Первичная культура Mouse дофаминергических нейронов
Summary
Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson’s disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.
Abstract
Дофаминергических нейронов составляют менее 1% от общего количества нейронов в головном мозге. Это низкое количество нейронов регулирует важные функции мозга, такие как управление двигателем, мотивации и рабочей памяти. Нигростриатальных нейроны допаминергические выборочно вырождаются при болезни Паркинсона (PD). Эта прогрессивная потеря нейронов однозначно связаны с моторами симптомов патологии (брадикинезию, отдыхая тремор, и мышечная ригидность). Основной агент отвечает дофаминергической дегенерации нейронов до сих пор неизвестно. Тем не менее, эти нейроны, как представляется, чрезвычайно уязвимы в различных условиях. Первичные культуры представляют собой один из наиболее важных моделей для исследования свойств и характеристик дофаминергических нейронов. Эти культуры могут быть представлены в различных стрессовых агентов, которые имитируют PD патологии и нейропротекторами для того, чтобы остановить или замедлить дегенерации нейронов. Многочисленные трансгенные мышиные модели из PD, которые были Generованные в течение последнего десятилетия еще больше увеличило интерес исследователей для дофаминергических нейронов культур. Вот, протокол видео фокусируется на важных рассечения эмбриональных мозга мышей. Точное удаление вентральной среднего мозга имеет решающее значение для получения культур нейронов достаточно богатые дофаминергических клеток, чтобы позволить последующие исследования. Этот протокол может быть реализован с эмбриональными трансгенных мышей и подходит для иммунофлуоресцентного окрашивания, количественной ПЦР, второй мессенджер количественной оценки, или гибель нейронов / выживания.
Introduction
Допамин, одним из важнейших нейротрансмиттеров мозга 1,2, в основном освобожден от дофаминергических нейронов среднего мозга (DA). Большинство нейронов да находиться в вентральной части среднего мозга 2-6. Схематически среднего мозга нейроны DA можно разделить на три анатомически и функционально различных проекционных систем: mesostriatal, мезолимбической и мезокортикальных пути 2,5. Нигростриатной путь участвует в поведении двигателя, мезолимбическом пути играют важную роль в армирования, мотивации, обучения и, в то время как дофаминергические пути выступающие в префронтальной коры головного мозга вовлечены в познании 2.
DA нейроны участвуют в нескольких неврологических расстройств человека, таких как шизофрения, синдром дефицита внимания, гипер расстройство деятельности, и болезнь Паркинсона (БП) 2,4. PD характеризуется прогрессивным и селективной дегенерации нейронов да соединяющей черной субстанцииPars компакты (SNC) в стриатуме. Потеря Nigro-полосатой да нейронов приводит к серьезному истощению дофамина в полосатом теле, который отвечает из двигательных симптомов БП (брадикинезия, опираясь тремор, и жесткость) 7. Начальное причиной идиопатической БП не было установлено, и в настоящее время лечение только симптоматическое, направленный на восстановление уровня допамина в полосатом теле. Наиболее предписано препарат L-ДОФА (леводопа), естественный предшественник дофамина. Хотя администрация леводопа компенсирует потерю допамина в течение определенного времени, осложнения моторные произойти после длительного лечения (дискинезия и включение / выключение состояния) 8,9.
Исследование дофаминергических нейронов и PD находится в постоянном прогрессии и интенсивные усилия к тому, чтобы развивать процедуры, основанные на трансплантации клеток, генной терапии, или нейропротекторы 10,11. Тем не менее, главной проблемой остается не-выяснено: то, что является причиной крайнего vulnerability из DA нейронов? Часть ответа можно найти в деятельности DA нейронов. Снижение электрической активности и возбудимости нейронов DA-видимому, чтобы увеличить их склонность к вырождению 12. Тем не менее, сложность PD патогенезе требует дальнейших исследований, чтобы определить механизмы, участвующие в DA нейроны дегенерации 13-15.
