Cultivo primario de ratón neuronas dopaminérgicas
Summary
Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson’s disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.
Abstract
Las neuronas dopaminérgicas representan menos del 1% del número total de neuronas en el cerebro. Esta baja cantidad de neuronas regula importantes funciones cerebrales como el control motor, la motivación y la memoria de trabajo. Las neuronas dopaminérgicas nigroestriatal selectivamente degeneran en la enfermedad de Parkinson (PD). Esta pérdida neuronal progresiva está inequívocamente asociada con los síntomas motores de la patología (bradicinesia, temblor en reposo, rigidez muscular y). El principal agente responsable de la degeneración de neuronas dopaminérgicas es aún desconocido. Sin embargo, estas neuronas parecen ser muy vulnerables en diversas condiciones. Los cultivos primarios constituyen uno de los modelos más relevantes para investigar las propiedades y características de las neuronas dopaminérgicas. Estas culturas se pueden enviar a varios agentes de estrés que imitan patología PD y para compuestos neuroprotectores para detener o ralentizar la degeneración neuronal. Los numerosos modelos de ratones transgénicos de PD que han sido generATED durante la última década se incrementó aún más el interés de los investigadores por cultivos de neuronas dopaminérgicas. En este caso, el protocolo de vídeo se centra en la delicada disección de cerebro de ratón embrionarias. La escisión precisa del mesencéfalo ventral es crucial para obtener cultivos neuronales suficientemente ricos en células dopaminérgicas para permitir estudios posteriores. Este protocolo puede ser realizado con ratones transgénicos embrionarias y es adecuado para la tinción de inmunofluorescencia, PCR cuantitativa, la cuantificación segundo mensajero, o la evaluación de la muerte / supervivencia neuronal.
Introduction
La dopamina, uno de los neurotransmisores cerebrales esenciales 1,2, se libera principalmente por dopaminérgicas del cerebro medio (DA), las neuronas. La mayoría de las neuronas DA residen en la parte ventral del mesencéfalo 2-6. Esquemáticamente, las neuronas dopaminérgicas del cerebro medio se pueden dividir en tres anatómica y funcionalmente distintos sistemas de proyección: mesostriatal, mesolímbico y vías mesocorticales 2,5. La vía nigroestriatal está implicado en el comportamiento motor, las vías mesolímbico juegan un papel importante en el refuerzo, la motivación y el aprendizaje, mientras que las vías dopaminérgicas que se proyectan hacia la corteza prefrontal están implicados en la cognición 2.
Neuronas DA están implicados en varios trastornos neurológicos humanos tales como la esquizofrenia, déficit de atención, trastorno de hiperactividad, y la enfermedad de Parkinson (PD) 2,4. PD se caracteriza por una degeneración progresiva y selectiva de las neuronas DA de conexión sustancia negrapars compacta (SNC) a el cuerpo estriado. La pérdida de nigro-estriatal neuronas DA resultados en grave agotamiento de la dopamina en el cuerpo estriado que es responsable de los síntomas motores de la EP (bradicinesia, temblor de reposo, y la rigidez) 7. La causa inicial de la idiopática PD no se ha establecido y los tratamientos actuales sólo son sintomáticos, con el objetivo de restauración del nivel de dopamina en el cuerpo estriado. El fármaco más prescrito es la L-Dopa (Levodopa), el precursor natural de la dopamina. Aunque la administración de levodopa compensa la pérdida de dopamina durante un cierto tiempo, las complicaciones motoras se producen después de los tratamientos a largo plazo (discinesia y estados activado / desactivado) 8,9.
La investigación sobre las neuronas dopaminérgicas y PD está en constante progresión y se están realizando intensos esfuerzos para desarrollar tratamientos basados en el trasplante de células, la terapia génica, o agentes neuroprotectores 10,11. Sin embargo, un problema importante sigue siendo no dilucidado: ¿cuál es la causa de la extrema Vulnerability de neuronas DA? Parte de la respuesta se puede encontrar en la actividad de las neuronas dopaminérgicas. Una reducción en la actividad eléctrica y de la excitabilidad de las neuronas DA parece aumentar su propensión a degenerar 12. Sin embargo, la complejidad de la EP patogénesis requiere más estudios para identificar los mecanismos implicados en la degeneración de neuronas DA 13-15.
