل انتقائي في مرض باركنسون (PD). ويرتبط هذا فقدان الخلايا العصبية التقدمية بشكل لا لبس فيه مع المحركات أعراض أمراض (بطء الحركة، ويستريح ورعاش، وصلابة العضلات). الوكيل الرئيسي المسؤول عن انحطاط الخلايا العصبية الدوبامين لا يزال مجهولا. ومع ذلك، يبدو أن هذه الخلايا العصبية عرضة للغاية في ظروف متنوعة. الثقافات الأولية تشكل واحدة من أكثر النماذج ذات الصلة للتحقيق خصائص وخصائص الخلايا العصبية الدوبامين. ويمكن تقديم هذه الثقافات إلى مختلف العوامل الإجهاد التي تحاكي PD علم الأمراض والمركبات اعصاب من أجل وقف أو إبطاء تدهور الخلايا العصبية. العديد من نماذج الماوس المعدلة وراثيا من PD التي كانت GENERated خلال العقد الماضي زادت مصلحة الباحثين عن الثقافات الخلايا العصبية الدوبامين. هنا، يركز بروتوكول الفيديو على تشريح دقيق من أدمغة فئران جنينية. الاستئصال الدقيق للبطني الدماغ المتوسط أمر بالغ الأهمية للحصول على الثقافات العصبية غنية بما فيه الكفاية في خلايا الدوبامين للسماح دراسات لاحقة. يمكن تحقيق هذا البروتوكول مع الفئران المعدلة وراثيا الجنينية ومناسبة لتلطيخ المناعي، PCR الكمي، الثاني الكمي رسول، أو الخلايا العصبية تقييم الموت / بقاء.
Introduction
الدوبامين، واحدة من الناقلات العصبية في الدماغ الأساسية 1،2، يتم تحريرها أساسا من الدماغ المتوسط الدوبامين (DA) الخلايا العصبية. غالبية الخلايا العصبية DA يقيمون في الجزء البطني من الدماغ المتوسط 2-6. تخطيطي، DA الخلايا العصبية الدماغ المتوسط ويمكن تقسيم في ثلاثة تشريحيا ووظيفيا أنظمة متميزة الإسقاط: mesostriatal، mesolimbic، ومسارات mesocortical 2،5. ويشارك المسار السوداوي المخططي في السلوك الحركي، ومسارات mesolimbic تلعب دورا هاما في تعزيز، والدافع، والتعلم، في حين أن مسارات الدوبامين إسقاط لقشرة الفص الجبهي وتورط في الإدراك 2.
وتشارك الخلايا العصبية DA في العديد من الاضطرابات العصبية البشرية مثل الفصام ونقص الانتباه واضطراب فرط النشاط، ومرض باركنسون (PD) 2،4. يتميز PD من قبل انحطاط تدريجي وانتقائي من الخلايا العصبية DA ربط المادة السوداءبارس المكتنزة (SNC) إلى المخطط. فقدان الخلايا العصبية DA النتائج nigro الجسم المخطط في نضوب الدوبامين شديد في المخطط هي المسؤولة من الأعراض الحركية من PD (بطء الحركة، ويستريح ورعاش، وصلابة) 7. لم تثبت السبب الأولي للPD مجهول السبب والعلاجات الحالية هم أعراض فقط، وتهدف إلى استعادة مستوى الدوبامين في الجسم المخطط. الدواء الأكثر المقررة هي L-دوبا (يفودوبا)، من المكونات الطبيعية للدوبامين. وإن إدارة يفودوبا يعوض عن فقدان الدوبامين لفترة معينة، تحدث مضاعفات المحرك بعد العلاج على المدى الطويل (خلل الحركة وعلى / قبالة المتحدة) 8،9.
الأبحاث على الخلايا العصبية الدوبامين وPD هو في تطور مستمر وتبذل جهود مكثفة لتطوير العلاجات على أساس زرع الخلايا، والعلاج الجيني، أو وكلاء اعصاب 10،11. ومع ذلك، تبقى قضية رئيسية غير توضيح: ما هو سبب vulnerab المدقعility من الخلايا العصبية DA؟ جزء من الجواب يمكن العثور عليها في نشاط الخلايا العصبية DA. ويبدو أن الانخفاض في النشاط الكهربائي واستثارة الخلايا العصبية DA لزيادة ميلها لتتحول 12. ومع ذلك، فإن تعقيد PD المرضية يتطلب المزيد من الدراسات لتحديد الآليات التي تشارك في الخلايا العصبية DA انحطاط 13-15.