Первичные культуры особенно актуальны для изучения DA нейронов свойства 16-19 и оспорить эти нейроны в различных напряжений для оценки нейропротекторы 20-24. Модели крысы культуры чаще всего используются, как рассечение эмбриона крысы среднего мозга легче, по сравнению с мышью, и более высокие количества нейронов может быть получена на крысах. Однако поколение трансгенных мышиных моделях болезни 25 значительно возросла заинтересованность невролога сообщества для первичных культур от мыши 26-29. Хотя культур прepared от новорожденных животных можно использовать, лучше подготовить их из эмбрионов на пост-митотического этапе (E13.5 для среднего мозга нейронов), когда нейроны сохранили способности к дифференциации. Следующий протокол представляет изолированные среднего мозга нейроны в первичной культуре от эмбрионов мыши (E13.5), которые наиболее трудно получить. Примечательно, мы предоставляем протокол, используя бессывороточной культуральной среды для лучшего воспроизводимости. Два наиболее важных шагов в подготовке культуры (рассечение и механической диссоциации) будет тщательно описано в соответствующей видео.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол представляет процедуры и реагенты, необходимые для получения первичной культуры нейронов среднего мозга от эмбриональной мыши и процедуры иммунофлюоресценции для выявления дофаминергических нейронов. Критические этапы процедуры являются рассечение эмбрионов и механ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supported by grants from CNRS and INSERM. PM acknowledges support from the Fondation pour la Recherche Médicale en France (Equipe FRM 2009). SC acknowledges support from the Fondation de France.
Materials
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| DMEM 4.5g/L Glucose with L-Glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X), Phenol Red | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
| L-glutamine, 200 mM Solution | Life Technologies | 25030123 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma-Aldrich | D0547 | Powder |
| Laminin – 1 mg/mL in Tris buffered NaCl | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Poly-L-Ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Insulin from porcine pancreas | Sigma-Aldrich | I5523 | |
| apo-Transferrin human | Sigma-Aldrich | T1147 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | Stock solution 1M in water |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Stock solution 2% (w/v) in water |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Paraformaldehyde 16% in water | Electron Microscopy Sciences | RT 15710-S | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Merck Millipore | 106329 | |
| D(+)-Glucose, Monohydrate | Merck Millipore | 4074-2 | |
| Hydrochloric acid – c(HCl) = 1 mol/l (1 N) Titripur | Merck Millipore | 109057 | |
| Sterile water – Aqua B. Braun | Braun | ||
| Ethanol absolute NORMAPUR analytical reagent | VWR | 20821.321 | |
| Sterile Petri Dishes | VWR | 82050-566 | |
| Pasteur pipettes plain glass – Wilhem Ulbrich GdbR. | VWR | 612-2297 | |
| Counting chamber Malassez | VWR | 631-0975 | |
| Serum Acrodisc Syringe Filter with Supor Membrane, Sterile, GF/0.2 µm, 37 mm | PALL Life science | 4525 | |
| Surgical Scissors – Straight, sharp-sharp, 14.5 cm long | Fine Science Tools | 14002-14 | To open the abdominal wall |
| Scissors – Straight, pointed, delicate, 10 cm long | MORIA | 4877A | To open the uterine wall |
| Forceps – Curved, usual, serrated jaws 1 mm | MORIA | 2183 | To manipulate embryos |
| Vannas Scissors – Curved, pointed, 7 mm blades | MORIA | MC50 | To take out the mesencephalon |
| Ultra Fine Forceps – Curved, delicate, 13 cm long | MORIA | 9987 | To remove meninges |
| BD BioCoat Poly-D-Lysine 24-well Multiwell Plates | BD Bioscience | 356414 | |
| BD Falcon 12-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid | BD Bioscience | 353043 | |
| SuperFrost Microscope Slides, Ground edges 90º | MENZEL-GLÄSER | AG00008032E | |
| Precision cover glasses thickness No. 1.5H circular 18 mm Ø | MARIENFELD | 117580 | |
| Polyclonal Rabbit Anti-Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) Antibody | Chemicon Millipore | AB5622 | 1/200 |
| Monoclonal Mouse Anti-Glutamate Decarboxylase (GAD67) Antibody, clone 1G10.2 | Chemicon Millipore | MAB5406 | 1/400 |
| Monoclonal Rat Anti-Dopamine Transporter (DAT) Antibody, clone DAT-Nt | Chemicon Millipore | MAB369 | 1/500 |
| Monoclonal Mouse Anti-5-HT Antibody | 1/8,000 – Generous gift from Yves Charnay (Swizerland, Yves.Charnay@hcuge.ch) | ||
| Goat Serum, New Zealand Origin | Life Technologies | 16210-064 | |
| Alexa Fluor 405 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-31556 | 1/200 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11001 | 1/1000 |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11007 | 1/1000 |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss microscopy | Stemi-2000C | |
| Bunsen Burner FIREBOY | VWR | 451-0136 |
References
- Glowinski, J., Cheramy, A., Romo, R., Barbeito, L. Presynaptic regulation of dopaminergic transmission in the striatum. Cell Mol Neurobiol. 8, 7-17 (1988).