Los cultivos primarios son especialmente relevantes para el estudio de las propiedades de las neuronas DA 16-19 y el de impugnar estas neuronas a varios tipos de estrés para la evaluación de agentes neuroprotectores 20-24. Se utilizan más a menudo modelos de cultivo de rata, como la disección de mesencéfalo de embriones de rata es más fácil, en comparación con el ratón, y cantidades más altas de las neuronas se pueden obtener en la rata. Sin embargo, la generación de modelos de ratones transgénicos de la enfermedad 25 ha aumentado considerablemente el interés de la comunidad neurocientífica para cultivos primarios de ratón 26-29. Aunque las culturas prepared de los animales recién nacidos puede ser utilizado, es mejor para prepararlos a partir de embriones en la etapa de post-mitótico (E13.5 para las neuronas de mesencéfalo), cuando las neuronas han conservado su capacidad de diferenciarse. El siguiente protocolo presenta mesencéfalo neuronas aisladas en cultivo primario a partir de embriones de ratón (E13.5), que son los más difíciles de preparar. En particular, se proporciona un protocolo de uso de medio de cultivo libre de suero para una mejor reproducibilidad. Los dos pasos más importantes en la preparación de la cultura (disección y disociación mecánica) se detallan cuidadosamente en el vídeo asociado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo presenta los procedimientos y reactivos necesarios para preparar un cultivo primario de neuronas mesencefálicas desde el ratón embrionario y el procedimiento de inmunofluorescencia para detectar las neuronas dopaminérgicas. Los pasos críticos del procedimiento son la disección de los embriones y la disociación mecánica de los fragmentos del cerebro recogidos. Instrumentos de disección de alta calidad ayuda a dominar la técnica de disección. Neuronas DA constituyen una pequeña proporción de mes…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supported by grants from CNRS and INSERM. PM acknowledges support from the Fondation pour la Recherche Médicale en France (Equipe FRM 2009). SC acknowledges support from the Fondation de France.
Materials
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| DMEM 4.5g/L Glucose with L-Glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X), Phenol Red | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
| L-glutamine, 200 mM Solution | Life Technologies | 25030123 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma-Aldrich | D0547 | Powder |
| Laminin – 1 mg/mL in Tris buffered NaCl | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Poly-L-Ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Insulin from porcine pancreas | Sigma-Aldrich | I5523 | |
| apo-Transferrin human | Sigma-Aldrich | T1147 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | Stock solution 1M in water |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Stock solution 2% (w/v) in water |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Paraformaldehyde 16% in water | Electron Microscopy Sciences | RT 15710-S | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Merck Millipore | 106329 | |
| D(+)-Glucose, Monohydrate | Merck Millipore | 4074-2 | |
| Hydrochloric acid – c(HCl) = 1 mol/l (1 N) Titripur | Merck Millipore | 109057 | |
| Sterile water – Aqua B. Braun | Braun | ||
| Ethanol absolute NORMAPUR analytical reagent | VWR | 20821.321 | |
| Sterile Petri Dishes | VWR | 82050-566 | |
| Pasteur pipettes plain glass – Wilhem Ulbrich GdbR. | VWR | 612-2297 | |
| Counting chamber Malassez | VWR | 631-0975 | |
| Serum Acrodisc Syringe Filter with Supor Membrane, Sterile, GF/0.2 µm, 37 mm | PALL Life science | 4525 | |
| Surgical Scissors – Straight, sharp-sharp, 14.5 cm long | Fine Science Tools | 14002-14 | To open the abdominal wall |
| Scissors – Straight, pointed, delicate, 10 cm long | MORIA | 4877A | To open the uterine wall |
| Forceps – Curved, usual, serrated jaws 1 mm | MORIA | 2183 | To manipulate embryos |