الثقافات الأولية هي ذات الصلة وخاصة لدراسة خصائص الخلايا العصبية DA 16-19 وتحدي هذه الخلايا العصبية لمختلف الضغوط لتقييم وكلاء اعصاب 20-24. وغالبا ما تستخدم نماذج الثقافة الفئران، حيث أن تشريح الجنين الفئران الدماغ المتوسط هو أسهل، مقارنة مع الماوس، ويمكن الحصول على كميات أكبر من الخلايا العصبية في الفئران. ومع ذلك، وتوليد نماذج الماوس المعدلة وراثيا للمرض 25 قد ازداد بشكل ملحوظ في مصلحة المجتمع الأعصاب للثقافات الأولية من الماوس 26-29. على الرغم من الثقافات والعلاقات العامةepared من الحيوانات حديثة الولادة يمكن استخدامها، فمن الأفضل لإعدادهم من أجنة في مرحلة ما بعد الإنقسامية (E13.5 للعصبونات الدماغ المتوسط)، عندما الاحتفاظ الخلايا العصبية قدرتها على تمييز. يقدم البروتوكول التالية الخلايا العصبية الدماغ المتوسط المعزولة في الثقافة الأولية من أجنة الفئران (E13.5)، والتي هي الأكثر صعوبة للاستعداد. خصوصا، ونحن نقدم بروتوكول باستخدام المصل خالية مستنبت لاستنساخ أفضل. الخطوات الأكثر أهمية اثنين في إعداد ثقافة (تشريح والتفكك الميكانيكي) سيتم تفصيله بعناية في الفيديو المرتبطة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعرض هذا البروتوكول الإجراءات والكواشف اللازمة لإعداد ثقافة الأولية من الخلايا العصبية الدماغ المتوسط من الفأر الجنينية وإجراءات المناعي للكشف عن الخلايا العصبية الدوبامين. الخطوات الحاسمة من الإجراء هي تشريح الأجنة والتفكك الميكانيكي للشظايا الدماغ التي تم ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supported by grants from CNRS and INSERM. PM acknowledges support from the Fondation pour la Recherche Médicale en France (Equipe FRM 2009). SC acknowledges support from the Fondation de France.
Materials
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| DMEM 4.5g/L Glucose with L-Glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X), Phenol Red | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
| L-glutamine, 200 mM Solution | Life Technologies | 25030123 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma-Aldrich | D0547 | Powder |
| Laminin – 1 mg/mL in Tris buffered NaCl | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Poly-L-Ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Insulin from porcine pancreas | Sigma-Aldrich | I5523 | |
| apo-Transferrin human | Sigma-Aldrich | T1147 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | Stock solution 1M in water |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Stock solution 2% (w/v) in water |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Paraformaldehyde 16% in water | Electron Microscopy Sciences | RT 15710-S | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Merck Millipore | 106329 | |
| D(+)-Glucose, Monohydrate | Merck Millipore | 4074-2 | |
| Hydrochloric acid – c(HCl) = 1 mol/l (1 N) Titripur | Merck Millipore | 109057 | |
| Sterile water – Aqua B. Braun | Braun | ||
| Ethanol absolute NORMAPUR analytical reagent | VWR | 20821.321 | |
| Sterile Petri Dishes | VWR | 82050-566 | |
| Pasteur pipettes plain glass – Wilhem Ulbrich GdbR. | VWR | 612-2297 | |
| Counting chamber Malassez | VWR | 631-0975 | |
| Serum Acrodisc Syringe Filter with Supor Membrane, Sterile, GF/0.2 µm, 37 mm | PALL Life science | 4525 | |
| Surgical Scissors – Straight, sharp-sharp, 14.5 cm long | Fine Science Tools | 14002-14 | To open the abdominal wall |
| Scissors – Straight, pointed, delicate, 10 cm long | MORIA | 4877A | To open the uterine wall |
| Forceps – Curved, usual, serrated jaws 1 mm | MORIA | 2183 | To manipulate embryos |
| Vannas Scissors – Curved, pointed, 7 mm blades | MORIA | MC50 | To take out the mesencephalon |
| Ultra Fine Forceps – Curved, delicate, 13 cm long | MORIA | 9987 | To remove meninges |
| BD BioCoat Poly-D-Lysine 24-well Multiwell Plates | BD Bioscience | 356414 | |