- Iversen, S. D., Iversen, L. L. Dopamine: 50 years in perspective. Trends Neurosci. 30, 188-193 (2007).
- Dahlstroem, A., Fuxe, K. Evidence for the Existence of Monoamine-Containing Neurons in the Central Nervous System I. Demonstration of Monoamines in the Cell Bodies of Brain Stem Neurons. Acta Physiol Scand Suppl. SUPPL. , 231-255 (1964).
- Chinta, S. J., Andersen, J. K. Dopaminergic neurons. Int J Biochem Cell Biol. 37, 942-946 (2005).
- Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
- Hegarty, S. V., Sullivan, A. M., O’Keeffe, G. W. Midbrain dopaminergic neurons: a review of the molecular circuitry that regulates their development. Dev Biol. 379, 123-138 (2013).
- Samii, A., Nutt, J. G., Ransom, B. R. Parkinson’s disease. Lancet. 363, 1783-1793 (2004).
- Santini, E., Heiman, M., Greengard, P., Valjent, E., Fisone, G. Inhibition of mTOR signaling in Parkinson’s disease prevents L-DOPA-induced dyskinesia. Sci Signal. 2, (2009).
- Ohlin, K. E., et al. Vascular endothelial growth factor is upregulated by L-dopa in the parkinsonian brain: implications for the development of dyskinesia. Brain. 134, 2339-2357 (2011).
- Obeso, J. A., et al. Missing pieces in the Parkinson’s disease puzzle. Nat Med. 16, 653-661 (2010).
- Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson’s disease. Sci Transl Med. 4, (2012).
- Michel, P. P., Toulorge, D., Guerreiro, S., Hirsch, E. C. Specific needs of dopamine neurons for stimulation in order to survive: implication for Parkinson disease. FASEB J. 27, 3414-3423 (2013).
- Decressac, M., Volakakis, N., Bjorklund, A., Perlmann, T. NURR1 in Parkinson disease-from pathogenesis to therapeutic potential. Nat Rev Neurol. , (2013).
- Jouve, L., Salin, P., Melon, C., Le Goff, L. K. e. r. k. e. r. i. a. n. -. Deep brain stimulation of the center median-parafascicular complex of the thalamus has efficient anti-parkinsonian action associated with widespread cellular responses in the basal ganglia network in a rat model of Parkinson’s disease. J Neurosci. 30, 9919-9928 (2010).
- Hirsch, E. C., Jenner, P., Przedborski, S. Pathogenesis of Parkinson’s disease. Mov Disord. 28, 24-30 (2013).
- di Porzio, U., Daguet, M. C., Glowinski, J., Prochiantz, A. Effect of striatal cells on in vitro maturation of mesencephalic dopaminergic neurones grown in serum-free conditions. Nature. 288, 370-373 (1980).
- Denis-Donini, S., Glowinski, J., Prochiantz, A. Glial heterogeneity may define the three-dimensional shape of mouse mesencephalic dopaminergic neurones. Nature. 307, 641-643 (1984).