| Vannas Scissors – Curved, pointed, 7 mm blades | MORIA | MC50 | To take out the mesencephalon |
| Ultra Fine Forceps – Curved, delicate, 13 cm long | MORIA | 9987 | To remove meninges |
| BD BioCoat Poly-D-Lysine 24-well Multiwell Plates | BD Bioscience | 356414 | |
| BD Falcon 12-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid | BD Bioscience | 353043 | |
| SuperFrost Microscope Slides, Ground edges 90º | MENZEL-GLÄSER | AG00008032E | |
| Precision cover glasses thickness No. 1.5H circular 18 mm Ø | MARIENFELD | 117580 | |
| Polyclonal Rabbit Anti-Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) Antibody | Chemicon Millipore | AB5622 | 1/200 |
| Monoclonal Mouse Anti-Glutamate Decarboxylase (GAD67) Antibody, clone 1G10.2 | Chemicon Millipore | MAB5406 | 1/400 |
| Monoclonal Rat Anti-Dopamine Transporter (DAT) Antibody, clone DAT-Nt | Chemicon Millipore | MAB369 | 1/500 |
| Monoclonal Mouse Anti-5-HT Antibody | 1/8,000 – Generous gift from Yves Charnay (Swizerland, Yves.Charnay@hcuge.ch) | ||
| Goat Serum, New Zealand Origin | Life Technologies | 16210-064 | |
| Alexa Fluor 405 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-31556 | 1/200 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11001 | 1/1000 |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11007 | 1/1000 |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss microscopy | Stemi-2000C | |
| Bunsen Burner FIREBOY | VWR | 451-0136 |
References
- Glowinski, J., Cheramy, A., Romo, R., Barbeito, L. Presynaptic regulation of dopaminergic transmission in the striatum. Cell Mol Neurobiol. 8, 7-17 (1988).
- Iversen, S. D., Iversen, L. L. Dopamine: 50 years in perspective. Trends Neurosci. 30, 188-193 (2007).
- Dahlstroem, A., Fuxe, K. Evidence for the Existence of Monoamine-Containing Neurons in the Central Nervous System I. Demonstration of Monoamines in the Cell Bodies of Brain Stem Neurons. Acta Physiol Scand Suppl. SUPPL. , 231-255 (1964).
- Chinta, S. J., Andersen, J. K. Dopaminergic neurons. Int J Biochem Cell Biol. 37, 942-946 (2005).
- Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
- Hegarty, S. V., Sullivan, A. M., O’Keeffe, G. W. Midbrain dopaminergic neurons: a review of the molecular circuitry that regulates their development. Dev Biol. 379, 123-138 (2013).
- Samii, A., Nutt, J. G., Ransom, B. R. Parkinson’s disease. Lancet. 363, 1783-1793 (2004).
- Santini, E., Heiman, M., Greengard, P., Valjent, E., Fisone, G. Inhibition of mTOR signaling in Parkinson’s disease prevents L-DOPA-induced dyskinesia. Sci Signal. 2, (2009).
- Ohlin, K. E., et al. Vascular endothelial growth factor is upregulated by L-dopa in the parkinsonian brain: implications for the development of dyskinesia. Brain. 134, 2339-2357 (2011).
- Obeso, J. A., et al. Missing pieces in the Parkinson’s disease puzzle. Nat Med. 16, 653-661 (2010).
- Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson’s disease. Sci Transl Med. 4, (2012).
- Michel, P. P., Toulorge, D., Guerreiro, S., Hirsch, E. C. Specific needs of dopamine neurons for stimulation in order to survive: implication for Parkinson disease. FASEB J. 27, 3414-3423 (2013).
- Decressac, M., Volakakis, N., Bjorklund, A., Perlmann, T. NURR1 in Parkinson disease-from pathogenesis to therapeutic potential. Nat Rev Neurol. , (2013).
- Jouve, L., Salin, P., Melon, C., Le Goff, L. K. e. r. k. e. r. i. a. n. -. Deep brain stimulation of the center median-parafascicular complex of the thalamus has efficient anti-parkinsonian action associated with widespread cellular responses in the basal ganglia network in a rat model of Parkinson’s disease. J Neurosci. 30, 9919-9928 (2010).
- Hirsch, E. C., Jenner, P., Przedborski, S. Pathogenesis of Parkinson’s disease. Mov Disord. 28, 24-30 (2013).
- di Porzio, U., Daguet, M. C., Glowinski, J., Prochiantz, A. Effect of striatal cells on in vitro maturation of mesencephalic dopaminergic neurones grown in serum-free conditions. Nature. 288, 370-373 (1980).