| BD Falcon 12-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid | BD Bioscience | 353043 | |
| SuperFrost Microscope Slides, Ground edges 90º | MENZEL-GLÄSER | AG00008032E | |
| Precision cover glasses thickness No. 1.5H circular 18 mm Ø | MARIENFELD | 117580 | |
| Polyclonal Rabbit Anti-Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) Antibody | Chemicon Millipore | AB5622 | 1/200 |
| Monoclonal Mouse Anti-Glutamate Decarboxylase (GAD67) Antibody, clone 1G10.2 | Chemicon Millipore | MAB5406 | 1/400 |
| Monoclonal Rat Anti-Dopamine Transporter (DAT) Antibody, clone DAT-Nt | Chemicon Millipore | MAB369 | 1/500 |
| Monoclonal Mouse Anti-5-HT Antibody | 1/8,000 – Generous gift from Yves Charnay (Swizerland, Yves.Charnay@hcuge.ch) | ||
| Goat Serum, New Zealand Origin | Life Technologies | 16210-064 | |
| Alexa Fluor 405 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-31556 | 1/200 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11001 | 1/1000 |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11007 | 1/1000 |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss microscopy | Stemi-2000C | |
| Bunsen Burner FIREBOY | VWR | 451-0136 |
References
- Glowinski, J., Cheramy, A., Romo, R., Barbeito, L. Presynaptic regulation of dopaminergic transmission in the striatum. Cell Mol Neurobiol. 8, 7-17 (1988).
- Iversen, S. D., Iversen, L. L. Dopamine: 50 years in perspective. Trends Neurosci. 30, 188-193 (2007).
- Dahlstroem, A., Fuxe, K. Evidence for the Existence of Monoamine-Containing Neurons in the Central Nervous System I. Demonstration of Monoamines in the Cell Bodies of Brain Stem Neurons. Acta Physiol Scand Suppl. SUPPL. , 231-255 (1964).
- Chinta, S. J., Andersen, J. K. Dopaminergic neurons. Int J Biochem Cell Biol. 37, 942-946 (2005).
- Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
- Hegarty, S. V., Sullivan, A. M., O’Keeffe, G. W. Midbrain dopaminergic neurons: a review of the molecular circuitry that regulates their development. Dev Biol. 379, 123-138 (2013).
- Samii, A., Nutt, J. G., Ransom, B. R. Parkinson’s disease. Lancet. 363, 1783-1793 (2004).
- Santini, E., Heiman, M., Greengard, P., Valjent, E., Fisone, G. Inhibition of mTOR signaling in Parkinson’s disease prevents L-DOPA-induced dyskinesia. Sci Signal. 2, (2009).
- Ohlin, K. E., et al. Vascular endothelial growth factor is upregulated by L-dopa in the parkinsonian brain: implications for the development of dyskinesia. Brain. 134, 2339-2357 (2011).
- Obeso, J. A., et al. Missing pieces in the Parkinson’s disease puzzle. Nat Med. 16, 653-661 (2010).
- Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson’s disease. Sci Transl Med. 4, (2012).
- Michel, P. P., Toulorge, D., Guerreiro, S., Hirsch, E. C. Specific needs of dopamine neurons for stimulation in order to survive: implication for Parkinson disease. FASEB J. 27, 3414-3423 (2013).
- Decressac, M., Volakakis, N., Bjorklund, A., Perlmann, T. NURR1 in Parkinson disease-from pathogenesis to therapeutic potential. Nat Rev Neurol. , (2013).
- Jouve, L., Salin, P., Melon, C., Le Goff, L. K. e. r. k. e. r. i. a. n. -. Deep brain stimulation of the center median-parafascicular complex of the thalamus has efficient anti-parkinsonian action associated with widespread cellular responses in the basal ganglia network in a rat model of Parkinson’s disease. J Neurosci. 30, 9919-9928 (2010).
- Hirsch, E. C., Jenner, P., Przedborski, S. Pathogenesis of Parkinson’s disease. Mov Disord. 28, 24-30 (2013).
- di Porzio, U., Daguet, M. C., Glowinski, J., Prochiantz, A. Effect of striatal cells on in vitro maturation of mesencephalic dopaminergic neurones grown in serum-free conditions. Nature. 288, 370-373 (1980).