- Barbin, G., Mallat, M., Prochiantz, A. In vitro studies on the maturation of mesencephalic dopaminergic neurons. Dev Neurosci. 7, 296-307 (1985).
- Marey-Semper, I., Gelman, M., Levi-Strauss, M. A selective toxicity toward cultured mesencephalic dopaminergic neurons is induced by the synergistic effects of energetic metabolism impairment and NMDA receptor activation. J Neurosci. 15, 5912-5918 (1995).
- Salthun-Lassalle, B., Hirsch, E. C., Wolfart, J., Ruberg, M., Michel, P. P. Rescue of mesencephalic dopaminergic neurons in culture by low-level stimulation of voltage-gated sodium channels. J Neurosci. 24, 5922-5930 (2004).
- Toulorge, D., et al. Neuroprotection of midbrain dopamine neurons by nicotine is gated by cytoplasmic Ca2. FASEB J. 25, 2563-2573 (2011).
- Rousseau, E., Michel, P. P., Hirsch, E. C. The Iron-Binding Protein Lactoferrin Protects Vulnerable Dopamine Neurons from Degeneration by Preserving Mitochondrial Calcium Homeostasis. Mol Pharmacol. 84, (2013).
- Orme, R. P., Bhangal, M. S., Fricker, R. A. Calcitriol imparts neuroprotection in vitro to midbrain dopaminergic neurons by upregulating GDNF expression. PLoS One. 8 (e62040), (2013).
- Choi, W. S., Kruse, S. E., Palmiter, R. D., Xia, Z. Mitochondrial complex I inhibition is not required for dopaminergic neuron death induced by rotenone, MPP+, or paraquat. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15136-15141 (2008).
- Trancikova, A., Ramonet, D., Moore, D. J. Genetic mouse models of neurodegenerative diseases. Prog Mol Biol Transl Sci. 100, 419-482 (2011).
- Gao, H. M., Liu, B., Zhang, W., Hong, J. S. Critical role of microglial NADPH oxidase-derived free radicals in the in vitro MPTP model of Parkinson’s disease. FASEB J. 17, 1954-1956 (2003).
- Lin, X., et al. Conditional expression of Parkinson’s disease-related mutant alpha-synuclein in the midbrain dopaminergic neurons causes progressive neurodegeneration and degradation of transcription factor nuclear receptor related 1. J Neurosci. 32, 9248-9264 (2012).
- Bye, C. R., Thompson, L. H., Parish, C. L. Birth dating of midbrain dopamine neurons identifies A9 enriched tissue for transplantation into parkinsonian mice. Exp Neurol. 236, 58-68 (2012).
- Ramonet, D., et al. Dopaminergic neuronal loss, reduced neurite complexity and autophagic abnormalities in transgenic mice expressing G2019S mutant LRRK2. PLoS One. 6 (e18568), (2011).
- Prestoz, L., Jaber, M., Gaillard, A. Dopaminergic axon guidance: which makes what. Front Cell Neurosci. 6, (2012).
- Nunes, I., Tovmasian, L. T., Silva, R. M., Burke, R. E., Goff, S. P. Pitx3 is required for development of substantia nigra dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4245-4250 (1073).
- Ferri, A. L., et al. Foxa1 and Foxa2 regulate multiple phases of midbrain dopaminergic neuron development in a dosage-dependent manner. Development. 134, 2761-2769 (2007).
- Rayport, S., et al. Identified postnatal mesolimbic dopamine neurons in culture: morphology and electrophysiology. J Neurosci. 12, 4264-4280 (1992).
- Kim, K. M., Nakajima, S., Nakajima, Y. Dopamine and GABA receptors in cultured substantia nigra neurons: correlation of electrophysiology and immunocytochemistry. Neuroscience. 78, 759-769 (1997).
- Nefzger, C. M., et al. Lmx1a allows context-specific isolation of progenitors of GABAergic or dopaminergic neurons during neural differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells. 30, 1349-1361 (2012).
- Su, H., et al. Immediate expression of Cdh2 is essential for efficient neural differentiation of mouse induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 10, 338-348 (2013).