- Denis-Donini, S., Glowinski, J., Prochiantz, A. Glial heterogeneity may define the three-dimensional shape of mouse mesencephalic dopaminergic neurones. Nature. 307, 641-643 (1984).
- Barbin, G., Mallat, M., Prochiantz, A. In vitro studies on the maturation of mesencephalic dopaminergic neurons. Dev Neurosci. 7, 296-307 (1985).
- Marey-Semper, I., Gelman, M., Levi-Strauss, M. A selective toxicity toward cultured mesencephalic dopaminergic neurons is induced by the synergistic effects of energetic metabolism impairment and NMDA receptor activation. J Neurosci. 15, 5912-5918 (1995).
- Salthun-Lassalle, B., Hirsch, E. C., Wolfart, J., Ruberg, M., Michel, P. P. Rescue of mesencephalic dopaminergic neurons in culture by low-level stimulation of voltage-gated sodium channels. J Neurosci. 24, 5922-5930 (2004).
- Toulorge, D., et al. Neuroprotection of midbrain dopamine neurons by nicotine is gated by cytoplasmic Ca2. FASEB J. 25, 2563-2573 (2011).
- Rousseau, E., Michel, P. P., Hirsch, E. C. The Iron-Binding Protein Lactoferrin Protects Vulnerable Dopamine Neurons from Degeneration by Preserving Mitochondrial Calcium Homeostasis. Mol Pharmacol. 84, (2013).
- Orme, R. P., Bhangal, M. S., Fricker, R. A. Calcitriol imparts neuroprotection in vitro to midbrain dopaminergic neurons by upregulating GDNF expression. PLoS One. 8 (e62040), (2013).
- Choi, W. S., Kruse, S. E., Palmiter, R. D., Xia, Z. Mitochondrial complex I inhibition is not required for dopaminergic neuron death induced by rotenone, MPP+, or paraquat. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15136-15141 (2008).
- Trancikova, A., Ramonet, D., Moore, D. J. Genetic mouse models of neurodegenerative diseases. Prog Mol Biol Transl Sci. 100, 419-482 (2011).
- Gao, H. M., Liu, B., Zhang, W., Hong, J. S. Critical role of microglial NADPH oxidase-derived free radicals in the in vitro MPTP model of Parkinson’s disease. FASEB J. 17, 1954-1956 (2003).
- Lin, X., et al. Conditional expression of Parkinson’s disease-related mutant alpha-synuclein in the midbrain dopaminergic neurons causes progressive neurodegeneration and degradation of transcription factor nuclear receptor related 1. J Neurosci. 32, 9248-9264 (2012).
- Bye, C. R., Thompson, L. H., Parish, C. L. Birth dating of midbrain dopamine neurons identifies A9 enriched tissue for transplantation into parkinsonian mice. Exp Neurol. 236, 58-68 (2012).
- Ramonet, D., et al. Dopaminergic neuronal loss, reduced neurite complexity and autophagic abnormalities in transgenic mice expressing G2019S mutant LRRK2. PLoS One. 6 (e18568), (2011).
- Prestoz, L., Jaber, M., Gaillard, A. Dopaminergic axon guidance: which makes what. Front Cell Neurosci. 6, (2012).
- Nunes, I., Tovmasian, L. T., Silva, R. M., Burke, R. E., Goff, S. P. Pitx3 is required for development of substantia nigra dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4245-4250 (1073).
- Ferri, A. L., et al. Foxa1 and Foxa2 regulate multiple phases of midbrain dopaminergic neuron development in a dosage-dependent manner. Development. 134, 2761-2769 (2007).
- Rayport, S., et al. Identified postnatal mesolimbic dopamine neurons in culture: morphology and electrophysiology. J Neurosci. 12, 4264-4280 (1992).
- Kim, K. M., Nakajima, S., Nakajima, Y. Dopamine and GABA receptors in cultured substantia nigra neurons: correlation of electrophysiology and immunocytochemistry. Neuroscience. 78, 759-769 (1997).
- Nefzger, C. M., et al. Lmx1a allows context-specific isolation of progenitors of GABAergic or dopaminergic neurons during neural differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells. 30, 1349-1361 (2012).
- Su, H., et al. Immediate expression of Cdh2 is essential for efficient neural differentiation of mouse induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 10, 338-348 (2013).