- Denis-Donini, S., Glowinski, J., Prochiantz, A. Glial heterogeneity may define the three-dimensional shape of mouse mesencephalic dopaminergic neurones. Nature. 307, 641-643 (1984).
- Barbin, G., Mallat, M., Prochiantz, A. In vitro studies on the maturation of mesencephalic dopaminergic neurons. Dev Neurosci. 7, 296-307 (1985).
- Marey-Semper, I., Gelman, M., Levi-Strauss, M. A selective toxicity toward cultured mesencephalic dopaminergic neurons is induced by the synergistic effects of energetic metabolism impairment and NMDA receptor activation. J Neurosci. 15, 5912-5918 (1995).
- Salthun-Lassalle, B., Hirsch, E. C., Wolfart, J., Ruberg, M., Michel, P. P. Rescue of mesencephalic dopaminergic neurons in culture by low-level stimulation of voltage-gated sodium channels. J Neurosci. 24, 5922-5930 (2004).
- Toulorge, D., et al. Neuroprotection of midbrain dopamine neurons by nicotine is gated by cytoplasmic Ca2. FASEB J. 25, 2563-2573 (2011).
- Rousseau, E., Michel, P. P., Hirsch, E. C. The Iron-Binding Protein Lactoferrin Protects Vulnerable Dopamine Neurons from Degeneration by Preserving Mitochondrial Calcium Homeostasis. Mol Pharmacol. 84, (2013).
- Orme, R. P., Bhangal, M. S., Fricker, R. A. Calcitriol imparts neuroprotection in vitro to midbrain dopaminergic neurons by upregulating GDNF expression. PLoS One. 8 (e62040), (2013).
- Choi, W. S., Kruse, S. E., Palmiter, R. D., Xia, Z. Mitochondrial complex I inhibition is not required for dopaminergic neuron death induced by rotenone, MPP+, or paraquat. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15136-15141 (2008).
- Trancikova, A., Ramonet, D., Moore, D. J. Genetic mouse models of neurodegenerative diseases. Prog Mol Biol Transl Sci. 100, 419-482 (2011).
- Gao, H. M., Liu, B., Zhang, W., Hong, J. S. Critical role of microglial NADPH oxidase-derived free radicals in the in vitro MPTP model of Parkinson’s disease. FASEB J. 17, 1954-1956 (2003).
- Lin, X., et al. Conditional expression of Parkinson’s disease-related mutant alpha-synuclein in the midbrain dopaminergic neurons causes progressive neurodegeneration and degradation of transcription factor nuclear receptor related 1. J Neurosci. 32, 9248-9264 (2012).
- Bye, C. R., Thompson, L. H., Parish, C. L. Birth dating of midbrain dopamine neurons identifies A9 enriched tissue for transplantation into parkinsonian mice. Exp Neurol. 236, 58-68 (2012).
- Ramonet, D., et al. Dopaminergic neuronal loss, reduced neurite complexity and autophagic abnormalities in transgenic mice expressing G2019S mutant LRRK2. PLoS One. 6 (e18568), (2011).
- Prestoz, L., Jaber, M., Gaillard, A. Dopaminergic axon guidance: which makes what. Front Cell Neurosci. 6, (2012).
- Nunes, I., Tovmasian, L. T., Silva, R. M., Burke, R. E., Goff, S. P. Pitx3 is required for development of substantia nigra dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4245-4250 (1073).
- Ferri, A. L., et al. Foxa1 and Foxa2 regulate multiple phases of midbrain dopaminergic neuron development in a dosage-dependent manner. Development. 134, 2761-2769 (2007).
- Rayport, S., et al. Identified postnatal mesolimbic dopamine neurons in culture: morphology and electrophysiology. J Neurosci. 12, 4264-4280 (1992).
- Kim, K. M., Nakajima, S., Nakajima, Y. Dopamine and GABA receptors in cultured substantia nigra neurons: correlation of electrophysiology and immunocytochemistry. Neuroscience. 78, 759-769 (1997).
- Nefzger, C. M., et al. Lmx1a allows context-specific isolation of progenitors of GABAergic or dopaminergic neurons during neural differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells. 30, 1349-1361 (2012).
- Su, H., et al. Immediate expression of Cdh2 is essential for efficient neural differentiation of mouse induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 10, 338-348 (2013).
